Diferenciação de células-tronco nervosas por um One-Step Plasma atmosférico frio tratamento In Vitro

Resumo

Este protocolo visa proporcionar detalhadas etapas experimentais de um tratamento de plasma frio atmosférico sobre células-tronco neurais e detecção de imunofluorescência para aprimoramento de diferenciação.

Resumo

Como o desenvolvimento da tecnologia da física de plasma, TVs de plasma atmosféricos frios (CAPs) têm sido amplamente investigados na descontaminação, tratamento de câncer, cicatrização de feridas, tratamento de canal, etc., formar um novo campo de pesquisa chamado medicina de plasma. Sendo uma mistura de espécies reactivas elétricas, químicas e biológicas, CAPs mostraram suas habilidades para aumentar a diferenciação de células-tronco nervosas ambos em vitro e in vivo e está se tornando um caminho promissor para o tratamento de doença neurológica no futuro. A notícia mais emocionante é que usando tampões pode realizar uma etapa e com segurança dirigido, diferenciação de células-tronco neurais (NSCs) para transporte de tecido. Demonstramos aqui o protocolo experimental pormenorizado de usando um dispositivo de jato CAP self-made para reforçar a diferenciação de NSC em C17.2-NSCs e células-tronco neurais rato primário, bem como observar o destino da célula por invertido e microscopia de fluorescência. Com a ajuda de mancha tecnologia, encontramos ambas as NSCs mostrou um ritmo acelerado de diferenciais que o grupo não tratado, e ~ 75% das NSCs seletivamente diferenciadas em neurônios, que são principalmente maduro, colinérgicos e motor neurônios.

Introdução

A diferenciação dirigida de NSCs em uma certa linhagem para o transporte de tecido é considerada uma das mais promissoras terapias de doenças neurodegenerativas e neurotraumatic¹. Por exemplo, os neurônios dopaminérgicos de catecolaminérgica são especialmente desejados no tratamento da doença de Parkinson (PD). No entanto, os métodos tradicionais para preparar as células desejadas para transporte tem muitos inconvenientes, tais como toxicidade química, formação de cicatriz ou outros, o que dificulta em grande parte as aplicações de NSCs em medicina regenerativa². Portanto, é muito necessário encontrar uma maneira segura e romance para diferenciação de NSC.

Plasma é o quarto estado da matéria, seguir sólido, líquido e gás, e constitui mais de 95% das matérias em todo o universo. Plasma é eletricamente neutro com positivo/negativo não acoplado e partículas neutras e geralmente é gerado por uma descarga de alta voltagem no laboratório. Nas últimas duas décadas, a aplicação do plasma em biomedicina tem atraído grande atenção no mundo, como o desenvolvimento da tecnologia de plasma frio pressão atmosférica. Graças a esta técnica, plasma de baixa temperatura estável pode ser gerado no ar circundante na atmosfera sem formação de arco e consiste de várias espécies reativas, como espécies reativas de nitrogênio (RNS), espécies reativas de oxigênio (ROS), ultravioleta (UV) radiação, elétrons, íons e campo elétrico³. CAPs têm vantagens exclusivas para inativação de microrganismos, terapia do câncer, tratamento de doenças de pele, proliferação celular e diferenciação de célula^4,5,6,7, cicatrização de feridas. Em trabalho anterior, demonstrámos que jato de plasma atmosférico frio pode realçar a diferenciação de NSCs em células-tronco neurais murino C17.2 (C17.2-NSCs) e células-tronco neurais rato primário, exibindo um grande potencial para se tornar uma ferramenta poderosa para a direção diferenciação de NSCs⁸. Embora o mecanismo de aprimoramento da CAP de diferenciação NSC não é totalmente compreendido ainda, não gerado pelo CAPs tem sido provado ser um fator chave no processo. Neste trabalho, nosso objetivo é fornecer um protocolo experimental pormenorizado do uso de um plasma de hélio/oxigênio pressão atmosférica jato para o tratamento da NSCs in vitro, preparação da pilha e pré-tratamento, observação de morfologia pelo microscópio invertido, e Observação de microscopia de fluorescência da mancha da imunofluorescência.

Protocolo

1. culturas e Predifferentiation de pilha

1. Predifferentiation e cultura de células-tronco neurais
   1. Prepare as lamelas de poli-D-lisina-revestido. Colocar uma lamínula estéril (20 mm de diâmetro) em uma placa de 12. Cubra o tampa de vidro com poli-D-lisina, 0,1% w/v, em água (Tabela de materiais) para uma melhor aderência da célula sobre as lamelas, seguindo os próximos passos.
      Nota: Condições ideais devem ser determinadas para cada linhagem celular e aplicativo.
      1. Assepticamente revesti a superfície da lamela com poli-D-lisina, 0,1% w/v, na água. Rocha suavemente para garantir um mesmo revestimento da superfície da lamela.
      2. Depois de cultivo durante a noite (~ 12 h) a 37 ° C, retirar a solução D-poli-lisina e enxaguar a superfície 3 x com 1 mL de água estéril.
      3. Seque a células pelo menos 30 min antes da semeadura-los.
2. Predifferentiation e cultura de células-tronco neurais murino C17.2 (C17.2-NSC)
   1. Incube C17.2-NSCs num balão de² 25 cm no meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 5% de soro de cavalo (HS) e 1% penicilina/estreptomicina em 37 ° C e 5% CO₂ para d ~ 2-3.
   2. Quando as células chegam a confluência de 85%, remover o meio, lavar as células com 1 mL de PBS e adicione 1 mL de tripsina fresca (0,25%) para o balão. Deixe-o por 1 min; em seguida, adicione 1 mL de meio de cultura para o balão e a pipeta subindo e descendo várias vezes para assegurar uma suspensão de célula única.
   3. Conte a densidade das células em suspensão usando um hemocytometer. Calcule o volume necessário de suspensão de células para dar uma concentração celular final de 2 x 10⁴ células/mL.
   4. Semente do C17.2-NSCs sobre as lamelas revestidas na placa de 12 com a densidade de ~ 2 x 10⁴ células por poço. Verifique a densidade celular sob um microscópio.
      Nota: Para um melhor resultado, a densidade celular ideal deve ser determinada antes do experimento de imunofluorescência.
   5. Incube as células a 37 ° C numa incubadora de célula para 12 h permitir a fixação.
   6. Após a fixação, lavar as células 2 x com 1 mL de PBS e cultivar as células com o meio de diferenciação, composto por DMEM/F12 com suplemento 1% N2 para 48 h antes do tratamento de plasma.
3. Predifferentiation e cultura de células-tronco neurais de rato primário
   1. Cultura da suspensão primária rato NSC em meio de crescimento rato NSC em frascos de T25 não revestidos em uma densidade de 5 x 10⁵ células.
      Nota: O rato primário NSCs foram isoladas seguindo o protocolo de Xie et al . ⁹.
   2. Verifica a formação de neurospheres sob um microscópio invertido. Certifique-se que a morfologia do neurospheres exibe complexos multicelulares esféricos e transparentes.
   3. Quando os neurospheres atingir um diâmetro de 3 mm ou maiores, transferir a suspensão de neurosphere para um tubo de centrífuga estéril 15 mL e deixe os neurospheres resolver pela gravidade.
   4. Remova o sobrenadante cuidadosamente para deixar o neurospheres em um volume mínimo de meio.
   5. Enxágue o neurospheres 1 x 5 ml de PBS e deixar os neurospheres resolver pela gravidade. Remova o sobrenadante para deixar um volume mínimo de PBS.
   6. Adicione um volume adequado de meio de diferenciação para ajustar a densidade celular para ~ 12-15 neurospheres por mililitro. O meio de diferenciação primária rato NSCs é composto por DMEM/F12, 2% B27 e 1% FBS.
   7. Semente de 1 mL de suspensão de neurosphere em cada lamela revestida na placa de 12.
      Nota: Agite a placa com cuidado para assegurar que os neurospheres são distribuídos uniformemente. Esta etapa é fundamental para um melhor resultado de imunofluorescência.
   8. Coloque a placa na incubadora e permitir que predifferentiate por 24 h antes do tratamento de plasma.

2. preparação do Plasma jatos

1. Escolha um tubo de quartzo semi-aberto com diâmetro interno de 2 mm e diâmetro externo de 4 mm... colocar um fio de alta tensão com um diâmetro de 2 mm no tubo.
2. Inserir o tubo de quartzo com o fio de alta tensão em uma seringa de 5 mL e usar um suporte para montá-la dentro do centro da seringa. Defina a distância entre a extremidade selada do tubo de quartzo e a ponta da seringa a 1 cm.
3. Conectar um tubo de borracha de silicone de 1 m (com um diâmetro interno de 12 mm) para a extremidade aberta da seringa e, em seguida, conectá-lo à válvula do medidor de vazão e gás em sequência.

3. aquisição dos jatos

1. Ligue o circuito conforme mostrado na Figura 1. Ligue o fio de saída da fonte de alimentação para o dispositivo de jato de plasma e, em seguida, conecte a ponta da sonda alta tensão com o fio de saída para detectar a tensão. Conecte a outra extremidade da sonda alta tensão para o osciloscópio para gravar as informações da tensão de saída. Verifique o circuito inteiro e certifique-se de que fonte de alimentação, osciloscópio e a sonda de alta tensão são todos de castigo.
2. Verifique a linha de gás. Certifique-se de que o tubo de gás foi conectado ao dispositivo de jato de plasma; em seguida, abra a válvula de gás do hélio (fração de volume, 99.999%) e oxigênio (fração de volume, 99.999%) e definir o fluxo de gás para 1 L:0.01 L/min (: O₂).
   Nota: Deixe o fluxo de gás por vários minutos antes de ligar a fonte de alimentação, pela primeira vez.
3. Definir a largura de pulso, frequência e amplitude de pulso como 8 kV, 8kHz e ns 1600, respectivamente. Verifique o circuito novamente e, em seguida, ligue o botão de saída para criar um jato de plasma.
   Cuidado: Não toque no fio de alta tensão a qualquer momento.

4. plasma tratamento de células-tronco neurais

1. Defina a distância entre o bico da seringa e o buraco bem célula a 15 mm.
   Nota: A distância é medida do fundo da plataforma onde a placa de 12 é colocada.
2. Pegar a placa de 12 fora da incubadora e alterar o meio das células predifferentiated para 800 µ l de meio fresco de diferenciação.
3. Dividir as células em três grupos: um grupo controle não tratado, um 60 s-e-O₂ (% 1) gás fluxo tratamento do grupo e um grupo de tratamento de plasma s 60.
   Nota: Não há nenhuma perda líquida óbvia sob a condição de tratamento.
4. Colocar a placa de 12 poços sob os jatos de plasma, certifique-se de que o bico da seringa é fixo no centro de cada furo e dar o tratamento para os diferentes grupos mencionados no passo 4.3.
   Nota: Os controles não tratados foram mantidos em meio de diferenciação à temperatura ambiente durante o procedimento experimental para garantir condições de tratamento uniforme. Grupo de tratamento do fluxo de gás de₂ (1%)-e-O foi tratado com apenas um ele e O fluxo de gás₂ (1%), sem geração de plasma. Todos os tratamentos devem ser executados em triplicado.

5. diferenciação de células-tronco neural

1. Após o tratamento, remover a cultura original e adicionar 1 mL de meio de diferenciação de novo a cada poço.
2. Incube as celulas na incubadora a 37 ° C e 5% de CO₂ para 6 m. mudar o meio de todos os outros dias.
3. Verificar o status de diferenciação dos diferentes grupos diariamente sob um microscópio de contraste de fase invertida. Aleatoriamente, selecione pelo menos 12 campos e tirar fotos para gravar as alterações morfológicas.

6. mancha da imunofluorescência

1. Enxaguar
   1. Leve as amostras fora da incubadora da célula e remova o meio por aspiração. Enxagúe as células 1 x com 1 mL de PBS.
      Nota: Após a diferenciação, as células são facilmente destacadas. É necessário adicionar a PBS do lado dos poços de cultura para evitar lavar as células.
2. Fixação
   1. Fixe as células com 500 µ l de paraformaldeído 4% por 20 min em temperatura ambiente. Após a fixação, lave suavemente as células 3 x com 1 mL de PBS, 5 min cada, para remover o paraformaldeído 4% residual.
      Nota: O ponto de tempo ideal para fixação da pilha deve ser determinado de acordo com os tipos de célula. Após a fixação, adicionar 1 mL de PBS do lado dos poços de cultura e deixar a amostra na mesa por 5 min. Não utilize um agitador de laboratório, para garantir uma mínima perda de células.
3. Permeabilização
   1. Permeabilize as amostras com 0,2% TritonX-100 em PBS por 10 minutos em temperatura ambiente. Após a permeabilização, enxague as células delicadamente com 1 mL de PBS por três vezes, 5 min cada.
      Nota: O ponto de tempo ideal para permeabilização celular deve ser determinado de acordo com os tipos de células. Após a permeabilização, adicionar 1 mL PBS do lado dos poços de cultura, deixa a amostra na mesa por 5 min. Não utilize um agitador de laboratório para garantir a mínima perda de células.
4. Bloqueio
   1. Adicionar 1 mL de soro de cabra de 10% em PBS para cada amostra e deixar a amostra na mesa por 1h bloquear quaisquer interacções inespecíficas.
      Nota: Não utilize um agitador de laboratório, para impedir que as células desanexação de slide. Um enxágue não é necessário nesta etapa.
5. Incubação com o anticorpo primário
   1. Dilua o anticorpo primário usando tampão de diluição do anticorpo primário.
      Nota: Para obter melhores resultados, a razão de diluição final do anticorpo primário deve ser determinada pelo pré-teste. As proporções de diluição de anti-Nestin (para células-tronco indiferenciadas), anti-β-tubulina III (para o neurônio), anti-ChAT (para os neurônios colinérgicos), anti-LHX3 (para os neurônios motores), anti-GABA (para anti-O4 (para oligodendrocyte), anti-NF200 (para neurônios maduros) Os neurônios gabaérgica), antiserotonina (para neurônios serotoninérgicos) e anti-TH (para os neurônios dopaminérgicos) são 1:80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200 e 1: 100, respectivamente.
   2. Aplica 300 µ l de anticorpos primários diluídos amostras diferentes.
   3. Incubar as amostras de células durante a noite a 4 ° C.
      Nota: Recomenda-se incubar os anticorpos primários a 4 ° C para reduzir o fundo e a coloração não específica.
   4. Remover os anticorpos primários e lave delicadamente as células 3 x com 1 mL de PBS.
6. Incubação com anticorpo secundário
   1. Dilua os anticorpos secundários conjugados Cy3 ou Alexa Fluor 488-conjugados usando 3% de soro de cabra em PBS.
      Nota: Para obter melhores resultados, a razão de diluição final do anticorpo secundário deve ser determinada pelo pré-teste.
   2. Aplica 300 µ l de anticorpos secundários relevantes para detectar cada anticorpo primário.
      Nota: Todas as etapas subsequentes precisam ser executada no escuro para evitar a têmpera de fluorescência.
   3. Incube a amostra de célula no escuro por 2 h à temperatura ambiente.
   4. Remova os anticorpos secundários e enxágue as células delicadamente com 1 mL de PBS por 10 minutos em temperatura ambiente.
7. Coloração nuclear
   1. Aplica 500 µ l de solução de trabalho de Hoechst 33258 imergir a amostra de células.
   2. Incube a amostra de célula no escuro durante 8 min à temperatura ambiente para rotular os núcleos.
   3. Lave delicadamente as células 3 x com 1 mL de PBS, 10 min cada, protegido da luz.
      Nota: Para uma mínima perda de células, a condição ideal de lavagem deve ser determinada empiricamente.
8. Montagem
   1. Coloque uma gota de meio de montagem no centro do microslide.
   2. Tire as lamelas (com exemplos), usando uma pinça e coloque cuidadosamente a amostra em cima do meio de montagem. Evite bolhas de ar.
   3. Remova qualquer meio de montagem em excesso com papel absorvente.
9. Observação de microscopia de fluorescência
   1. Observe as amostras sob a microscopia de fluorescência, equipado com filtros para Hoechst 33258, Alexa Fluor 488 e Cy3. Para cada amostra, selecione aleatoriamente pelo menos 8-12 campos e gravar imagens com uma câmera.

Resultados

Morfologia celular foi observada ao microscópio invertido todos os dias após o tratamento do CAP. A Figura 2 mostra as imagens do microscópio óptico comum de contraste de fase invertida da diferenciação celular em ambas as linhas de célula. O grupo tratados com plasma apresenta uma taxa acelerada diferenciação e uma relação de elevada diferenciação em relação ao grupo de fluxo de controle e gás.

Discussão

C17.2-NSCs é um tipo de células-tronco neurais imortalizado linha de células de rato neonatal cerebelar camada granulosa, desenvolvida por Snyder e outros^10,11. C17.2-NSCs podem se diferenciar em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos e são amplamente utilizados em neurociência¹². Em nosso estudo anterior, CAPs poderiam reforçar a diferenciação de C17.2-NSCs em neurônios. Um prova de princípio também realizou estudo usando ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip	NEST	801008
Poly-D-lysine	Beyotime	P0128
DMEM medium	HyClone	SH30022.01B	stored at 4 °C
DMEM/F12 medium	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
N2 supplement	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement	Gibco	17504044	stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum	HyClone	SH30074.03	tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
Trypsin	HyClone	25300054	stored at 4 °C
PBS solution	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
TritonX-100	Sigma	T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20	stored at 4 °C
anti-Nestin	Beyotime	AF2215	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III	Sigma Aldrich	T2200	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4	R&D Systems	MAB1326	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG
12-well plate	corning	3512
25 cm2 flask	corning	430639
Hoechst 33258	Beyotime	C1018	stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium	Beyotime	P0128	stored at -20 °C and protect from light
Light microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics Company	XD-202
Fluorescence microscopy	Nikon	80i
High – voltage Power Amplifier	Directed Energy	PVX-4110
DC power supply	Spellman	SL1200
Function Generator	Aligent	33521A
Oscilloscope	Tektronix	DPO3034
High voltage probe	Tektronix	P6015A