Différenciation des cellules souches nerveuses par un traitement d’un Plasma atmosphérique froid en une seule étape d' In Vitro

Résumé

Ce protocole vise à fournir une procédure expérimentale détaillée d’un traitement plasma atmosphérique froid sur les cellules souches neurales et détection par immunofluorescence pour l’amélioration de la différenciation.

Résumé

Comme le développement de la technologie plasma physique, plasmas atmosphériques froids (CAPs) ont été largement étudiées dans la décontamination, le traitement du cancer, la cicatrisation des plaies, traitement de canal, etc., formant un nouveau champ de recherche nommé plasma médecine. Est un mélange d’espèces réactives électriques, chimiques et biologiques, casquettes ont montré leurs capacités à améliorer la différenciation des cellules souches nerveuses les deux in vitro et in vivo et sont devenant une voie prometteuse pour le traitement des maladies neurologiques dans l’avenir. Les nouvelles beaucoup plus excitants sont qu’utilisant des amorces à peut réaliser en une seule étape et en toute sécurité réalisé, différenciation des cellules souches neurales (CNS) pour le transport du tissu. Nous montrons ici le protocole expérimental détaillé d’utilisant un dispositif de CAP jet fait par soi-même afin d’améliorer la différenciation NSC C17.2-CNS et primaires de rats des cellules souches neurales, ainsi qu’observant le sort de la cellule par inversé et microscopie de fluorescence. Avec l’aide d’immunofluorescence souillant la technologie, nous avons trouvé les deux les CNS ont montré un taux de prime accéléré que le groupe non traité, et ~ 75 % des CNS sélectivement différencient en neurones, qui sont principalement des adultes, cholinergiques et moteur neurones.

Introduction

La différenciation dirigée des CNS en une certaine lignée pour le transport de tissus est considérée comme une des thérapies plus prometteuses de maladies neurodégénératives et Alhzeimer¹. Par exemple, les neurones dopaminergiques catécholaminergiques sont particulièrement souhaitées dans le traitement de la maladie de Parkinson (MP). Cependant, les méthodes traditionnelles pour préparer les cellules souhaitées pour le transport ont beaucoup d’inconvénients, tels que la toxicité chimique, la formation de cicatrices ou autres, qui empêche en grande partie les demandes des CNS en médecine régénérative². Par conséquent, il est très nécessaire de trouver un roman et un moyen sûr pour la différentiation de la NSC.

Le plasma est le quatrième état de la matière, suivant solides, liquides et gaz, et elle constitue plus de 95 % des affaires dans l’univers tout entier. Plasma est électriquement neutre avec non consolidé positif/négatif et de particules neutres et est généralement générée par une décharge haute tension en laboratoire. Dans les deux dernières décennies, l’application du plasma en biomédecine a attiré l’attention énorme dans le monde entier comme le développement de la technologie du plasma froid la pression atmosphérique. Grâce à cette technique, plasma à basse température stable peut être générée dans l’air ambiant à l’atmosphère sans formation de l’arc et se compose de diverses espèces réactives, comme les espèces réactives de l’azote (RNS), espèces réactives de l’oxygène (ROS), aux ultraviolets (UV) rayonnement, électrons, ions et champ électrique³. Casquettes ont des avantages uniques pour l’inactivation des micro-organismes, le traitement du cancer, la cicatrisation, traitement des maladies de la peau, la prolifération cellulaire et cellules différenciation^4,5,6,7. Dans un travail antérieur, nous avons démontré que jet de plasma atmosphérique froid peut améliorer la différenciation des CNS dans les cellules souches neurales murin C17.2 (C17.2-CNS) tant primaires de rats des cellules souches neurales, présentant un grand potentiel pour devenir un outil puissant pour le réalisé différenciation des CNS⁸. Bien que le mécanisme de mise en valeur de CAP de la différenciation du NSC n’est pas entièrement compris encore, NO généré par CAPs a été prouvé d’être un facteur clé dans le processus. Dans ce travail, nous visons à fournir un plan expérimental détaillé de l’utilisation d’un plasma d’hélium/oxygène pression atmosphérique jet pour le traitement des CNS en vitro, préparation de cellules et prétraitement, observation de la morphologie par microscope inversé, et observation de microscopie par fluorescence d’immunofluorescence souillant.

Protocole

1. cell Cultures et Predifferentiation

1. Predifferentiation et la culture de cellules souches neurales
   1. Préparer les lamelles de poly-D-lysine-enduit. Mettre une lamelle stérile (20 mm de diamètre) dans une plaque de 12 puits. Recouvrir le couvercle en verre avec poly-D-lysine, 0,1 % p/v, dans l’eau (Table des matières) pour une meilleure adhérence de la cellule sur le couvre-objet en suivant les étapes suivantes.
      Remarque : Des conditions optimales doivent être déterminées pour chaque ligne de la cellule et la demande.
      1. Aseptiquement recouvrir la surface de la lamelle avec poly-D-lysine, 0,1 % p/v, dans l’eau. Rocher doucement pour assurer une couche uniforme de la surface de la lamelle couvre-objet.
      2. Après mise en culture pendant la nuit (~ 12 h) à 37 ° C, enlever la solution de poly-D-lysine et rincer la surface 3 x avec 1 mL d’eau stérile.
      3. Sécher les cellules au moins 30 min avant de les semer.
2. Predifferentiation et des cellules souches neurales C17.2 (C17.2-NSC) culture
   1. Incuber C17.2-CNS dans un ballon jaugé de 25 cm² au moyen de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 5 % de sérum de cheval (HS) et 1 % la pénicilline/streptomycine à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant environ 2-3 jours.
   2. Lorsque les cellules atteignent 85 % confluence, retirez le support, laver les cellules avec 1 mL de PBS et ajouter 1 mL de trypsine fraîche (0,25 %) dans le ballon. Laissez-le pendant 1 minute ; Ensuite, ajouter 1 mL de milieu de culture à la fiole et la pipette de monter et descendre plusieurs fois pour assurer une suspension monocellulaire.
   3. Compter la densité des cellules de la suspension à l’aide d’un hémocytomètre. Calculer le volume requis de suspension cellulaire pour donner une concentration finale de cellule de 2 x 10⁴ cellules/mL.
   4. Semences C17.2-CNS sur les lamelles couché dans la plaque de 12 puits avec la densité de ~ 2 x 10⁴ cellules par puits. Vérifiez la densité des cellules au microscope.
      Remarque : Pour un meilleur résultat, la densité cellulaire optimale doit être déterminée avant l’expérience de l’immunofluorescence.
   5. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à cellules pendant 12 h permettant l’attachement.
   6. Après fixation, laver les cellules 2 x 1 ml de PBS et cultiver les cellules avec un moyen de différenciation consistant en DMEM/F12 avec supplément de 1 % N2 pendant 48 h avant le traitement du plasma.
3. Predifferentiation et la culture de cellules souches neurales primaires de rat
   1. Culture de la suspension des primaires de rat NSC dans le milieu de croissance du rat NSC dans des flacons de T25 non couchés à une densité de 5 x 10⁵ cellules.
      Remarque : La CNS primaires de rat ont été isolées suivant le protocole du Xie et al. ⁹.
   2. Vérifier la formation des neurospheres sous un microscope inversé. Veillez à ce que la morphologie de le neurospheres des pièces complexes multicellulaires sphériques et transparents.
   3. Lorsque les neurospheres atteindre un diamètre de 3 mm ou plus, transférer la suspension neurosphère dans un tube de centrifugation stérile de 15 mL et laisser les neurospheres s’installent par gravité.
   4. Retirez le surnageant soigneusement afin de laisser le neurospheres dans un volume minimal de support.
   5. Rincer les neurospheres 1 x 5 ml de PBS et laissez les neurospheres régler par gravité. Retirez le surnageant pour laisser un volume minimal de PBS.
   6. Ajouter un volume approprié de différenciation support pour ajuster la densité cellulaire à environ 12-15 neurospheres par millilitre. Le moyen de différenciation pour les primaires de rat CNS se compose de DMEM/F12, 2 % B27 et 1 % FBS.
   7. 1 mL de suspension neurosphère sur chaque lamelle couché dans la plaque de 12 puits de graines.
      NOTE : Secouer la plaque doucement pour faire en sorte que les neurospheres sont réparties uniformément. Cette étape est essentielle pour un meilleur résultat d’immunofluorescence.
   8. Placer la plaque dans l’incubateur et permettez-lui de predifferentiate pendant 24 h avant le traitement du plasma.

2. préparation des Jets de Plasma

1. Choisir un tube de quartz semi-ouverte avec un diamètre intérieur de 2 mm et un diamètre extérieur de 4 mm. insérer un fil de haute tension avec un diamètre de 2 mm dans le tube.
2. Insérez le tube de quartz d’un câble de haute tension dans une seringue de 5 mL et utilisez un support pour le monter à l’intérieur du centre de la seringue. Définir la distance entre l’extrémité scellée du tube quartz et l’embout de la seringue à 1 cm.
3. Raccorder un tuyau de caoutchouc de silicone de 1 m (avec un diamètre intérieur de 12 mm) à l’extrémité ouverte de la seringue et, ensuite, connectez-le à la valve du débitmètre et du gaz dans l’ordre.

3. acquisition des Jets

1. Raccordez le circuit tel qu’illustré à la Figure 1. Connectez le fil de sortie de l’alimentation à l’appareil de jet de plasma et, ensuite, connectez l’extrémité de la sonde haute tension avec le fil de sortie pour détecter la tension. Connectez l’autre extrémité de la sonde haute tension à l’oscilloscope pour enregistrer les informations de la tension de sortie. Vérifiez le circuit entier et assurez-vous que l’alimentation, l’oscilloscope et la sonde haute tension sont tous mis à la terre.
2. Contrôler la conduite de gaz. Assurez-vous que le tube de gaz a été connecté à l’appareil de jet de plasma ; Ensuite, ouvrez le robinet de gaz de l’hélium (fraction volumique, 99,999 %) et l’oxygène (fraction volumique, 99,999 %) et régler le débit de gaz de 1 L:0.01 L/min (He : O₂).
   Remarque : Laissez le débit de gaz pendant plusieurs minutes avant d’allumer l’alimentation électrique pour la première fois.
3. Définir l’amplitude de l’impulsion, la fréquence et largeur d’impulsion comme 8 kV, 8 kHz et ns 1600, respectivement. Contrôler le circuit de nouveau et puis, mettez le bouton de sortie pour créer un jet de plasma.
   Attention : Ne pas toucher le fil haute tension à tout moment.

4. plasma traitement des cellules souches neurales

1. Définir la distance entre l’embout de la seringue et le trou bien cellule à 15 mm.
   Remarque : La distance est mesurée à partir du bas de la plate-forme où se trouve la plaque de 12 puits.
2. Prendre la plaque de 12 puits hors de l’incubateur et changer le support des cellules predifferentiated à 800 µL de milieu frais de différenciation.
3. Diviser les cellules en trois groupes : un groupe témoin non traité, un groupe de traitement en flux 60 s He-et-O₂ (1 %) gaz et un groupe de traitement plasma s 60.
   Remarque : Il n’y a aucune perte de liquide évidente en vertu de la condition de traitement.
4. Placer la plaque de 12 puits sous les jets de plasma, assurez-vous que l’embout de la seringue est fixé au centre de chaque trou et donner le traitement pour les différents groupes mentionnés à l’étape 4.3.
   Remarque : Les témoins non traités étaient gardés dans moyen de différenciation à température ambiante pendant la procédure expérimentale pour assurer un traitement uniforme des conditions. Le groupe de traitement débit gaz He-et-O₂ (1 %) a été traité avec seulement un il et le débit de gaz O₂ (1 %), sans génération d’un plasma. Tous les traitements doivent être effectuées en trois exemplaires.

5. neural Stem Cell Differentiation

1. Après le traitement, retirer la culture d’origine et ajouter 1 mL de milieu de différenciation nouvelle à chaque puits.
2. Incuber les cellules dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO₂ pour 6 d. changer le support de tous les autres jours.
3. Vérifier l’état de différenciation des différents groupes tous les jours sous un microscope optique à contraste de phase inversé. Au hasard, sélectionnez au moins 12 champs et prendre des photos pour enregistrer les modifications morphologiques.

6. immunofluorescence souillant

1. Rinçage
   1. Effectue les prélèvements hors de l’incubateur de cellules et enlever le support par aspiration. Rincer les cellules 1 x 1 ml de PBS.
      Remarque : Après la différenciation, les cellules sont détachent facilement. Il est nécessaire d’ajouter le PBS du côté des puits de culture afin d’éviter de laver les cellules.
2. Fixation
   1. Fixer les cellules avec 500 µL de paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 min à température ambiante. Après fixation, rincer doucement les cellules 3 x 1 ml de PBS, 5 min chacun, pour enlever la paraformaldéhyde résiduelle de 4 %.
      Remarque : Le moment optimal pour la fixation de la cellule doit être déterminée selon les types de cellules. Après fixation, ajouter 1 mL de PBS du côté des puits de culture et de laisser l’échantillon sur la table pendant 5 min. N’utilisez pas un agitateur lab, pour assurer une perte minimale de cellules.
3. Perméabilisation
   1. Permeabilize les échantillons avec 0,2 % TritonX-100 en PBS pendant 10 min à température ambiante. Après perméabilisation, rincer les cellules doucement avec 1 mL de PBS de trois fois, 5 min chacun.
      Remarque : Le point de temps optimal de perméabilisation de la cellule doit être déterminé selon les types de cellules. Après perméabilisation, ajouter 1 mL de PBS du côté des puits de culture, laisser l’échantillon sur la table pendant 5 min. N’utilisez pas un agitateur de laboratoire pour assurer la perte minimale des cellules.
4. Blocage
   1. Ajouter 1 mL de sérum de chèvre de 10 % dans du PBS à chaque échantillon et laisser l’échantillon sur la table pendant 1 h à bloquer les interactions non spécifiques.
      Remarque : N’utilisez pas un agitateur lab, pour empêcher les cellules de détacher de la diapositive. Un rinçage n’est pas nécessaire dans cette étape.
5. Incubation avec l’anticorps primaire
   1. Diluer l’anticorps primaire à l’aide du tampon de dilution de l’anticorps primaire.
      Remarque : Pour des résultats optimaux, le coefficient de dilution finale de l’anticorps primaire doit être déterminé par prétest. Le taux de dilution de l’anti-Nestin (pour les cellules souches indifférenciées), anti-β-tubuline III (pour le neurone), anti-chat (pour les neurones cholinergiques), anti-LHX3 (pour les neurones moteurs), anti-GABA (pour anti-O4 (pour les oligodendrocytes), anti-NF200 (pour les neurones matures) Les neurones GABAergiques), anti-sérotoninergique (pour les neurones sérotoninergiques) et anti-TH (pour les neurones dopaminergiques) sont respectivement de 1 : 80, 1 : 200, au 1/100, 1/100, 1/100, 1 : 200, 1/100, 1 : 200 et 1/100.
   2. S’applique à 300 µL d’anticorps primaires dilués aux différents échantillons.
   3. Incuber les échantillons de cellules durant la nuit à 4 ° C.
      Remarque : Il est recommandé pour l’incubation des anticorps primaires à 4 ° C pour réduire le fond et la coloration non spécifique.
   4. Retirer les anticorps primaires et rincer doucement les cellules 3 x 1 ml de PBS.
6. Incubation avec l’anticorps secondaire
   1. Diluer les anticorps secondaires conjugué Cy3 ou conjugué Alexa Fluor 488 à l’aide de sérum de chèvre de 3 % dans du PBS.
      Remarque : Pour des résultats optimaux, le coefficient de dilution finale de l’anticorps secondaire doit être déterminé par prétest.
   2. Appliquer 300 µL d’anticorps secondaires pertinents pour détecter chaque anticorps primaire.
      Remarque : Toutes les étapes subséquentes ont besoin sera effectué dans l’obscurité afin d’empêcher l’extinction de la fluorescence.
   3. Incuber l’échantillon cellulaire dans l’obscurité pendant 2 h à température ambiante.
   4. Retirer les anticorps secondaires et rincer les cellules doucement avec 1 mL de PBS pendant 10 min à température ambiante.
7. La coloration des noyaux
   1. Appliquer 500 µL de solution de travail Hoechst 33258 de plonger l’échantillon cellulaire.
   2. Incuber l’échantillon cellulaire dans l’obscurité pendant 8 min à température ambiante pour étiqueter les noyaux.
   3. Rincer doucement les cellules 3 x 1 ml de PBS, 10 min chacun, abri de la lumière.
      Remarque : Pour une perte minimale de cellules, la condition de lavage optimale doit être déterminée empiriquement.
8. Montage
   1. Déposer une goutte de milieu de montage dans le centre de la micro-lames.
   2. Sortir les lamelles couvre-objet (avec exemples) à l’aide de la pince à épiler et positionner avec soin l’échantillon sur le dessus du milieu de montage. Éviter les bulles d’air.
   3. Supprimer n’importe quel milieu de montage excédentaire avec du papier absorbant.
9. Observation de la microscopie de fluorescence
   1. Observer les échantillons en vertu de la microscopie à fluorescence équipé de filtres pour Hoechst 33258 et Alexa Fluor 488 Cy3. Pour chaque échantillon, choisir au hasard au moins 8-12 champs et enregistrer des images avec un appareil photo.

Résultats

La morphologie cellulaire a été observée au microscope inversé tous les jours après le traitement de la CAP. Figure 2 montre les images de microscopie ordinaire inversé à contraste de phase de la différenciation cellulaire dans les deux lignées cellulaires. Le groupe imprégnées de plasma expose un taux de différentiation accélérée et un taux élevé de différenciation comparée au groupe contrôle et gaz flux.

Discussion

C17.2-CNS est une sorte de ligne immortalisé les cellules souches neurales de cellules de souris néonatales couche granuleuse cérébelleuse, développé par Snyder et d’autres^10,11. C17.2-CNS peuvent se différencier en neurones, astrocytes et oligodendrocytes et sont largement utilisés dans les neurosciences¹². Dans notre étude précédente, casquettes pourraient favoriser la différenciation des C17.2-CNS en neurones. Une étude d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coverslip	NEST	801008
Poly-D-lysine	Beyotime	P0128
DMEM medium	HyClone	SH30022.01B	stored at 4 °C
DMEM/F12 medium	HyClone	SH30023.01B	stored at 4 °C
N2 supplement	Gibco	17502048	stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement	Gibco	17504044	stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum	HyClone	SH30084.03	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum	HyClone	SH30074.03	tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin	HyClone	SV30010	stored at 4 °C
Trypsin	HyClone	25300054	stored at 4 °C
PBS solution	HyClone	SH30256.01B	stored at 4 °C
4% paraformaldehyde	Beyotime	P0098	stored at -20 °C
TritonX-100	Sigma	T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution	Vector Laboratories	S-1000-20	stored at 4 °C
anti-Nestin	Beyotime	AF2215	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III	Sigma Aldrich	T2200	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4	R&D Systems	MAB1326	stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA	Sigma		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH	Abcam, Cambridge, MA		stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer	Beyotime	P0103	stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG	Beyotime	A0516	stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat	Beyotime	A0428	stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG
12-well plate	corning	3512
25 cm2 flask	corning	430639
Hoechst 33258	Beyotime	C1018	stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium	Beyotime	P0128	stored at -20 °C and protect from light
Light microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics Company	XD-202
Fluorescence microscopy	Nikon	80i
High – voltage Power Amplifier	Directed Energy	PVX-4110
DC power supply	Spellman	SL1200
Function Generator	Aligent	33521A
Oscilloscope	Tektronix	DPO3034
High voltage probe	Tektronix	P6015A