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Resumen

Proteínas estructuralmente relacionadas con frecuencia ejercen distintas funciones biológicas. El intercambio de equivalentes regiones de estas proteínas para crear proteínas quiméricas constituye un enfoque innovador para identificar las regiones de la proteína crítica que son responsables de su divergencia funcional.

Resumen

El objetivo de este protocolo comprende el diseño de proteínas quiméricas en la que distintas regiones de una proteína son sustituidas por sus correspondientes secuencias de una proteína estructural similar, con el fin de determinar la importancia funcional de estas regiones. Tales quimeras se generan mediante un protocolo PCR anidado utilizando fragmentos de DNA traslapados y adecuadamente diseñado cartillas, seguidos de su expresión dentro de un sistema mamífero nativo estructura secundaria y modificaciones post-traduccionales.

El papel funcional de una región distinta entonces indica una pérdida de actividad de la quimera en un ensayo de lectura apropiado. En consecuencia, se identifican las regiones albergando un conjunto de aminoácidos esenciales, que pueden ser defendidos por técnicas complementarias (por ejemplo, mutagénesis sitio-dirigida) para aumentar la resolución molecular. Aunque limitada a los casos en que se encuentra una proteína estructuralmente relacionada con diferentes funciones, las proteínas quiméricas han sido empleadas con éxito para identificar las regiones de Unión críticos en proteínas como receptores de citoquinas y citoquinas. Este método está especialmente indicado en casos en que las regiones funcionales de la proteína no están bien definidas y constituye un valioso primer paso en enfoques de evolución dirigida a reducir las regiones de interés y reducir el esfuerzo de investigación involucrado.

Introducción

Varios tipos de proteínas, incluyendo citoquinas y factores de crecimiento, se agrupan en familias cuyos miembros comparten estructuras tridimensionales similares pero a menudo ejercen distintas funciones biológicas1,2. Esta diversidad funcional suele ser la consecuencia de pequeñas diferencias en la composición de aminoácidos dentro de sitios activos3 de la molécula. Identificación de dichos sitios y determinantes funcionales no sólo ofrece valiosa información evolutiva sino también para el diseño de los agonistas e inhibidores más específicos4. Sin embargo, el gran número de diferencias en la composición del residuo encontrado con frecuencia entre proteínas estructuralmente relacionadas complica esta tarea. A pesar de construir grandes bibliotecas que contienen cientos de mutantes hoy en día es factibles, evaluar cada variación de solo residuos y combinaciones de ellos sigue siendo un esfuerzo difícil y desperdiciador de tiempo5.

Técnicas de evaluación de la importancia funcional de las regiones de la proteína grande son así de valor para reducir el número de posibles residuos a un número manejable6. Proteínas truncadas han sido el enfoque más utilizado para abordar este asunto. En consecuencia, las regiones se consideran funcionalmente relevante si la función de la proteína bajo estudio es afectada por la eliminación de una región particular7,8,9. Sin embargo, una limitación importante de este método es que deleciones pueden afectar a la estructura secundaria de la proteína, llevando a mal plegamiento, la agregación y la imposibilidad de estudiar la región prevista. Un buen ejemplo es una versión truncada de la citoquina Oncostatina M (OSM), en el que una canceladura interna más grande de 7 residuos dio lugar a un mutante mal plegado que no podía ser más había estudiado10.

La generación de proteínas quiméricas constituye un enfoque alternativo e innovador que permite el análisis de regiones más grandes de proteína. El objetivo de este método es para el intercambio de regiones de interés en una proteína por secuencias estructuralmente relacionadas de otra proteína, con el fin de evaluar la contribución de las secciones sustituyó a funciones biológicas específicas. Ampliamente utilizado en el campo de la señalización de receptores para identificar dominios funcionales11,12, proteínas quiméricas son particularmente útiles para el estudio de familias de proteínas con poca identidad del aminoácido pero conservada estructura secundaria. Apropiado pueden encontrarse ejemplos en la clase de interleucina 6 (IL-6) tipo citoquinas, tales como interleukin-6 y ciliary neurotrophic factor (identidad de secuencia de 6%)13 o leucemia factor inhibitorio (LIF) y OSM (20% identidad)6, en la que el siguiendo el protocolo se basa.

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Protocolo

1. diseño de proteínas quimérico

  1. Seleccione una proteína adecuada (donante) para el intercambio de regiones con la proteína de interés (destinatario) la proteína del donante debe ser estructuralmente similar, idealmente pertenecientes a la misma familia de proteínas, pero falta la actividad biológica para ser utilizado como lectura. Si no se conocen proteínas estructuralmente relacionadas, candidatos potenciales pueden ser identificados mediante una herramienta automatizada como la herramienta de búsqueda de alineación de Vector (VAST)14,15
    1. Acceder a la web Europea de banco de datos de la proteína (PDB)16 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), introducir el nombre de la proteína de interés en el cuadro de búsqueda en la esquina superior derecha y haga clic en 'Buscar'. Siempre que hay una estructura cristalina, no por el identificador PDB (PDB ID; por ejemplo, 1evs de OSM).
      Nota: Si no hay datos estructurales en el PDB, un modelo de la homología de la proteína puede generar una herramienta como Suiza-modelo17 en cambio, usando protocolos disponibles paso a paso18.
    2. Acceder a la extensa página web (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). En el caso de un PDB ID está disponible, desplácese hacia abajo hasta la sección 'Recuperar resultados previamente computados' imput el PDB ID en la casilla de 'Mostrar las estructuras similares para' y haga clic en 'Go'. En la siguiente pantalla, haga clic en 'Original gran' y luego 'Cadena' para ver una lista de identificadores de PDB para potenciales candidatos estructuralmente similares.
      1. Si un identificador PDB no está disponible, pero se generó un modelo de la homología, desplácese hacia abajo hasta la sección 'Búsqueda de una nueva estructura' y haga clic en el enlace 'Buscar gran'. Subir el archivo PDB del modelo haciendo clic en 'Examinar' junto a 'Archivo de PDB presentar', seleccionando el archivo y haga clic en 'Enviar'.
      2. Después el PDB archivo cargado, haga clic en el botón 'Start' para iniciar el gran cálculo. Una vez realizado el cálculo, haga clic en 'Cadena' bajo dominios para ver los identificadores de PDB de proteínas estructuralmente similares.
    3. Evaluar las funciones biológicas de interés (por ejemplo, la activación del receptor, actividad enzimática, actividad de factor de transcripción) de los principales candidatos, ya sea experimentalmente en el sistema de lectura de elección o a través de una búsqueda de literatura. Seleccione una proteína de donantes con función divergente con respecto a la proteína de interés.
  2. Obtener las secuencias de aminoácidos de proteínas de las proteínas de receptor y donante de la base de datos de secuencia de referencia (RefSeq)19 .
    1. La sección del gene en la Página Web de RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), escriba el nombre de la proteína de interés en el cuadro Buscar y haga clic en 'Buscar'. Haga clic en el nombre del gene de la especie deseada en la lista resultante.
    2. Desplácese hacia abajo hasta la sección RefSeq ver isoformas todo documentado. Haga clic en el identificador de secuencia para el isoform de interés (a partir de NM), desplácese hacia abajo y haga clic en 'CDs' para resaltar la región codificante de la proteína del gene. En la parte inferior derecha de la pantalla, haga clic en 'FASTA' y copia la secuencia del gene.
    3. Guardar la secuencia de ADN utilizando un software de edición de ADN adecuado. Cuando se utiliza el mono libremente disponible20, abrir el programa, pegar la secuencia de copiado en el cuadro en blanco, seleccione el nombre de secuencia y haga clic en 'Guardar'.
      Nota: Repita los pasos 1.2.1. a 1.2.3. para el uno o más donantes proteínas seleccionadas.
  3. Elija las regiones de la proteína a ser sustituido en las diferentes construcciones quiméricas.
    1. Dividir la secuencia de la proteína de interés en distintas regiones estructurales. Idealmente, diferentes dominios de la proteína en cuestión habrá sido descritos en la literatura. Si este no es el caso, debe evaluarse la existencia de distintas características estructurales conservadas (espirales, bucles) en pasos 1.3.1.1. a 1.3.1.4.
      1. Descargar los datos estructurales de la proteína de interés desde la web PDB (vea el paso 1.1.1.). Acceder a la página PDB para la proteína y descargar el archivo PDB haciendo clic en 'descargar' en el lado derecho de la pantalla.
      2. Abra el archivo PDB en un sistema de visualización molecular como PyMOL (https://pymol.org/). En PyMOL, Mostrar la secuencia de nucleótidos (haciendo clic en Mostrar > en la secuencia), ocultar los datos estructurales de predeterminado (clic en H junto a la identificación de PDB y seleccionando 'todo') y seleccione la vista de 'dibujos animados' visualizar claramente estructural de la proteína características (clic en la S junto a la identificación de PDB y seleccionando 'dibujos animados').
      3. Haga clic en la secuencia de nucleótidos en la parte superior de la pantalla para resaltar diferentes partes de la molécula, anotando los aminoácidos correspondientes a cada característica estructural distintiva.
    2. Anotar las distintas regiones estructurales en la secuencia de ADN en mono. Para ello, abra la secuencia de ADN de paso 1.2.3., seleccione los nucleótidos codifican para los aminoácidos en una región, haga clic derecho sobre la selección y elija 'Novedad' para darle un nombre y un color. Repita el proceso para cada región estructural identificado en el paso anterior.
      Nota: La selección del nucleótido puede ser verificados por duplicado pinchando ORFs > traducir, luego hacer clic en aceptar, para que el código para la secuencia del aminoácido correcto.
    3. Alinear las secuencias de residuos de las dos proteínas empleando una herramienta de alineación de la proteína (e.g. Clustal Omega21).
      Nota: Puesto que las quimeras que se producirá en un sistema de expresión mamífero, estas secuencias deben incluir péptidos de señal de las proteínas.
      1. Obtener las secuencias de aminoácido completo de donante y receptor proteínas en mono, con la apertura de las secuencias de ADN de paso 1.2.3., seleccionándolos y haciendo clic en ORFs > traducir.
      2. Acceder a la Página Web de Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) y llave de entrada las secuencias de aminoácidos de las dos proteínas, a continuación, desplácese hacia abajo y haga clic en 'Enviar'. Cada secuencia debe fortificar por una línea de texto con ' > ProteinName' a identificarse correctamente...
      3. Recuperar el archivo de alineación haciendo clic en la pestaña 'Descargar archivo de alineación' y guárdelo. Este archivo puede ser abierto por cualquier programa de edición de texto.
      4. Utilizando el archivo de alineación como una referencia, anotar las correspondientes regiones estructurales de la proteína del donante en su secuencia de ADN (ver paso 1.3.2.).
    4. Decidir qué regiones de la proteína de intercambio en las proteínas quiméricas y diseñar las secuencias de nucleótido apropiado para las quimeras.
      Nota: En ausencia de información detallada con respecto a la importancia funcional de las diferentes regiones, se sugiere para seleccionar grandes sustituciones como todas bucles o espirales para evaluar cuál de ellas tienen un impacto en función de la proteína. Este primer experimento exploratorio luego seguida de una segunda ronda de diseño de la proteína quimérica, que se centró en sustituciones más pequeñas dentro de las regiones relevantes.
      1. Crear una copia de la secuencia de ADN anotada de la proteína del receptor del paso 1.3.2. y como una proteína quimérica. Abra la secuencia de ADN retitulada en mono, seleccionar y eliminar la codificación de secuencia de nucleótidos de la región a intercambiar y sustituirlo por la región correspondiente en la proteína del donante (copiada de la secuencia anotada creada en el punto 1.3.3.), luego guardar los cambios.
        Nota: Crear una copia nueva y repita este paso para cada diferente quimera diseñado.

2. preparación para la clonación Molecular

  1. Seleccionar un vector plásmido adecuado para el sistema de expresión de la opción. Para la expresión mamífero, se recomienda un vector de expresión de alta como pCAGGS22 o la serie de vectores pcDNA.
    1. Para la enzima de la restricción clonación basada en este protocolo, garantizar que los sitios de restricción únicos presentes en el sitio de clonación múltiple (MCS) del vector son compatibles con la proteína de interés. Para ello, abra la secuencia de ADN de las construcciones quiméricas con mono, haga clic en ' enzimas > selector de enzima ' y comprobar que al menos dos de los sitios de restricción en los MCS están ausente en la secuencia (mostrando un cero al lado de su nombre).
  2. Diseño de los cebadores terminal usando un editor de ADN como mono.
    1. Crear un nuevo archivo de ADN (archivo > nuevo) e iniciar el primer N-terminal con una secuencia líder (3-9 extras pares de bases, por ejemplo, AAAGGGAAA), seguido por el primer sitio de restricción seleccionado en MCS del vector (6-8 pares de bases, por ejemplo, TTAATTAA para PacI), un espaciador opcional (por ejemplo GCTAGCGCATCGCCACC en el vector de pCAGGS utilizado en el ejemplo) y los inicial 18-27 pares de bases del gen de interés (e.g. ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG de OSM).
    2. En un nuevo archivo de ADN, la secuencia de primer terminal C comienza con el final de 18-27 pares de bases del gen de interés (e.g. CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA para un gen con una etiqueta de C-terminal de 6xHistidine), seguidos por un espaciador opcional (por ejemplo, TAGCGGCCGC en el vector de pCAGGS), la segunda restricción del sitio escogido (por ejemplo GGCGCGCC ASCI) y una secuencia de líder (p. ej. AAAGGGAAA). Destacar toda la secuencia, haga clic derecho y seleccionar 'Reverse-complemento' para obtener la cartilla reversa.
  3. Diseño de cebadores para cada una de las regiones de frontera en las construcciones quiméricas.
    1. Abra la secuencia de ADN de la quimera (creada en el paso 1.3.4.1.) y resaltar una región de 30 pares en la zona donde las secuencias insertadas y originales están en contacto, que comprende 15 pares de bases de cada secuencia. Copia la región (clic derecho y seleccione 'Copiar') y pégalo en un nuevo archivo de ADN; Esta secuencia será el primer avance.
    2. Hacer una copia de la cartilla avance generada en el anterior paso y renombrarlo como cartilla reversa. Resalte la secuencia de la cartilla, haga clic derecho y seleccionar 'Reverse-complemento' para generar la secuencia de cebador reverso.
    3. Repita los pasos 2.3.1. y 2.3.2. para cada zona de contacto en la secuencia de ADN quimérica. Por lo general, dos juegos de cartillas de avance/retroceso deben generar una quimera, a menos que la sustitución se produce en la N-terminal o c-terminal regiones.
  4. Ordenar los cebadores internos y terminales de un proveedor de síntesis de oligonucleótidos.
    Notas: Uso altamente purificada cartillas terminal (por ejemplo, purificadas por HPLC) puede tener un impacto positivo en la tasa de éxito del protocolo. Iniciadores internos desaladas generalmente proporcionan buenos resultados.
  5. Obtención de secuencias de la plantilla de los genes del donante y del receptor.
    Nota: Empleando plásmidos que contienen los marcos de lectura abierta (ORFs) de estas secuencias como una plantilla considerablemente facilita el procedimiento y se recomienda. Alternativamente, DNA complementaria (cDNA) generado a partir de una línea celular conocida para expresar estos genes puede utilizarse como una plantilla para realizar los siguientes pasos.

3. polimerasa reacción en cadena (PCR) amplificación de los fragmentos de ADN individuales formando la quimera

  1. Preparar una mezcla de reacción PCR individual para cada uno de los fragmentos que componen la proteína quimérica. Una proteína quimérica típico requerirá tres fragmentos individuales: la parte N-terminal y la región a insertarse la parte C-terminal.
    Notas: Utilice una polimerasa de la DNA (por ejemplo polimerasa de la DNA de Phusion alta fidelidad) de alta fidelidad para evitar la introducción de mutaciones en la secuencia. La reacción de PCR se puede configurar en la noche y correr durante la noche.
    1. Conjunto una microcentrífuga de 1.5 mL tubo con hielo y pipetear los reactivos diferentes de las mezclas PCR en el orden indicado en la tabla 1, asegurar correcta cartillas y se utilizan plantillas para cada reacción de PCR (ver cuadro 2).
    2. Etiqueta dos tubos PCR de 0,2 mL de pared delgada para cada reacción y transferencia 20 μl de la mezcla correspondiente de PCR en cada tubo. Transferir los tubos PCR en un termociclador PCR e iniciar el protocolo detallado en la tabla 3.
      Nota: temperatura de recocido debe ser por lo menos 5 grados más bajo que la temperatura de fusión de los cebadores diseñados.
  2. Mientras que la PCR está en ejecución, preparar 100 mL de un gel de agarosa al 1% en tampón acetato-Tris-EDTA (TAE). Para ello, pesar 1 g de agarosa, mezclar con 100 mL de buffer TAE en un frasco de vidrio y microondas hasta que la agarosa se disuelva completamente, girando el frasco cada 30-40 segundos. Permitir una refrigeración a aproximadamente 50 ° C, agregar 2-3 μl de bromuro de etidio (o un tinte de ADN equivalente) y vierta en una bandeja de gel con los peines bien deseados.
    PRECAUCIÓN: bromuro de etidio es un mutágeno conocido, asegúrese de que el uso de equipo de protección adecuado.
  3. Una vez finalizada la reacción de PCR, añadir 4 μL de buffer de carga 6 x ADN en cada tubo. Inserte el gel de agarosa al 1% en una unidad de electroforesis, cubrir con el almacenador intermediario TAE y cuidadosamente cargar las muestras en el gel junto con una escalera de peso molecular.
    Nota: en el momento de la carga, es preferible dejar carriles vacíos entre las muestras para facilitar la recuperación de ADN luego.
  4. Correr el gel a 80-120 V durante 20-45 minutos.
    Nota: bandas bajo 1.000 pares de bases generalmente ser electrophoresed en alrededor de 20 minutos a 120 V, mientras bandas más grandes requieren tiempos más largos.
  5. Apagar el aparato de electroforesis, sacar el gel de agarosa y visualizar las bandas amplificadas de ADN bajo luz UV. Usando una cuchilla de afeitar, cortar los fragmentos de ADN individuales del gel y transferirlas a tubos de microcentrífuga de etiquetado 2 mL.
    Nota: Reducir al mínimo el tiempo de exposición a los rayos UV para evitar daños en el ADN.
  6. Utilice un limpiar el PCR kit (véase Tabla de materiales) para purificar los diferentes fragmentos de ADN.
    1. Añadir 500 μl del buffer NTI proporcionado por el kit a cada tubo que contiene un fragmento de gel. Transferir a un Termomezcladores a 50-55 ° C y agitación a 1000 rpm hasta que el gel se disuelve completamente en el búfer.
    2. Cada solución de transferencia a una columna de etiquetado kit, girar en una microcentrífuga (30-60, 11.000 x g) y deseche el flujo. Añadir 700 μl de tampón de lavado del kit NT3, centrifugar nuevamente bajo la misma configuración y desechar el flujo. Centrifugue las columnas nuevamente por 1-2 minutos a 11.000 x g para secar la membrana de silicona dentro de la columna.
    3. Transfiera la columna a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL etiquetado, pipeta 30 μl de agua libre de nucleasas en la columna, dejar reposar durante 1 minuto y centrifugar 30-60s a 11.000 x g a fin de eluir el ADN.
  7. Cuantificar la cantidad de ADN recuperado mediante la medición de la absorbancia de la muestra a 260 nm y 340 nm en un espectrofotómetro (véase Tabla de materiales). La concentración de ADN se calcula restando la lectura 340 nm la figura nm 260, luego multiplicando el resultado por extinción coeficiente (50 μg/mL)23 de ADN.
    Notas: Mediciones adicionales a 230 nm y 280 nm permite para la evaluación de la pureza de la DNA: 260/280 y 260/230 ratios por encima de 1.8 se miran generalmente como puro ADN. El protocolo puede hacer una pausa después de este paso, almacenar el ADN eluído a 4 ° C (corto plazo) o -20 ° C (largo plazo).

4. PCR amplificación para generar la secuencia de ADN quimérico

  1. Establecer 50 μl de reacción de PCR a los componentes separados de la quimera. Siga los mismos pasos detallados en el punto 3.1, empleando los cebadores N-terminal y c-terminal junto con 10 ng de cada uno de lo ADN de fragmentos obtenidos en paso 3.7.
    Nota: La reacción de PCR se puede establecer en la noche y correr durante la noche.
  2. Repita los pasos del 3.2 a 3.7 para recuperar y cuantificar el fragmento de DNA purificado en 30 μl de agua libre de nucleasa. Este fragmento contiene la secuencia de ADN quimérica, flanqueada por los sitios de restricción en los iniciadores de la terminal.

5. inserción de la DNA quimérica en un Vector de expresión

  1. Etiqueta dos tubos del microfuge de 1,5 mL y pipetear los reactivos diferentes en el orden indicados en la tabla 4, añadiendo 1 μg de la expresión seleccionada vector en un tubo y 1 μg del fragmento de ADN recuperado en el otro. Incubar durante 1-4 h a 37 ° C para realizar la digestión con las enzimas de restricción solicitadas.
    Notas: Asegúrese de que ambas enzimas de restricción son compatibles con el tampón empleado. En caso de necesitan completamente diferentes buffers, realice estos pasos primero con una sola de las enzimas y repita. El tiempo necesario para la digestión puede variar dependiendo de las enzimas de restricción seleccionadas: Consulte las instrucciones del fabricante para obtener información detallada.
  2. Repita los pasos 3.2 a 3.7 para purificar y recuperar la digerida ADN fragmento y expresión el vector en 30 μl de agua libre de nucleasa. Cuantificar la cantidad de ADN recuperado como antes.
  3. Calcular la cantidad de ADN de insertar para una relación molar 3:1 inserto vector en la reacción de la ligadura, utilizando la siguiente ecuación.

    Insertar (ng) = fracción Molar * Vector (ng) * Insertar tamaño (bp) / tamaño de Vector (bp)

    Nota: Relaciones molares diferentes inserto vector pueden probarse, aunque generalmente una proporción de 3:1 es suficiente para obtener resultados adecuados.
  4. Establecer 20 μl de una reacción de la ligadura en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con 40 ng de la expresión vector la cantidad de ADN quimérico calculado en el paso 5.3, buffer y T4 ADN ligasa siguiendo el orden indicado en la tabla 5e incubar toda la noche a 16 ° C.
    Nota: Ligadura eficiencia generalmente se incrementa mediante la realización de la reacción durante la noche a 16 ° C, pero también la reacción puede ser incubada durante 2 h a temperatura ambiente.
  5. Transformación de 5-10 μl de la mezcla de ligadura en químicamente competentes de Escherichia coli (e. coli) preparado siguiendo protocolos estándar24 crece en placas de selección y escoja colonias solo para expansión y plásmido ADN aislamiento según protocolos establecidos25.
    Nota: Para este protocolo se empleó la cepa de e. coli XL1-Blue, pero también pueden utilizarse otras variantes de e. coli .
  6. 1 μg plásmidos aislada con las enzimas de restricción apropiadas siguiendo las instrucciones en el paso 5.1 y evaluar la presencia de una banda de ADN de un tamaño correspondiente a la secuencia quimérica por electroforesis en un gel de agarosa (ver pasos 3.2-3.5).
    Nota: Se recomienda que la secuencia insertada es verificada por medio de un servicio de secuenciación de ADN.
  7. Previa verificación de la secuencia exitosa, la plásmidos pueden ser producida en grandes cantidades y empleada en un sistema de expresión mamífero por siguientes protocolos bien establecidos26,27.

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Resultados

Construcción y la generación de una proteína quimérica (figura 1) se ejemplifica con dos miembros de la familia del cytokine interleukin-6, OSM y LIF, que fueron objeto de un estudio publicado recientemente6. La figura 2 muestra la estructura tridimensional de estas proteínas. Ambas moléculas adoptan la estructura secundaria característica de clase que citoquinas, con cuatro hélices (llamados A D) ...

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Discusión

La generación de proteínas quiméricas constituye una técnica versátil, que puede ir más allá de los límites de proteínas truncadas a abordar cuestiones tales como la modularidad del receptor del cytokine enlace dominios13. El diseño de quimeras es un paso clave en este tipo de estudios y requiere una cuidadosa consideración. Estudios preliminares para establecer dominios funcionales generalmente requiere sustitución de amplias regiones en una primera fase, mientras que los reemplazos m...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la sociedad Max Planck y la clínica Schüchtermann (Bad Rothenfelde, Alemania). Parte de esta investigación fue publicado originalmente en el Journal of Biological Chemistry. Adrian Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. El lazo del AB y D-hélice en sitio obligatorio III de humano Oncostatina M (OSM) se requieren para la activación del receptor OSM. J Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © los autores.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Labcycler thermocyclerSensoquest011-103Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol
NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometerThermoFisher ScientificND-2000C DNA quantification
GeneRuler 100 bp DNA ladderThermoFisher ScientificSM0241
GeneRuler DNA Ladder MixThermoFisher ScientificSM0331
AscI restriction enzymeNew England BiolabsR0558
PacI restriction enzymeNew England BiolabsR0547
Phusion Hot Start II DNA PolymeraseThermoFisher ScientificF-549S
dNTP set (100 mM)Invitrogen10297018
T4 DNA ligasePromegaM1804
NucleoSpin Gel and PCR clean-up kitMacherey-Nagel740609
MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stockThermoFisher ScientificMHS6278-202857165
LE agaroseBiozym840004
PrimersSigma-AldrichCustom order
Human Oncostatin M cDNAGift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) 
pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sitesGift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)

Referencias

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