Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

חלבונים הקשורים מבחינה מבנית להפעיל לעתים קרובות תפקודים ביולוגיים ברורים. ההחלפה של אזורים המקבילה של חלבונים אלה כדי ליצור חלבונים chimeric מהווה גישה חדשנית כדי לזהות אזורים קריטיים חלבון אשר אחראים על הבדלי הפונקציונלית שלהם.

Abstract

המטרה של פרוטוקול זה מקיף את העיצוב של חלבונים chimeric שבו אזורים הנבדלים זה מזה של חלבון מוחלפים על-ידי שלהם רצפי המתאימים חלבון מבנית דומה, על מנת לקבוע את החשיבות פונקציונלי של אזורים אלה. כזה כימרות נוצרות באמצעות פרוטוקול ה-PCR מקוננות באמצעות קטעים חופפים DNA ועוצב שלמאחה תחל, ואחריו הביטוי שלהם בתוך מערכת יונקים כדי להבטיח מבנה שניוני יליד ושינויים post-translational.

תפקיד פונקציונלי של אזור ברורים אז מציינים לאובדן של הפעילות של החימרה ב וזמינותו הבדיקה המתאימה. כתוצאה מכך, אזורי מחסה ערכה של חומצות אמינו קריטי מזוהים, אשר יכולים להיות מוקרן נוספת בטכניקות משלימים (למשל מוטגנזה) כדי להגדיל את הרזולוציה מולקולרית. למרות מוגבל למקרים שבהם ניתן למצוא חלבון מבנית קשורים עם פונקציות שונות, חלבונים chimeric יש כבר בהצלחה מועסקים כדי לזהות אזורים איגוד קריטי ב חלבונים כגון קולטנים ציטוקינים ו ציטוקינים. שיטה זו מתאימה במיוחד במקרים שבהם אזורים פונקציונליים של החלבון אינם מוגדרים היטב, ומהווה צעד ראשון חשוב בגישות אבולוציה מכוונת לצמצם את האזורים של ריבית, להפחית את המאמץ ההקרנה מעורב.

Introduction

מספר סוגים של חלבונים, לרבות ציטוקינים גורמי גדילה, מקובצים במשפחות שחבריה חולקים מבנים תלת מימדיים דומה אך לעיתים קרובות להפעיל פונקציות ביולוגיות שונות1,2. המגוון פונקציונלי הוא בדרך כלל התוצאה של הרכב חומצות אמינו בתוך אתרים פעילים של המולקולה3הבדלים קטנים. זיהוי של אתרים כאלה גורמים תפקודית לא רק להציע תובנות אבולוציונית אלא גם עיצוב ספציפי יותר אגוניסטים, מעכבי4. עם זאת, מספר גדול של ההבדלים בהרכב שאריות לעתים קרובות למצוא בין חלבונים הקשורים מבחינה מבנית מסבך משימה זו. אף-על-פי בניית ספריות גדול המכיל מאות מוטציות כיום ריאלי, הערכת כל וריאציה שאריות יחיד ונותרה שילובים שלהם עדיין מאתגר ולגזול מאמץ5.

טכניקות להעריך את חשיבות תפקודית של חלבון גדולה אזורים ובכך הם בעלי ערך כדי לצמצם את מספר שאריות אפשרי לניהול מספר6. חלבונים קטום כבר הגישה הנפוצה ביותר כדי להתמודד עם בעיה זו. בהתאם לכך, אזורים נחשבים באופן פונקציונלי זה רלוונטי אם הפונקציה חלבון שנבחנה מושפע על-ידי המחיקה של אזור מסוים7,8,9. אולם, מגבלה עיקרית של שיטה זו הוא כי מחיקות יכול להשפיע על מבנה שניוני של החלבון, המוביל אל misfolding, צבירת וחוסר יכולת ללמוד את האזור המיועד. דוגמה טובה היא גרסה קטום של ציטוקינים oncostatin M (OSM), שבו למד מחיקה פנימיים גדולים יותר משקעים 7, גרמו מוטציה misfolded שלא היתה אפשרות נוספת10.

הדור של חלבונים chimeric מהווה גישה חלופית וחדשנית המאפשרת הניתוח של אזורים גדולים יותר חלבון. המטרה של שיטה זו היא להחליף מחוזות עניין חלבון מאת רצפים הקשורות מבנית בחלבון אחר, כדי להעריך את התרומה של הסעיפים הוחלף על תפקודים ביולוגיים ספציפיים. בשימוש נרחב בתחום של איתות קולטנים לזהות תחומים פונקציונליים11,12, חלבונים chimeric שימושיים בעיקר ללמוד חלבון משפחות עם מעט חומצת אמינו זהות אבל שנשמרת מבנה שניוני. ניתן למצוא דוגמאות המתאימות בכיתה של interleukin-6 (IL-6) מסוג ציטוקינים, כגון neurotrophic interleukin-6 ו ciliary פקטור (6% רצף זהות)13 או לוקמיה מעכבות פקטור (LIF) ו OSM (20% זהות)6, שבו ע פ הפרוטוקול מבוסס.

Protocol

1. עיצוב חלבון chimeric

  1. בחר חלבון מתאים (תורם) להחלפת אזורים עם החלבון עניין (הנמען) החלבון התורם צריך להיות דומים מבחינה מבנית, אידיאלי השייכים המשפחה חלבון, אבל חסר את פעילות ביולוגית כדי לשמש readout. אם אין חלבונים הקשורים מבחינה מבנית ידועים, מועמדים פוטנציאליים ניתן לזהות באמצעות כלי אוטומטי כגון ה-14,כלי חיפוש יישור וקטור (גדולה)15
    1. לגשת האינטרנט האירופית16 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/) של חלבון בנק מידע (PDB) להציג את השם של החלבון עניין בתיבת החיפוש על הפינה הימנית העליונה, לחץ על 'חיפוש'. ובלבד מבנה הגביש זמין, לא למטה המזהה PDB (PDB מזהה; למשל 1evs של OSM).
      הערה: אם מבני נתונים אינה זמינה בה-PDB, מודל הומולוגיה של החלבון יכול להיווצר על ידי כלי כגון שוויצרי-דגם17 במקום, באמצעות פרוטוקולים שלב אחר שלב זמינה18.
    2. הגישה שלך לאתר העצום (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). למקרה מזהה PDB זמין, לגלול למטה 'לאחזר תוצאות מחושב מראש' לסעיף, יזין את מזהה PDB בתיבה 'הצג דומה מבני עבור' ולחץ על 'ללכת'. במסך הבא, לחץ על 'המקורי המכריע' ולאחר מכן 'שרשרת שלמה' כדי לראות רשימה של מזהי PDB עבור מועמדים פוטנציאליים מבנית דומה.
      1. אם מזהה PDB אינה זמינה, אך מודל הומולוגיה הופקה, גלול מטה אל המקטע 'חיפוש עם מבנה חדש', לחץ על הקישור 'חיפוש המכריע'. להעלות את הקובץ PDB של המודל על-ידי לחיצה על 'עיון' ליד 'PDB לשלוח קובץ', בחירת הקובץ, לחיצה על 'שלח'.
      2. לאחר ה-PDB מועלה קובץ, לחץ על לחצן 'התחל' כדי להתחיל את החישוב העצום. ברגע החישוב מבוצע, לחץ על 'שרשרת שלמה' תחת תחומים כדי לראות את תעודות הזהות PDB של חלבונים דומים מבחינה מבנית.
    3. להעריך את תפקודים ביולוגיים עניין (למשל הפעלת קולטן, פעילות אנזימטיות, פעילות פקטור שעתוק) של המועמדים המובילים, או השפעול מערכת הבדיקה של בחירה או באמצעות חיפוש ספרות. בחר חלבון תורם עם פונקציית מתבדרת בהשוואה החלבון עניין.
  2. השג את רצפי חומצת אמינו חלבון של החלבונים ונמען התורם מסד הנתונים של הפניה רצף (RefSeq)19 .
    1. גישה המקטע ג'ין האינטרנט RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), הקלד את השם של החלבון עניין בתיבת החיפוש ולחץ על 'חפש'. לחץ על שם ג'ין עבור המין הרצוי ברשימה המתקבלת.
    2. גלול מטה אל המקטע RefSeq כדי לראות הכל מתועד איזופורמים. לחץ על מזהה רצף עבור איזופורם ריבית (החל NM), גלול למטה ולחץ על 'תקליטורים' כדי לסמן את האזור חלבון-קידוד של הגן. בחלק הימני התחתון של המסך, לחץ על 'FASTA' ולהעתיק את רצף גנטי.
    3. לשמור רצף הדנ א באמצעות DNA מתאימים תוכנה לעריכת. בעת שימוש הקוף זמינה בחופשיות20, פתח את התוכנית, להדביק את רצף שהועתק בתיבת ריק, בחר את השם של רצף ולחץ על 'שמור'.
      הערה: חזור על שלבים 1.2.1. כדי 1.2.3. של אחד או יותר תורם החלבונים שנבחרו.
  3. בחר את האזורים חלבון שיוחלפו בתוך המבנה chimeric שונים.
    1. לחלק את רצף החלבון עניין במבניים אזורים הנבדלים זה מזה. באופן אידיאלי, תחומים שונים של החלבון המדובר תוארו בספרות. אם זה לא המקרה, צריך להעריך קיומו של תכונות מבניות שנשמרת שונות (helices, לולאות) בשלבים 1.3.1.1. כדי 1.3.1.4.
      1. להוריד את הנתונים מבנית של החלבון עניין מהאתר PDB (ראה שלב 1.1.1.). גישה לדף PDB עבור החלבון, להוריד את הקובץ PDB על ידי לחיצה על 'הורד' בצד ימין של המסך.
      2. פתח את הקובץ PDB מערכת הדמיה מולקולרית כמו PyMOL (https://pymol.org/). ב PyMOL, להציג את הרצף נוקלאוטיד (על ידי לחיצה על תצוגה > רצף על), להסתיר נתונים מבניים המוגדר כברירת מחדל (על-ידי לחיצה על ה לצד מזהה PDB ולאחר בחירת 'הכול'), בחר את התצוגה 'קריקטורה' בבירור להמחיש מבנה החלבון תכונות (לחיצה על ה-S לצד מזהה PDB ולאחר בחירת "קריקטורה").
      3. לחץ על הרצף נוקלאוטיד בחלק העליון של המסך כדי לסמן חלקים שונים של המולקולה, וציין למטה חומצות אמינו, המתייחס לכל תכונית מבחינה מבנית.
    2. הוספת ביאורים האזורים מבניים ברורים על רצף הדנ א של קוף. לשם כך, פתח את רצף ה-DNA מ שלב 1.2.3. בחר את נוקלאוטידים קידוד חומצות אמינו באזור, לחץ לחיצה ימנית על הבחירה, בחר 'תכונה חדשה' לתת לזה שם וצבע. חזור על התהליך עבור כל אזור מבניים שזוהו בשלב הקודם.
      הערה: הבחירה נוקלאוטיד יכול להיות פעמיים על ידי לחיצה על ORFs > תרגם ולאחר מכן לחיצה על אישור, כדי להבטיח כי הם הקוד של הרצף הנכון חומצת אמינו.
    3. יישר את רצפי שאריות של שני החלבונים העסקת כלי היישור חלבון (למשל אומגה Clustal21).
      הערה: מאז כימרות להיות מיוצר במערכת הביטוי יונקים, רצפים אלה צריך לכלול האות פפטידים של החלבונים.
      1. להשיג את רצפי חומצת אמינו מלא של חלבונים התורם ואת קולטן של קוף, על-ידי פתיחת רצפי דנ א מ שלב 1.2.3., בחירתן ולחיצה על ORFs > תרגם.
      2. הגישה לדף האינטרנט אומגה Clustal (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), יזין רצפי חומצות אמינו של שני החלבונים, ולאחר מכן גלול למטה, לחץ על 'שלח'. כל רצף צריך להיות המשיך בקו טקסט עם ' > ProteinName' כדי להיות מזוהים כהלכה.
      3. לאחזר את הקובץ היישור על-ידי לחיצה על הכרטיסיה 'קובץ יישור להורדה' ולשמור אותו. ניתן לפתוח קובץ זה באמצעות תוכנית לעריכת טקסט.
      4. באמצעות הקובץ יישור כהפניה, ביאורים האזורים מבניים המתאימים של החלבון התורם של רצף ה-DNA שלהם (ראה שלב 1.3.2.).
    4. להחליט באילו אזורים חלבון כדי להחליף את החלבונים chimeric ולעצב את רצפי נוקלאוטיד המתאים כימרות.
      הערה: בהעדר מידע מפורט לגבי חשיבות תפקודית של האזורים השונים, הוא הציע לבחור תחליפים גדולים כגון לולאות כל או helices כדי להעריך את מי מהם יש השפעה על תפקוד החלבון. ניסוי זה גישוש הראשונה יכולה להיות מלווה ואז סיבוב שני של חלבון chimeric עיצוב, התמקדו החלפות קטנות בתוך האזורים הרלוונטיים.
      1. יצירת עותק של רצף הדנ א מוערת של החלבון קולטן שלב 1.3.2. שם חדש חלבון chimeric. לפתוח את רצף ה-DNA ששמם שונה בקוף, בחר ומחק את נוקלאוטיד רצף קידוד האזור להירכש, להחליף אותו על-ידי האזור המקביל החלבון התורם (להעתיק מהרצף המבואר שנוצר בשלב 1.3.3.), ולאחר מכן לשמור את השינויים.
        הערה: צור עותק חדש, חזור על שלב זה עבור כל הכימרה שונים המיועד.

2. הכנה לקראת שיבוט מולקולרי

  1. בחר וקטור פלסמיד מתאים מערכת ביטוי של בחירה. ביטוי יונקים, וקטור ביטוי גבוהה כמו pCAGGS22 או את הסידרה וקטור pcDNA מומלצים.
    1. עבור מבוססי אנזים הגבלה השיבוט והפגינו ב פרוטוקול זה, ודא האתרים הגבלת ייחודיים המצויים באתר שיבוט מרובים (MCS) של וקטור תואם עם החלבון של עניין. לשם כך, פתח את רצף ה-DNA של המבנה chimeric עם קוף, לחץ על ' אנזימים > אנזים בורר ' וודא כי לפחות שניים מהאתרים הגבלה ב MCS נעדרים ברצף (הצגת אפס ליד השם שלהם).
  2. לעצב את מסוף תחל תוך שימוש בעורך ה-DNA כמו קוף.
    1. יצירת קובץ ה-DNA חדש (קובץ > ניו) וליזום את פריימר N-מסוף עם רצף מנהיג (3-9 נוסף בסיסי זוגות, למשל AAAGGGAAA), ואחריו האתר הגבלת הראשון שנבחר ב MCS של וקטור (6-8 בסיסים, למשל TTAATTAA עבור פאצי), מרווח אופציונלי (למשל GCTAGCGCATCGCCACC של וקטור pCAGGS משמש בדוגמה), זוגות הבסיס הראשוני 18-27 של הגן עניין (למשל ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG של OSM).
    2. בקובץ ה-DNA חדש, הרצף פריימר C-מסוף מתחיל עם הגמר 18-27 בסיסי זוגות של הגן עניין (למשל CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA עבור גן עם תג C-terminal 6xHistidine), ואחריו מרווח אופציונלי (למשל TAGCGGCCGC ב הווקטור pCAGGS), ההגבלה השנייה באתר הנבחר (למשל GGCGCGCC עבור AscI), מנהיג רצף (למשל AAAGGGAAA). לסמן את כל הרצף, לחצו לחיצה ימנית ובחרו 'הפוך המשלים' כדי לקבל את המפתח הפוכה.
  3. עיצוב תחל לכל אחד באזורי הגבול של המבנה chimeric.
    1. פתח את רצף ה-DNA החימרה (שנוצרו בשלב 1.3.4.1.), לסמן את אזור 30 זוג בסיסים באזור איפה הרצף המקורי, שנוסף על קשר, הכולל 15 זוגות הבסיס של כל רצף. העתק את האזור (לחיצה ימנית ובחרו 'העתק') והדבק אותו בקובץ ה-DNA חדש; הרצף הזה יהיה פריימר לפנים.
    2. צור עותק של פריימר לפנים המופקים הקודם שלב ולשנות את זה בתור פריימר הפוכה. לסמן את רצף פריימר, לחצו לחיצה ימנית ובחרו 'הפוך המשלים' כדי ליצור את רצף פריימר הפוכה.
    3. חזור על שלבים 2.3.1. 2.3.2. עבור כל אזור קשר ברצף ה-DNA chimeric. באופן כללי, שתי קבוצות של קדימה/הפוכה תחל נדרשים ליצור מפלצת אחת, אלא אם כן. התחליף מתרחשת N-מסוף או אזורים C-מסוף.
  4. להזמין את צבעי בסיס המסוף ופנימיים של ספק סינתזה oligonucleotide.
    הערות: שימוש מאוד מטוהרים תחל מסוף (למשל מטוהרים-HPLC) עלולה להיות השפעה חיובית על שיעור ההצלחה של הפרוטוקול. Desalted תחל פנימי מספקים בדרך כלל תוצאות טובות.
  5. להשיג את התבנית רצפים של גנים התורם ואת קולטן.
    הערה: העסקת פלסמידים המכילים מסגרות קריאה פתוחה (ORFs) של רצפי אלה כתבנית מאוד מקלה על ההליך, והוא מומלץ. לחלופין, ניתן להשתמש DNA משלימים (cDNA) המופקים קו תא ידוע להביע את הגנים האלה כתבנית עבור והשלבים.

3. פולימראז תגובת שרשרת (PCR) הגברה של שברי DNA בודדים ויוצרים את כמירה

  1. להכין תערובת התגובה PCR נפרדים עבור כל אחד מהשברים להלחין את החלבון chimeric. חלבון chimeric טיפוסי ידרוש שלושה קטעים בודדים: החלק N-מסוף האזור שיוכנס, החלק C-מסוף.
    הערות: להשתמש על אמינות גבוהה DNA פולימראז (למשל Phusion High Fidelity DNA פולימראז) כדי להימנע מהחדרה מוטציות ברצף. התגובה PCR יכול להיות להגדיר בערב ולהפעיל למשך הלילה.
    1. סט microfuge 1.5 mL צינור על קרח, pipet של נוגדנים שונים תערובות PCR לפי הסדר המוצג בטבלה 1, להבטיח תחל הנכונה ואת תבניות מועסקים עבור כל תגובה PCR (ראה טבלה 2).
    2. תווית עם קירות דקים 0.2 מ ל שתי המבחנות עבור כל תגובה, ולהעביר µL 20 של תערובת PCR המתאימים לכל צינור. להעביר את המבחנות לתוך thermocycler ה-PCR וליזום את פרוטוקול מפורט בטבלה3.
      הערה: חישול הטמפרטורה צריכה להיות לפחות 5 מעלות נמוך יותר מאשר טמפרטורת ההיתוך של תחל תוכנן.
  2. בזמן ה-PCR פועל, להכין 100 מ של 1% ג'ל agarose מאגר טריס-אצטט-EDTA (טה). למטרה זו, שוקל 1g של agarose, לערבב עם 100 מ של מאגר טה בבקבוקון זכוכית, במיקרוגל עד agarose זה התפרקה לחלוטין, מתערבל את הבקבוק כל 30-40 שניות. לאפשר קירור עד כ 50 ° C, להוסיף 2-3 µL של אתידיום ברומיד (או לצבוע המקבילה של DNA) ויוצקים מגש ג'ל עם מסרקים היטב הרצוי.
    התראה: אתידיום ברומיד הוא ידוע מוטגן, להבטיח את השימוש ציוד מגן מתאים.
  3. לאחר השלמת התגובה PCR, להוסיף µL 4 6 x DNA טעינת מאגר כל שפופרת. הכנס יחידת אלקטרופורזה בג'ל agarose 1%, לכסות עם מאגר טה ולטעון בקפידה את הדגימות לתוך הג'ל יחד עם סולם משקל מולקולרי.
    הערה: בזמן הטעינה, עדיף להשאיר מסלולים ריקים בין הדגימות כדי להקל על ה-DNA שחזור לאחר מכן.
  4. הפעל את הג'ל-80-120 V 20-45 דקות.
    הערה: להקות תחת 1,000 זוגות בסיס יכולה בדרך כלל להיות electrophoresed בתוך כ-20 דקות-120 V, בעוד להקות גדולות יותר ידרוש יותר פעמים פועל.
  5. כבה את יחידת אלקטרופורזה, להוציא את הג'ל agarose והמחש הלהקות DNA מוגבר תחת אור UV. בעזרת סכין גילוח, לגזור את שברי DNA בודדים בג'ל ולאחר להעביר אותם ל mL 2 שכותרתו microfuge צינורות.
    הערה: למזער את הזמן חשיפה לאור UV על מנת למנוע נזק לדנ א.
  6. השתמש של PCR לנקות קיט (ראה טבלה של חומרים) לטהר את שברי דנ א שונים.
    1. להוסיף 500 µL מאגר NTI שמספק את ערכת כל שפופרת המכילה קטע ג'ל. העברה של thermomixer ב 50-55 מעלות צלזיוס, ומנענע-1000 סל ד עד הג'ל היא התפרקה לחלוטין לתוך המאגר.
    2. להעביר את כל הפתרונות קיט עם תוויות עמודה, ספין ב microcentrifuge (30-60, 11,000 x g) וזורקים את flowthrough. להוסיף 700 µL של ערכת NT3 שטיפת המאגר, צנטריפוגה שוב תחת הגדרות זהות ולמחוק את flowthrough. Centrifuge את העמודות שוב עבור 1-2mins ב 11,000 g x יבש קרום סיליקה בתוך העמודה.
    3. להעביר את העמודה צינור microfuge mL 1.5 שכותרתו, pipet 30 µL של מים נטולי נוקלאז לתוך העמודה, תן לעמוד במשך דקה אחת, צנטריפוגה 30-ה-60 ב 11,000 g x כדי elute את ה-DNA.
  7. לכמת את כמות ה-DNA התאושש על ידי מדידה של ספיגת המדגם ב-260 nm ו 340 nm בספקטרופוטומטר (ראה טבלה של חומרים). ריכוז הדנ א מחושב על-ידי חיסור הקריאה nm 340 מן הדמות 260 ננומטר, ואז הכפלת התוצאה של ה-DNA הכחדה מקדם (50 µg/mL)23.
    הערות: מדידה נוספת ב- 230 nm ו 280 ננומטר לאפשר הערכה של דנ א טהור: 260/280 ו- 260/230 יחסי מעל 1.8 נחשבים טהור בדרך כלל עבור ה-DNA. ניתן להשהות את הפרוטוקול לאחר שלב זה, אחסון ה-DNA eluted 4 ° C (לטווח קצר) או-20 ° C (לטווח ארוך).

4. PCR הגברה כדי ליצור רצף הדנ א Chimeric

  1. להגדיר את µL 50 של תגובת ה-PCR נתיך המרכיבים נפרדים של החימרה. בצע את הפעולות המפורטות ב- 3.1, העסקת תחל N-מסוף ו- C-מסוף יחד עם 10 ng של כל ה-dna קטעים שלב שהושג ב- 3.7.
    הערה: התגובה PCR ניתן יהיה להגדיר בשעות הערב, לרוץ בין לילה.
  2. חזור על שלבים 3.2 ל 3.7 כדי לשחזר ולכמת את מקטע DNA מטוהרים ב 30 µL של מים נטולי נוקלאז. מקטע זה מכיל רצף הדנ א chimeric, ולצדו האתרים הגבלת כלול את צבעי בסיס המסוף.

5. החדרת דנ א Chimeric לתוך וקטור ביטוי

  1. תווית שתי שפופרות microfuge 1.5 mL pipet נוגדנים שונים לפי הסדר המצוין בטבלה 4, הוספת 1 µg של הביטוי שנבחרו וקטור ב שפופרת אחת ו µg 1 של המקטע דנ א המשוחזר ביד השניה. תקופת דגירה של 1-4 h ב 37 ° C כדי לבצע העיכול עם אנזימי הגבלה שבחרת.
    הערות: ודא שני אנזימי הגבלה תואמים המאגר המועסקים. . למקרה שהם דורשים מאגרים שונים לחלוטין, בצע שלבים אלה תחילה רק באחד האנזימים וחזור. הזמן הנדרש עבור העיכול יכול להשתנות בהתאם אנזימי הגבלה שנבחרו: מתייחסים להוראות היצרן לקבלת מידע מפורט.
  2. חזור על שלבים 3.2 ל 3.7 כדי לטהר ולשחזר מתעכל DNA פרגמנט וביטוי וקטור ב 30 µL של נוקלאז ללא מים. לכמת את כמות הדנ א לשחזר כמו קודם.
  3. לחשב את כמות הוספה DNA נדרש יחס של 3:1 הוספה/וקטור טוחנת בעקבות תגובות מצדו, באמצעות המשוואה הבאה.

    הכנס (נג) = יחס טוחנת * וקטור (ng) * להוסיף גודל (bp) / גודל וקטורי (bp)

    הערה: יחסי טוחנת הוספה/וקטור שונה יכול להיבדק, אמנם בדרך כלל 3:1 יחס מספיקה להשיג תוצאות נאותה.
  4. הגדרת µL 20 תגובה מצדו צינור microfuge 1.5 mL עם 40 ng של הביטוי וקטור הסכום של ה-DNA chimeric מחושבת באופן שלב 5.3, מאגר ו- T4 DNA ליגאז בעקבות הסדר המצוין בטבלה 5, דגירה בין לילה ב-16 ° C
    הערה: יעילות מצדו הוא גדל בדרך כלל על-ידי ביצוע התגובה בין לילה ב 16 ° C, אך לחילופין התגובה יכולה להיות מודגרות עבור 2 h בטמפרטורת החדר.
  5. שינוי צורה µL 5-10 של תערובת מצדו לתוך כשיר מבחינה כימית Escherichia coli (e. coli) שהוכן בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים24 לגדול במבחר צלחות ולבחור אחת המושבות הרחבה, פלסמיד לדנ א בידוד לפי פרוטוקולים הוקמה25.
    הערה: המתח e. coli XL1-כחול הועסק עבור פרוטוקול זה, אך ניתן להשתמש גם גרסאות אחרות e. coli .
  6. לעכל את 1 µg של פלסמידים מבודד עם אנזימי הגבלה המתאים ההוראות בשלב 5.1, ולהעריך את הנוכחות של להקת ה-DNA בגודל התואם רצף chimeric על ידי אלקטרופורזה ב ג'ל agarose (ראה שלבים 3.2-3.5).
    הערה: מומלץ כי הרצף שנוספו מאומתת על-ידי שירות רצף ה-DNA.
  7. עם רצף מוצלח האימות, פלסמידים יכולים להיות מיוצר בכמויות גדולות יותר, המועסקים במערכת הביטוי בתרבית של פרוטוקולים ומבוססת הבאים26,27.

תוצאות

עם שני בני משפחת ציטוקין interleukin-6, OSM ו LIF, אשר היו מושא מחקר שפורסם לאחרונה6דוגמה הבנייה, דור של חלבון chimeric (איור 1). איור 2 מציג את מבנה תלת ממדי של חלבונים אלה. שתי מולקולות לאמץ את מבנה שניוני אופייני של מחלקה אני ציטוקינים, עם אר?...

Discussion

הדור של חלבונים chimeric מהווה טכניקה רב-תכליתי, אשר מסוגל ללכת מעבר לגבולות של חלבונים קטום להפנות שאלות כגון המודולריות של ציטוקינים-קולטן איגוד תחומים13. העיצוב של כימרות נמצא צעד מפתח בסוג זה של מחקרים, ודורש שיקול דעת זהיר. מחקרים ראשוניים להקים תחומים פונקציונליים בדרך כלל י...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי חברת מקס פלנק ו- Schüchtermann-המרפאה (רע Rothenfelde, גרמניה). חלק מחקר זה פורסם לראשונה בכתב העת לכימיה ביולוגית. אדריאן-Segarra, מ' ג', שינדלר, ש, Gajawada, עמ', Lörchner, ה', בראון, טי & Pöling, ג'יי לולאה AB ו- D-סליל באתר איגוד השלישי של מ' Oncostatin האנושית (OSM) נדרשים עבור הפעלת קולטן OSM. ג'יי Biol.. כימיה 2018; 18:7017-7029. © המחברים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Labcycler thermocyclerSensoquest011-103Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol
NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometerThermoFisher ScientificND-2000C DNA quantification
GeneRuler 100 bp DNA ladderThermoFisher ScientificSM0241
GeneRuler DNA Ladder MixThermoFisher ScientificSM0331
AscI restriction enzymeNew England BiolabsR0558
PacI restriction enzymeNew England BiolabsR0547
Phusion Hot Start II DNA PolymeraseThermoFisher ScientificF-549S
dNTP set (100 mM)Invitrogen10297018
T4 DNA ligasePromegaM1804
NucleoSpin Gel and PCR clean-up kitMacherey-Nagel740609
MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stockThermoFisher ScientificMHS6278-202857165
LE agaroseBiozym840004
PrimersSigma-AldrichCustom order
Human Oncostatin M cDNAGift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) 
pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sitesGift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)

References

  1. Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
  2. Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
  3. Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
  4. Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
  5. Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
  6. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
  7. Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
  8. Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
  9. Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
  10. Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
  11. Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).
  12. Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
  13. Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
  14. Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
  15. Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).
  16. Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
  17. Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).
  18. Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
  19. Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI's LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
  20. Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
  21. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  22. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  23. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  25. Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
  26. Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
  27. Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
  28. Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
  29. Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
  30. Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
  31. Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
  32. McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
  33. Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
  34. Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
  35. Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
  36. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  37. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  38. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143ChimericPCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved