Identificação de regiões de proteína funcional através de construção de proteínas quiméricas

Resumo

Proteínas estruturalmente relacionadas frequentemente exercem funções biológicas distintas. A troca das regiões equivalentes destas proteínas a fim de criar proteínas quiméricas constitui uma abordagem inovadora para identificar regiões críticas da proteína que são responsáveis pela sua divergência funcional.

Resumo

O objetivo do presente protocolo abrange o design das proteínas quiméricas em que regiões distintas de uma proteína são substituídas por suas sequências correspondentes em uma proteína estruturalmente semelhante, a fim de determinar a importância funcional destas regiões. Tais quimeras são geradas através de um protocolo PCR aninhado usando a sobreposição de fragmentos de DNA e adequadamente projetado cartilhas, seguidas por sua expressão dentro de um sistema de mamíferos para garantir estrutura secundária nativa e modificações borne-translational.

O papel funcional de uma região distinta é então indicado por uma perda de atividade da Quimera, em um ensaio de leitura apropriado. Em consequência, são identificadas regiões abrigando um conjunto de aminoácidos essenciais, que pode ser ainda mais selecionados por técnicas complementares (por exemplo, mutagenesis local-dirigido) para aumentar a resolução molecular. Embora limitada a casos em que uma proteína estruturalmente relacionada com funções diferentes pode ser encontrada, proteínas quiméricas têm sido empregadas com sucesso para identificar as regiões críticas de ligação em proteínas tais como receptores de citocinas e citocinas. Este método é particularmente apropriado em casos em que as regiões funcionais da proteína não estão bem definidas e constitui um valioso primeiro passo na evolução dirigida abordagens para diminuir as regiões de interesse e reduzir o esforço de rastreio envolvido.

Introdução

Vários tipos de proteínas, incluindo citocinas e fatores de crescimento, são agrupados em famílias cujos membros compartilham semelhantes estruturas tridimensionais, mas muitas vezes exercem funções biológicas distintas^1,2. Esta diversidade funcional costuma ser a consequência de pequenas diferenças na composição de aminoácidos dentro sites ativos^{3 da molécula}. Identificação de tais sites e determinantes funcionais não só oferecem insights valiosos evolutivos mas também projetar mais específico agonistas e inibidores da⁴. No entanto, o grande número de diferenças na composição do resíduo frequentemente encontrado entre proteínas estruturalmente relacionadas complica essa tarefa. Mesmo que a construção de grandes bibliotecas contendo centenas de mutantes hoje em dia é viáveis, avaliando cada variação único resíduo e combinações deles continua a ser um esforço desafiante e demorado⁵.

Técnicas para avaliar a importância funcional das regiões grandes proteínas são, portanto, de valor para reduzir o número de resíduos possíveis para um número gerenciável⁶. Proteínas truncadas tem sido a abordagem mais utilizada para resolver este problema. Nesse sentido, as regiões são consideradas funcionalmente relevantes se a função da proteína em estudo é afectada pela exclusão de uma determinada região^7,8,9. No entanto, uma grande limitação deste método é que as exclusões podem afetar a estrutura secundária da proteína, levando a enrolamento, agregação e a incapacidade para estudar a região pretendida. Um bom exemplo é uma versão truncada da citocina oncostatin M (OSM), no qual uma exclusão interna maior do que 7 resíduos resultaram em um mutante misfolded que não poderia ser mais estudou¹⁰.

A geração de proteínas quiméricas constitui uma abordagem alternativa e inovadora que permite a análise de regiões maiores da proteína. O objetivo desse método é a troca de regiões de interesse em uma proteína por sequências estruturalmente relacionadas em uma outra proteína, a fim de avaliar a contribuição das seções substituiu a funções biológicas específicas. Amplamente utilizado no campo da sinalização de receptores para identificar domínios funcionais^11,12, proteínas quiméricas são particularmente úteis para estudar famílias da proteína com pouco aminoácido identidade mas conservada estrutura secundária. Adequadas exemplos podem ser encontrados na classe de interleucina-6 (IL-6) tipo citocinas, como interleucina-6 e ciliar neurotrophic factor (6% identidade de sequência)¹³ ou leucemia inibitório fator (LIF) e (20% de identidade) OSM⁶, em que o seguindo o protocolo é baseado.

Protocolo

1. proteína quimérico Design

1. Selecione uma proteína adequada (doador) a troca de regiões com a proteína de interesse (destinatário), que a proteína do doador deve ser estruturalmente semelhante, idealmente pertencentes à mesma família da proteína, mas falta a atividade biológica a ser usada como leitura. Se sem proteínas estruturalmente relacionadas são conhecidas, os potenciais candidatos podem ser identificados usando uma ferramenta automatizada como o Vector alinhamento ferramenta de pesquisa (vasto)^14,15
   1. Acesse o site europeu de¹⁶ proteína banco de dados (PDB) (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), introduzir o nome da proteína de interesse na caixa de pesquisa no canto superior direito e clique em 'Pesquisar'. Desde que uma estrutura cristalina está disponível, não para baixo o identificador do PDB (PDB ID; por exemplo, 1evs para OSM).
      Nota: se os dados estruturais não estão disponíveis no PDB, um modelo de homologia da proteína pode ser gerado por uma ferramenta como o suíço-modelo¹⁷ em vez disso, usando protocolos passo a passo disponível¹⁸.
   2. Acesse o site vasto (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). No caso de um PDB ID está disponível, role para baixo até a seção 'Recuperar resultados pré-calculada', imput o PDB ID na caixa 'Mostrar estruturas semelhantes para' e clique em 'OK'. Na tela seguinte, clique em 'vasto Original' e depois 'Toda a cadeia' para ver uma lista de IDs de PDB para potenciais candidatos estruturalmente semelhantes.
      1. Se um PDB ID estiver indisponível, mas foi gerado um modelo de homologia, role para baixo até a seção 'Busca com uma nova estrutura' e clique no link 'Vasta pesquisa'. Upload de arquivo PDB do modelo clicando em 'Browse' ao lado 'Arquivo PDB submeter', selecionando o arquivo e clique em 'Submeter'.
      2. Após o PDB arquivo é carregado, clique no botão 'Start' para iniciar o cálculo vasto. Uma vez que o cálculo é executado, clique em 'Toda a cadeia' sob domínios para ver as identificações de PDB de proteínas estruturalmente similares.
   3. Avalie as funções biológicas de interesse (por exemplo, da ativação do receptor, atividade enzimática, atividade do fator de transcrição) dos candidatos top, ou experimentalmente no sistema de leitura de escolha ou através de uma pesquisa bibliográfica. Selecione uma proteína de doador com função divergente em comparação com a proteína de interesse.
2. Obter as sequências de aminoácidos da proteína das proteínas do receptor e do doador do banco de dados a sequência de referência (RefSeq)¹⁹ .
   1. Acesse a seção de gene na RefSeq página Web (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), digite o nome da proteína de interesse na caixa Pesquisar e clique em 'Pesquisar'. Clique no nome do gene para a espécie desejada na lista resultante.
   2. Role para baixo até a seção RefSeq ver isoformas tudo documentadas. Clique sobre o identificador de sequência para a isoforma de interesse (começando com NM), role para baixo e clique em 'CDS' para destacar a região de codificação da proteína do gene. No canto inferior direito da tela, clique em 'FASTA' e copie a sequência do gene.
   3. Salve a sequência de DNA usando um software de edição de DNA adequado. Ao usar o macaco livremente disponível²⁰, abra o programa, colar a sequência copiada na caixa em branco, selecione o nome de sequência e clique em 'Salvar'.
      Nota: Repita os passos 1.2.1. a 1.2.3. para as proteínas um ou mais doadores selecionadas.
3. Escolha as regiões da proteína a ser substituído nas diferentes construções quiméricas.
   1. Divida a sequência da proteína de interesse em distintas regiões estruturais. Idealmente, diferentes domínios da proteína em questão serão têm sido descritos na literatura. Se isso não for o caso, a existência de distintas características estruturais conservadas (hélices, loops) deve ser avaliada em etapas 1.3.1.1. para 1.3.1.4.
      1. Baixar os dados estruturais da proteína de interesse no site da PDB (consulte a etapa 1.1.1.). Acessar a página do PDB para a proteína e baixar o arquivo PDB, clicando em 'download' no lado direito da tela.
      2. Abra o arquivo PDB em um sistema de visualização molecular como PyMOL (https://pymol.org/). Em PyMOL, exibir a sequência de nucleotídeos (clicando em Exibir > em sequência), ocultar os dados estruturais padrão (clicando o H ao lado do PDB ID e selecionando 'tudo') e selecione a visualização de 'desenho animado' Visualizar claramente estrutural da proteína características (clicando o S ao lado o PDB ID e selecionando 'desenhos animados').
      3. Clique sobre a sequência de nucleotídeos na parte superior da tela para destacar diferentes partes da molécula, anotando os aminoácidos correspondentes a cada particularidade estrutural.
   2. Anote as regiões estruturais distintas na sequência do DNA em macaco. Para fazer isso, abra a sequência do DNA da etapa 1.2.3., selecione os nucleotídeos de codificação para os aminoácidos em uma região, botão direito do mouse na seleção e selecione 'Novidade' para dar-lhe um nome e uma cor. Repita o processo para cada região estrutural identificada na etapa anterior.
      Nota: A seleção de nucleotídeo pode ser revista clicando ORFs > traduza, em seguida, clicando em Okey, para garantir que eles codificam para a sequência correta de aminoácidos.
   3. Alinhe as sequências de resíduo das duas proteínas empregando uma ferramenta de alinhamento de proteína (por exemplo, Clustal Omega²¹).
      Nota: Desde as quimeras são a ser produzido em um sistema de expressão de mamíferos, essas sequências devem incluir peptídeos de sinal a proteínas.
      1. Obter as sequências de aminoácido completa de proteínas do doador e do receptor em macaco, abrindo-se as sequências de DNA da etapa 1.2.3., selecionando-os e clicando em ORFs > Translate.
      2. Acessar a página da Web Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) e imput as sequências de aminoácidos das proteínas de dois, em seguida, role para baixo e clique em 'Enviar'. Cada sequência deve ser começou por uma linha de texto com ' > ProteinName' para ser corretamente identificado...
      3. Recuperar o arquivo de alinhamento clicando na guia 'Alinhamento de Download arquivo' e salve-o. Este arquivo pode ser aberto por qualquer programa de edição de texto.
      4. Usando o arquivo de alinhamento como referência, anotar as correspondentes regiões estruturais da proteína em sua sequência de DNA do doador (consulte a etapa 1.3.2.).
   4. Decida quais regiões da proteína para trocar nas proteínas quiméricas e projetar as sequências de nucleotídeos apropriado para as quimeras.
      Nota: Na ausência de informações detalhadas sobre a importância funcional das diferentes regiões, sugere-se para selecionar grandes substituições como toda loops ou hélices para avaliar quais deles têm um impacto sobre a função da proteína. Esta primeira experiência exploratória então pode ser seguida por uma segunda rodada de design de proteínas quiméricas, focada em substituições menores nas regiões relevantes.
      1. Crie uma cópia da sequência de DNA anotada da proteína do receptor da etapa 1.3.2. e renomeá-lo como proteínas quiméricas. Abrir a sequência de DNA renomeada em macaco, selecionar e excluir a sequência de nucleotídeos codificação para a região a ser trocadas e substituí-la pela região correspondente na proteína doador (copiada da sequência anotada criada na etapa 1.3.3.) e, em seguida, salvar as alterações.
         Nota: Criar uma nova cópia e repita esta etapa para cada diferente Quimera projetada.

2. preparação para clonagem Molecular

1. Selecione um vetor do plasmídeo adequado para o sistema de expressão de escolha. Para a expressão dos mamíferos, um vetor de alta expressão como pCAGGS²² ou a série de vetor de pcDNA é recomendada.
   1. Para a enzima de restrição clonagem baseada demonstrada neste protocolo, certifique-se de que os sites de restrição único presentes no site clonagem múltipla (MCS) do vetor são compatíveis com a proteína de interesse. Para fazer isso, abra a sequência de DNA das construções quiméricoes com macaco, clique em ' enzimas > seletor de enzima ' e verifique se pelo menos dois dos sites restrição em MCS estão ausente na sequência (exibindo um zero ao lado de seu nome).
2. Desenha os primers de terminais usando um editor de DNA como macaco.
   1. Criar um novo arquivo de DNA (arquivo > novo) e iniciar o primer do N-terminal com uma sequência de líder (3-9 extras pares de bases, por exemplo, AAAGGGAAA), seguido pelo primeiro site restrição selecionado no MCS do vetor (6-8 pares de bases, por exemplo, TTAATTAA para PacI), um espaçador de opcional (por exemplo, GCTAGCGCATCGCCACC do vetor de pCAGGS usado no exemplo) e os pares de base inicial de 18-27 do gene de interesse (por exemplo, ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG para OSM).
   2. Em um novo arquivo de DNA, a sequência da primeira demão do C-terminal começa com a final 18-27 pares de bases do gene de interesse (por exemplo, CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA para um gene com um tag do C-terminal de 6xHistidine), seguidos por um espaçador opcional (por exemplo, TAGCGGCCGC em o vetor de pCAGGS), a segunda restrição site escolhido (por exemplo, GGCGCGCC para ascos) e uma sequência de líder (por exemplo, AAAGGGAAA). Destacar a sequência inteira, botão direito do mouse e selecione 'Reverse-complemento' para obter o primer reverso.
3. Desenho de primers para cada uma das regiões fronteiriças nas construções quiméricas.
   1. Abra a sequência do DNA da Quimera (criada na etapa 1.3.4.1.) e destaque uma região de 30 pares de base na zona onde as sequências originais e inseridas estão em contato, composto por 15 pares de base de cada sequência. A região (botão direito do mouse e selecione 'Copiar') de copiar e colá-lo em um novo arquivo de DNA; Essa sequência será o primer para a frente.
   2. Faça uma cópia do primer frente gerado na anterior etapa e renomeá-lo como primer reverso. Destacar a sequência da primeira demão, botão direito do mouse e selecione 'Reverse-complemento' para gerar a sequência inversa da primeira demão.
   3. Repita as etapas 2.3.1. e 2.3.2. para cada zona de contato na sequência de DNA quimérico. Geralmente, dois pares de primers de avanço/retrocesso são necessários para gerar uma quimera, a menos que a substituição ocorre no N-terminal ou regiões C-terminal.
4. Encomendar os primers internos e terminais de um provedor de síntese do oligonucleotide.
   Notas: Usando altamente purificado cartilhas terminais (por exemplo, HPLC-purificado) pode ter um impacto positivo na taxa de sucesso do protocolo. Demolhado iniciadores internos geralmente fornecem bons resultados.
5. Obter modelo as sequências de genes do doador e do receptor.
   Nota: Empregando plasmídeos contendo os frames de leitura abertos (ORFs) destas sequências como um modelo extremamente facilita o procedimento e é recomendado. Alternativamente, DNA complementar (cDNA) gerado a partir de uma linha de celular conhecida de expressar estes genes pode ser usado como um modelo para as etapas subsequentes.

3. polymerase reação em cadeia (PCR) amplificação dos fragmentos do DNA Individual, formando a Quimera

1. Prepare uma mistura de reação de PCR individual para cada um dos fragmentos compondo as proteínas quiméricas. Uma típica proteínas quiméricas exigirá três fragmentos individuais: a parte do N-terminal, a região a ser inserido e a parte C-terminal.
   Notas: Use uma alta fidelidade DNA polimerase (por exemplo, Phusion alta fidelidade DNA polimerase) para evitar a introdução de mutações na sequência. A reação de PCR pode ser constituída à noite e correr durante a noite.
   1. Conjunto uma microcentrífuga de 1,5 mL tubo no gelo e pipetar os reagentes diferentes das misturas PCR na ordem mostrada na tabela 1, certifique-se de cartilhas corretas e modelos são empregados para cada reação de PCR (ver quadro 2).
   2. Rotular a dois tubos PCR de paredes finas-0,2 mL para cada reação e transferir 20 µ l da mistura de PCR correspondente em cada tubo. Transferir os tubos PCR para um thermocycler PCR e iniciar o protocolo detalhado na tabela 3.
      Nota: temperatura do recozimento deve ser pelo menos 5 graus inferior à temperatura de fusão dos primers projetados.
2. Enquanto a PCR está executando, prepare 100 mL de um gel de agarose 1% em tampão Tris-Acetato-EDTA (TAE). Para este efeito, pesar 1 g de agarose, misture com 100 mL de tampão TAE num balão de vidro e até a agarose é completamente dissolvido, agitando o balão a cada 30-40 segundos no microondas. Permitir o arrefecimento a aproximadamente 50 ° C, adicionar 2-3 µ l de brometo de etídio (ou um equivalente corante de DNA) e despeje em uma bandeja de gel com os pentes bem desejados.
   Atenção: brometo de etídio é um conhecido agente mutagénico, garantir o uso adequado de equipamentos de proteção.
3. Após a reação de PCR é concluída, adicione 4 µ l de tampão de carregamento 6 x DNA em cada tubo. Inserir o gel de agarose 1% em uma unidade de electroforese, cobrir com tampão TAE e carregar cuidadosamente as amostras no gel juntamente com um peso molecular de escada.
   Nota: no momento do carregamento, é preferível deixar pistas vazias entre as amostras para facilitar a recuperação do DNA depois.
4. Funcione o gel em 80-120 V para 20-45 minutos.
   Nota: bandas sob 1.000 pares de bases geralmente podem ser electrophoresed em cerca de 20 minutos a 120 V, enquanto bandas maiores exigirão tempos mais longos de execução.
5. Desligue o aparelho de eletroforese, retire o gel de agarose e visualizar as bandas de DNA amplificadas sob luz UV. Usando uma lâmina de barbear, cortar os fragmentos de DNA individuais do gel e transferi-los para tubos de microcentrífuga 2ml rotulada.
   Nota: Minimize o tempo de exposição à luz UV para evitar danos ao DNA.
6. Use um PCR limpar kit (veja a Tabela de materiais) para purificar os diferentes fragmentos de DNA.
   1. Adicione 500 µ l de buffer NTI fornecido pelo kit a cada tubo contendo um fragmento de gel. Transferir para um thermomixer a 50-55 ° C e agitando a 1000 rpm, até que o gel é completamente dissolvido em buffer.
   2. Cada solução de transferência para uma coluna rotulada kit, girar numa microcentrifuga (30-60, 11.000 x g) e descartar o flowthrough. Adicione 700 µ l de tampão de lavagem do kit NT3, centrifugue novamente sob as mesmas configurações e descartar o flowthrough. Centrifugar as colunas novamente por 1-2mins a 11.000 x g para secar a membrana de silicone dentro da coluna.
   3. Transferi a coluna para um tubo de microcentrífuga rotulado 1,5 mL, pipetar 30 µ l de água livre de nuclease à coluna, deixe repousar durante 1 minuto e centrifugar a 11.000 x g para Eluir o DNA de 30-60.
7. Quantificar a quantidade de DNA recuperado por medir a absorvância da amostra em 260 nm e 340 nm num espectrofotómetro (ver Tabela de materiais). A concentração de DNA é calculada subtraindo-se a leitura de 340 nm da figura 260 nm, em seguida, multiplicar o resultado por coeficiente de extinção (50 µ g/mL)^{23 do DNA}.
   Notas: Medições adicionais em 230 nm e 280 nm permitir uma avaliação da pureza do DNA: 260/280 e 260/230 rácios acima 1.8 são geralmente considerados como puro para DNA. O protocolo pode ser pausado após esta etapa, armazenando o DNA eluted a 4 ° C (curto prazo) ou a-20 ° C (longo prazo).

4. PCR amplificação para gerar a sequência de DNA quimérico

1. Configure-se 50 µ l de uma reação de PCR para fundir os componentes separados da Quimera. Siga as mesmas etapas detalhadas no 3.1, empregando os primers N-terminal e C-terminal, juntamente com 10 ng de cada do DNA fragmentos obtidos no passo 3.7.
   Nota: A reação de PCR pode ser definida à noite e correr durante a noite.
2. Repita as etapas de 3,2 a 3,7 para recuperar e quantificar o fragmento de DNA purificado em 30 µ l de água livre de nuclease. Este fragmento contém a sequência de DNA quimérico, ladeada pelos sites restrição constantes os primers terminais.

5. a inserção do DNA quimérico em um vetor de expressão

1. Rótulo de dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e pipeta os reagentes diferentes na ordem indicados na tabela 4, adicionando 1 µ g da expressão selecionada de vetor em um tubo e 1 µ g do fragmento de DNA recuperado no outro. Encube por 1-4 h a 37 ° C, para realizar a digestão com enzimas de restrição as escolhido.
   Notas: Certifique-se de ambas as enzimas de restrição são compatíveis com o buffer de empregado. No caso eles exigem amortecedores completamente diferentes, execute estas etapas primeiro com apenas uma das enzimas e repita. O tempo necessário para a digestão pode variar dependendo das enzimas de restrição selecionadas: consulte as instruções do fabricante para obter informações detalhadas.
2. Repita as etapas de 3,2 a 3,7 para purificar e recuperar o vetor digerido do fragmento e expressão DNA em 30 µ l de água livre de nuclease. Quantificar a quantidade de DNA recuperado como antes.
3. Calcule a quantidade de DNA de inserção necessária para uma relação molar de 3:1 inserção/vetor na reação da ligadura, utilizando a seguinte equação.
   
   Inserir (ng) = razão Molar * vetor (ng) * Inserir tamanho (bp) / tamanho do vetor (bp)
   
   Nota: Rácios molar de inserção/vetor diferentes podem ser testados, embora geralmente uma proporção de 3:1 é suficiente para obter resultados adequados.
4. Configurar a 20 µ l de uma reação de ligadura em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 40 ng da expressão vetor a quantidade de DNA quimérico calculado no passo 5.3, tampão e T4 DNA ligase, seguindo a ordem indicada na tabela 5e incubar durante uma noite a 16 ° C.
   Nota: Eficiência de ligadura é geralmente maior, realizando a reação durante a noite a 16 ° C, mas como alternativa a reação pode ser incubada durante 2 h à temperatura ambiente.
5. Transformação de 5-10 µ l da mistura de ligadura em quimicamente competentes de Escherichia coli (e. coli) preparado seguindo protocolos padrão²⁴ crescem em placas de seleção e escolha colônias única para expansão e plasmídeo de DNA isolamento de acordo com protocolos estabelecidos²⁵.
   Nota: A cepa de Escherichia coli XL1-Blue foi empregada para este protocolo, mas outras variantes de e. coli também podem ser usados.
6. Digerir os plasmídeos isolados de 1 µ g com as enzimas de restrição apropriadas, seguindo as instruções na etapa 5.1 e avaliar a presença de uma banda de DNA de um tamanho correspondente à sequência de quimérico por eletroforese em um gel de agarose (ver etapas 3.2-3.5).
   Nota: É recomendável que a sequência inserida é verificada por meio de um serviço de sequenciamento de DNA.
7. Após verificação de sequência bem sucedida, o plasmídeo pode ser produzido em quantidades maiores e empregado em um sistema de expressão mamíferos pelos seguintes protocolos bem estabelecidos^26,27.

Resultados

Construção e geração de uma proteína Quimérico (Figura 1) pode ser exemplificados com dois membros da família de citocinas interleucina-6, OSM e LIF, que foram objecto de um estudo recentemente publicado⁶. A Figura 2 mostra a estrutura tridimensional destas proteínas. Ambas as moléculas adotam a estrutura secundária característica de classe I, citocinas, com quatro hélices (denominados de À D)...

Discussão

A geração de proteínas quiméricas constitui uma técnica versátil, que é capaz de ir além dos limites das proteínas truncadas para abordar questões como a modularidade do receptor de citocina-ligação domínios¹³. O projeto de quimeras é um passo fundamental neste tipo de estudos e requer cuidadosa consideração. Estudos preliminares para estabelecer domínios funcionais geralmente exigirá a substituição das grandes regiões, numa primeira fase, enquanto menores substituições de c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labcycler thermocycler	Sensoquest	011-103	Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol
NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-2000C	DNA quantification
GeneRuler 100 bp DNA ladder	ThermoFisher Scientific	SM0241
GeneRuler DNA Ladder Mix	ThermoFisher Scientific	SM0331
AscI restriction enzyme	New England Biolabs	R0558
PacI restriction enzyme	New England Biolabs	R0547
Phusion Hot Start II DNA Polymerase	ThermoFisher Scientific	F-549S
dNTP set (100 mM)	Invitrogen	10297018
T4 DNA ligase	Promega	M1804
NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit	Macherey-Nagel	740609
MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock	ThermoFisher Scientific	MHS6278-202857165
LE agarose	Biozym	840004
Primers	Sigma-Aldrich		Custom order
Human Oncostatin M cDNA			Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany)
pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites			Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)