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  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este estudio describe un alto rendimiento, basado en la proyección de imagen de neutralización micro ensayo para determinar el título de anticuerpos neutralizantes específicos para virus sincicial respiratorio (VSR). Este formato de ensayo ha sido probado en tipos diferentes de la muestra.

Resumen

Respiratorios sincicial virus específicos anticuerpos neutralizantes (NAbs de RSV) son un marcador importante de protección contra el VRS. Un número de formatos de ensayo diferentes está en uso en todo el mundo así que hay una necesidad de un método preciso y de alto rendimiento para medir RSV NAbs. Aquí describimos un análisis micro-neutralización basado en proyección de imagen que ha sido probado en el subgrupo de RSV A y también puede ser adaptado para RSV subgrupos B y tipos de muestras diferentes. Este método es altamente reproducible, con variaciones inter-ensayos para el antisuero de referencia siendo menos del 10%. Creemos que este análisis pueden establecerse fácilmente en muchos laboratorios en todo el mundo a un costo relativamente bajo. Desarrollo de un ensayo mejorado, de alto rendimiento que mide RSV NAbs representa un importante paso adelante para la estandarización de este método internacionalmente como críticos para la evaluación de nuevos candidatos vacunales de RSV en el futuro.

Introducción

Virus sincitial respiratorio (VSR) es la principal causa de infecciones del tracto respiratorio inferiores en la población pediátrica en todo el mundo1. A pesar de su alta carga, no existe todavía ninguna vacuna o tratamiento. Desde 2013, la Organización Mundial de la salud (OMS) ha declarado el desarrollo de una vacuna RSV como una prioridad de investigación, con reuniones consulta anual WHO2,,3. La OMS ha acordado con RSV neutralizando la medición de anticuerpos (NAb) para supervisar la inmunogenicidad de la vacuna, esto se reconoce como el marcador serológico más importante de protección4. Atrapó se han demostrado para proteger contra la infección de RSV grave en un número de estudios y ensayos clínicos del palivizumab anticuerpo monoclonal de anti-RSV, actualmente la estrategia profiláctico disponible4.

Existen múltiples formatos de ensayo NAb utilizados por laboratorios de todo el mundo, incluyendo análisis celular y molecular, que han hecho esfuerzos de estandarización difícil5,6,7,8. Sin embargo, el ensayo de neutralización (PRN) de reducción de placa convencional que mide el número de placa reducida formando unidades (PFU) por la presencia de un anticuerpo específico de RSV sigue siendo el estándar de oro9. Aquí, Divulgamos un protocolo PRN mejor, simplificado y de alto rendimiento que puede utilizarse en numerosas líneas celulares de diferentes cepas de RSV y con capacidad de análisis mayor. Este protocolo ha sido probada utilizando muestras clínicas de diferentes contextos, así como muestras de experimentos de modelo animal.

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Protocolo

Nota: Todas las medidas deben realizarse en una campana de BSL2 indique diferentemente. Titulación viral se requiere antes de un ensayo PRN para determinar la concentración óptima de RSV utilizada en el ensayo PRN. Se recomienda a alícuota a las poblaciones de virus en un pequeño volumen que serán descongelados una vez y para cada ensayo de NAb. También se recomienda usar el mismo stock viral para todos los ensayos de NAb realizados para todas las muestras de un estudio. Asegúrese de que los medios de cultivo y solución salina tamponada con fosfato (PBS) se calienta a 37 ° C antes de agregar placas de células.

1. titulación Viral VRS

Nota: Dependiendo del número de poblaciones de virus y el número de duplicados, la placa de ensayo puede configurarse según figura 1. Cada stock de virus debe titularse por triplicado hacia abajo la placa de ensayo, a partir de la mayor concentración viral (es decir, 1:10). Titulaciones seriales pueden ser típicamente 1:10. Cultivo de células A549 y mantenimiento, así como procedimiento de cultura de RSV se realiza empleando los procedimientos estándar y no se incluyen en este protocolo.

  1. Placas de siembra (día 1)
    1. Resuspender las células A549 de Dulbecco modificado águilas mediana (DMEM) + 10% de suero fetal de ternero (FCS) + 1000 UI penicilina/estreptomicina (pen/strep) en 4 x 105/ml. Semilla de 96 pozos fondo plano placas estériles con 100 μL/pocillo que contiene 4 x 104 A459 células.
    2. Incubar las placas durante la noche a 37 ° C, 5% CO2 (células será en el crecimiento de la fase logarítmica).
      Nota: Utilice el nuevo vial de células A549 después 23 pasajes. Se recomienda no empezar los experimentos cuando un vial nuevo de celular todavía está en los primeros tres pasos.
  2. Infección por el virus (día 2)
    1. Preparación de la dilución serial virus
      1. Rápidamente descongelar un vial congelado individual de RSV en un baño de agua de 37 ° C hasta casi completamente descongelada y colocar inmediatamente en hielo. Preparar 3 repeticiones para cada RSV stock virus ensayarse, utilizar una dilución de virus inicial stock de 1:10 con 100 μL de virus diluido/bien y reservar al menos una columna para el control negativo.
        Nota: La figura 1 muestra control negativo en triplicado.
      2. Añada 100 μL de cada virus diluido en 1:10 por triplicado de la columna A de un fondo de U 96 pocillos placa estéril. Agregar 90 μL/pocillo de DMEM + 1000 UI pluma/estreptococos sin FCS a filas B a H.
      3. Realizar la serie 1:10 diluciones hacia abajo la placa al transferir 10 μL de fila A fila solución B. Mezclar por pipeteo contenido arriba y abajo 5 veces y continuar con las diluciones diez veces hasta fila H. descartar el final 10 μL para que el volumen final en cada bien es 90 μL.
        Nota: Es importante utilizar puntas nuevas para cada dilución.
    2. Inoculación del virus a las células A549
      1. Recuperar cell plate(s) A549 preparado el día anterior. Que sean monocapas de células A549 en placas de 96 pocillos confluentes de ~ 80%. Desechar el medio por inversión suavemente de la placa y borrar suavemente sobre una toalla de papel absorbente estéril.
      2. Lavar todos los pocillos con 100 μL de PBS dos veces, deseche el exceso PBS por inversión suavemente de la placa y borrar suavemente sobre una toalla de papel absorbente estéril después de cada lavado. No permita que las placas se sequen.
      3. Transferencia de las diluciones de virus de la placa de titulación viral (figura 1) en los pocillos correspondientes en la placa de células A549. Incubar la placa por 1 h a 37 ° C, 5% CO2. Después de 1 h de incubación, decantar el sobrenadante con una pipeta (para evitar contaminación cruzada). Saque 90 μL/pozo.
      4. Añada 100 μL de medio de 1 x 199 (M199, véase tabla de materiales) + 1,5% sal de sodio carboximetilcelulosa (CMC) de baja viscosidad + 2% FCS con pluma/strep a cada pocillo.
        Nota: 2 x M199 + 4% FCS + pluma/estreptococos a 2% y 3% CMC soluciones necesitan ser preparados de antemano y almacenados a 4 ° C para su uso futuro. Asegúrese de que la solución se calienta a 37 ° C antes de agregar a las placas.
        1. Preparar la solución x M199 2: 1 sachet/500 mL agua destilada 20 mL FCS, agua + 10 mL pluma/strep (para 2 x MI99). Filtrar la solución utilizando una unidad de filtro de 0,22 μm.
        2. Para la preparación de 3% CMC, añadir 15 g de CMC lentamente en 500 mL de agua destilada. Disolver el CMC en agua usando calentador agitador metálico a 50 ° C, que toma cerca de 1 hora de preparación. Mezclar bien para hacer 3% CMC y autoclave la solución.
          Nota: El CMC sólido debe agregarse al agua para disolverse; Añadir agua al sólido seco produce un "bosquecillo" del sólido que es muy difícil de disolver.
        3. Preparar 1 x M199 + viscosidad baja de CMC 1,5% + 2% FCS con pluma/strep por mezcla 1:1 2 x M199 y 3% CMC preparado en el paso 1.2.2.4.2.
      5. Incubar la placa por 3 días a 37 ° C, 5% CO2.
  3. Desarrollo de la placa de ensayo y análisis (día 5)
    1. Fijación y desarrollo de ensayo de placa
      1. Deseche el M199 + CMC + 2% FCS con pluma/strep invirtiendo suavemente la placa. Añadir poco a poco (para evitar perturbar la capa de células) 200 μL de tampón de fijación (acetona al 80%, 20% PBS, almacenado a-20 ° C) para fijar las células. Incubar a-20 ° C por 20 min.
      2. Desechar el tampón de fijación y luego suavemente sobre una toalla de papel absorbente. Deja la cara de la placa hasta seco durante 10 minutos.
        Nota: De este paso se puede realizar análisis fuera de la campana BSL2.
      3. Preparar 5% leche diluyente bloqueo solución filtrada PBS que contenga 0.05% polisorbato 20 (PBS-polisorbato, véase Tabla de materiales). Para una placa, calcular el volumen necesario para bloqueo basado en 200 y bien 110 pozos: pozos de 200/bien x 110 = 22 mL (1.1 mL concentrado leche diluyente en 20,9 mL filtrada PBS-polisorbato). En esta etapa, también forman parte suficiente de solución de bloqueo por anticuerpos primarios y secundarios. Para una placa, calcular el volumen necesario para cada solución de anticuerpo, basado en 50 y bien 110 pozos: 110 pozos 50/bien x = 5,5 mL. Por lo tanto, el volumen total de diluyente leche bloqueando la solución necesaria para un análisis de la placa solo es de 33 mL.
      4. Añadir 200 /well de solución de bloqueo. Incubar la placa a temperatura ambiente (RT) durante 30 minutos, desechar la solución invirtiendo suavemente la placa y secar sobre una toalla de papel absorbente.
      5. Preparación de anticuerpos de cabra X VRS 1: 500 (mAb – anticuerpo primario) diluido en solución de bloqueo. Añadir 50 /well de la solución de mAb e incubar a 37 ° C por 1 h. placa de lavado 3 veces con PBS-polisorbato filtrada.
      6. Preparar 1:5,000 burro de Alexa Fluor anti-cabra IgG (anticuerpo secundario) diluido en solución de bloqueo. Añadir 50 /well de la solución de anticuerpo secundario e incubar a 37 ° C por 1 h. placa de lavado 5 veces con PBS-polisorbato filtrada.
      7. Leer la placa en un lector automatizado puntos utilizando el canal de fluoresceína isotiocianato (FITC) y contar la configuración como se muestra en la figura 2. Envuelva la placa en papel y almacenar a 4 ° C. Calibrar el instrumento usando una placa de cultivo de 96 pocillos no utilizados y la introducción de ajustes de cuenta antes del ensayo.
        Nota: Volver a exploración en pocos días es posible si es necesario. La calibración y ajuste de cuenta se pueden guardar y utilizar para la exploración futura, si el ensayo utiliza el mismo tipo de placa utilizada para la calibración.
      8. Revise las imágenes de pozos de las placas de artefacto o monocapas de células perturbada (figura 3). Excluye pozos con monocapas de células interrumpida.
        Nota: Dependiendo del tamaño de las placas de artefacto, manual de cuentas deba realizarse para los pozos o los pozos deba descartarse del análisis de los datos. Los criterios para un resultado válido incluyen no perturbada célula monocapa o artefacto placas detectadas en más de una repetición bien y no PFU detectada en pozos negativos (pozos sin virus agregado).
    2. Determinar las concentraciones virales
      1. Elija las dos últimas diluciones donde pueden contarse claramente puntos. Calcular el número promedio de puntos de replicación pozos en la misma dilución. Calcular la concentración viral (PFU / mL) de la muestra común utilizando la siguiente fórmula:
        PFU/mL = promedio del número de placas / (factor de dilución × volumen de virus diluido añadido al pozo)
        Nota: La concentración del virus determinada para cada acción de RSV puede utilizarse ahora en el análisis PRN (paso 2).

2. ensayo de neutralización VRS

  1. Placas de siembra (día 1)
    1. Resuspender las células A549 en DMEM + 10% FCS + 1000 UI pluma/strep en 4 x 105/ml. Placas estériles de semilla 96 pozos de fondo plano con 100 μL/pocillo que contiene 4 x 104 A459 células e incubar las placas durante la noche a 37 ° C, 5% CO2 (células será en el crecimiento de la fase logarítmica).
      Nota: Utilice el nuevo vial de células A549 después 23 pasajes. No se recomienda utilizar las células A549 antes del número de paso 3.
  2. Preparación de suero y virus (día 2)
    Nota: Dependiendo del tipo de muestra, hay pasos requeridos para preprocesamiento muestras antes del ensayo de NAb. Se recomienda usar el suero estándar internacional de RSV que ahora está disponible a petición del Instituto Nacional para estándares biológicos y control (NIBSC).
    1. Preparación de la dilución de suero
      1. Descongelar el antisuero de referencia RSV humano (suero de referencia, REF) y suero prueba las muestras de excelencia-Inactive por calor las muestras de suero y antisuero en un baño de agua a 56 ° C durante 30 minutos antes de usarlo de referencia. Preparar diluciones según la plantilla de la placa (figura 4).
      2. Preparar la dilución 1: 100 de la preparación Ref. un mínimo de 110 μL Ref diluido en DMEM + pluma/estreptococos sin FCS por placa de ensayo (por ejemplo,, 1,5 μL de REF en un volumen total de 150 μL). Agregar 110 μL de 1: 100 diluido REF en A12 bien de un fondo de U 96 pocillos placa estéril.
      3. Añadir 55 μL de DMEM + pluma/estreptococos sin FCS a pozos B12 H12 en la columna 12. Llevar a cabo serie diluciones 1:2 abajo de la placa de transferencia 55 μL de columna A fila B, solución de mezcla por pipeteo contenido arriba y abajo 5 veces y continuando hasta fila H. descartar el final 55 μL de medios de comunicación para que el volumen final en cada bien es 55 μL. Utilizar puntas nuevas para cada dilución.
      4. Preparar la dilución 1: 100 del suero prueba de las muestras. Como todos los sueros se analizaron por triplicado, preparar un volumen mínimo de 110 μL/pozo x 3 = 330 μL por muestra de suero.
      5. Agregar 110 μL de cada muestra de suero diluido (1: 100; S1 = suero 1, S2 = suero 2, etcetera.) correspondientes pocillos A1 a A9 y también E1 a E9 de la placa de 96 pocillos estéril según figura 4.
      6. Añadir 55 μL de DMEM + pluma/estreptococos sin FCS en todos los pocillos etiquetados X. Realice serie diluciones 1:2 según paso 2.2.1.3 hasta fila D (muestras 1, 2 y 3). Deseche el final 55 μL de medios de comunicación para que el volumen final en cada pozo es 55 μL. Del mismo modo, realizar la serie diluciones 1:2 para las muestras 4, 5 y 6 para las filas E a H.
        Nota: Es importante utilizar puntas nuevas para cada dilución.
      7. Añadir 55 μL de DMEM + pluma/estreptococos sin FCS a pozos en columnas 10 y 11.
    2. Preparación de virus
      1. Rápidamente descongelar un vial congelado individual de RSV en un baño de agua de 37 ° C hasta casi completamente descongelada y colocar inmediatamente en hielo.
      2. Diluir el virus en DMEM + pluma/estreptococos sin FCS basado en la concentración de la alícuota de RSV determinada en el paso 1.3.2. Aplicar una dilución que da aproximadamente 200 PFU/bien. Preparar un volumen total de 5,5 mL (100 pozos).
    3. Preparación de mezcla de suero virus
      1. Añadir 55 del virus diluido a todos los pocillos de las columnas 1-9 y pozos de registros E-H de las columnas 10 y 11 (control positivo) según la plantilla de la placa (figura 4).
      2. Añadir 55 de DMEM + pluma/estreptococos sin FCS a todos los pozos de las filas A-d de columnas 10 y 11 (control negativo). Incubar la placa por 1 h a 37 ° C, 5% CO2.
    4. Inoculación del virus a las células A549
      1. Antes de la terminación del período de incubación, recuperar A549 cell plate(s) preparado en el paso 2.1.1. Que sean monocapas de células A549 en placas de 96 pocillos confluentes de ~ 80%.
      2. Desechar el medio por inversión suavemente de la placa y borrar suavemente sobre una toalla de papel absorbente estéril. Lavar todos los pocillos con 100 μL de PBS dos veces, deseche el exceso PBS por inversión suavemente de la placa y borrar suavemente sobre una toalla de papel absorbente estéril después de cada lavado. No permita que las placas se sequen.
      3. Transferencia de 100 /well de la mezcla de virus suero a los pocillos correspondientes de la placa de células A549 siguiendo la plantilla de placa incubar la placa por 1 h a 37 ° C, 5% CO2.
      4. Después de 1 h, utilizando una pipeta, sacar 90/bien y añadir 100 de había precalentado 1 x M199 + 1,5% CMC 2% FCS + pluma/strep. Incubar la placa por 3 días a 37 ° C, 5% CO2.
        Nota: Asegúrese de que la solución se calienta a 37 ° C antes de agregar a las placas.
  3. Desarrollo de la placa de ensayo y análisis (día 5)
    1. Desarrollar la placa de fijación y ensayo siguiendo los pasos 1.3.1.1 a 1.3.1.8.
    2. Determinar el título de neutralización de 50%
      1. Determinar que el título de neutralización del 50% mediante el cálculo de la distancia proporcional entre las diluciones de suero recíproco por encima y por debajo del 50% del control 'no suero' pozos (control positivo virus - columna 10, filas E-H).
      2. Contar el número de UFP (es decir, placas) derivados de infecciones virales individuales en suero y no pozos de control de suero. Calcular el número medio de PFU del no hay pozos de control de suero y determinar el valor de 50%.
      3. Identificar las diluciones de suero con cuentas que están inmediatamente por encima y por debajo del valor de 50% de los no pozos de control de suero. Utilizando una plantilla de hoja de cálculo o gráfico semilogarítmico, parcela número de PFU en el eje x (escala lineal) y la dilución de suero recíproco en el eje y (escala logarítmica de10 ). Dibujar una línea entre los dos puntos y leer los títulos de neutralización del 50% de la prueba de las muestras de suero de esta línea.
        Nota: La hoja de cálculo del ensayo de RSV PRN (Hoja suplementaria) se utiliza para determinar el título de neutralización de 50%.

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Resultados

La valoración de una acción de virus se realizó a partir de 1:10 a 1:108 dilución para determinar la concentración del virus stock antes del ensayo PRN (resultados representativos se muestra en la figura 5). De la figura 5se puede contar PFU confiablemente en diluciones de 1:104 y 1:105. Se calculó el número promedio de PFU de pozos por triplicado en la misma dilución. Desde el número pro...

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Discusión

Hemos desarrollado y optimizado un ensayo micro-neutralización de RSV simple y eficiente que puede ser adaptado fácilmente en la mayoría de los laboratorios. Este ensayo es capaz de medir la capacidad de infección viral así como la inhibición de la infección viral por NAb a nivel celular mediante análisis de imagen automatizado de medición. El uso de una plataforma basada en la proyección de imagen y sistemas basados en anticuerpos específicos ha aumentado la especificidad y la sensibilidad de detección punto...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen a todos los participantes. Reconocemos a programa de apoyo a infraestructura operativa del gobierno de Victorian. PVL es un recipiente de la beca de desarrollo de carrera de NHMRC.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell line
A549ATCCCCL-185provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2ATCCVR-1540lot number 60430286
Reagents
AcetoneMerck1000142511
Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C)Life TechnologiesA11055
CMC sodium salt powderSigma-AldrichC5678-500G
DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C)Scientific Services – Tissue CultureMCRI in house supply
Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C)InterpathSFBS-F
Goat X RSV antibodyMerckAB1128
human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C)BEI ResourcesNR-4022Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)
M199 powderLife Technologies31100035
Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C)Australian Biosearch50-82-01
Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C)Life Technologies15140122
s.d.H2O from Milli-Q dispenserMerckIn-house dispensation
Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C)Scientific Services – Tissue CultureMCRI in house supply
Tween 20 polysorbateSigma-Aldrich9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL)Invitro TechnologiesFAL352070
Filter unit 0.22 μm (500 mL)Thermo FisherNAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL)Australia PLAM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid)Interpath655180
Sterile U-bottom plates (96-well with lid)Interpath650180
5 mL serological pipetteSigma-AldrichCLS4487-200EA
10 mL serological pipetteInterpath607180
25 mL serological pipetteSigma-AldrichCLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000Fisher BiotecTF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001Fisher BiotecTXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader systemAID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007

Referencias

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  2. Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
  3. Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
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