JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מתאר של תפוקה גבוהה, assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה כדי לקבוע את כייל נוגדנים נטרול ספציפיות עבור הווירוס syncytial הנשימה (RSV). תבנית זו assay נבדקו על סוגי דגימה שונים.

Abstract

הנשימה syncytial וירוס ספציפיים נטרול נוגדנים (RSV NAbs) הם סמן חשוב של הגנה כנגד RSV. מספר תבניות assay שונים הם נמצאים כעת בשימוש ברחבי העולם כך שאין צורך שיטה מדויקת, תפוקה גבוהה עבור מדידת RSV NAbs. נתאר כאן assay מיקרו-ניטרול מבוססת הדמיה אחר נושאים ' נבדק על קבוצת משנה של RSV A, ניתן להתאים גם עבור קבוצת משנה של RSV B סוגי דגימה שונים. שיטה זו היא מאוד לשחזור, עם וריאציות הבין-assay בנסיוב הפניה להיות פחות מ 10%. אנו מאמינים ש-assay הזה ניתן להקים בקלות במעבדות רבות ברחבי העולם במחיר נמוך יחסית. התפתחות assay משופרת, תפוקה גבוהה המודד RSV NAbs מייצג צעד משמעותי קדימה התקינה של שיטה זו ברחבי העולם, כמו גם להיות ביקורתיים להערכת המועמדים חיסון RSV הרומן בעתיד.

Introduction

הווירוס syncytial הנשימה (RSV) הוא הגורם המוביל של זיהומים בדרכי הנשימה התחתונה אוכלוסיית ילדים ברחבי העולם1. למרות משאו גבוהה, יש עדיין אין חיסון או טיפול זמין. משנת 2013, ארגון הבריאות העולמי (WHO) הכריזה על פיתוח חיסון RSV כעדיפות המחקר העיקרי, עם2,פגישות ייעוץ העולמי השנתי3. המי שהסכים באמצעות RSV בנטרול מדידה נוגדנים (NAb) כדי לעקוב אחר חיסון immunogenicity, כפי זה מזוהה כמספר דה מרקר סרולוגית העיקריים של הגנה4. NAbs הוכחו להגן מפני זיהום חמור RSV במספר מחקרים, כמו גם ניסויים קליניים של palivizumab נוגדנים חד שבטיים אנטי-RSV, כיום אסטרטגיה מניעתי בלבד זמינים4.

קיימות מספר תבניות assay NAb בשימוש על ידי מעבדות ברחבי העולם, כולל מבחני מבוססת תא, מבוסס על מולקולרית, אשר עשו מאמצים סטנדרטיזציה מאתגר5,-6,-7,-8. עם זאת, וזמינותו ניטרול (PRN) פלאק קונבנציונלי-הפחתת המודד את מספר מופחת פלאק ויוצרים יחידות (PFU) על ידי הנוכחות של נוגדנים ספציפיים RSV נשאר עדיין תקן זהב9. כאן, אנחנו מדווחים פרוטוקול PRN משופרת מפושטת, תפוקה גבוהה יכול לשמש בשורות תאים רבים, זנים RSV ועם תפוקה מוגברת וזמינותו. פרוטוקול זה נבדקו באמצעות דגימות קליניות של הגדרות שונות, כמו גם על דגימות מן המודל החייתי ניסויים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: כל השלבים צריך להתבצע בשכונה BSL2 אלא אם צויין אחרת. טיטור ויראלי נדרש מראש וזמינותו PRN כדי לקבוע ריכוז RSV אופטימלית בשימוש PRN וזמינותו. מומלץ aliquot את המניות וירוס באמצעי אחסון קטן להיות הקרת פעם, המשמש עבור כל assay NAb. מומלץ גם באמצעות המניה נגיפי זהה עבור כל מבחני NAb לבצע עבור כל דגימות מחקר אחד. ודא תרבות ומדיה באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) מחומם ב 37 מעלות צלזיוס לפני הוספת תא צלחות.

1. RSV טיטור ויראלי

הערה: בהתאם את מספר המניות וירוס מספר הכפילויות, הצלחת assay ניתן להגדיר על פי איור 1. כל מניה וירוס, צריך להיות טיטרציה שהפקידים למטה הצלחת assay, החל הריכוז הגבוה ביותר ויראלי (קרי, 1:10). Titrations טורי ניתן בדרך כלל 1:10. תרבית תאים A549, תחזוקה, כמו גם RSV תרבות הליך נעשים באמצעות הליכים סטנדרטיים, לא נכללות פרוטוקול זה.

  1. צלחות זריעה (יום 1)
    1. Resuspend A549 תאים של Dulbecco הנשרים ששינה בינוני (DMEM) + 10% עגל עוברית סרום (FCS) + 1000 IU פניצילין/סטרפטומיצין (עט/דלקת) ב 4 x 105/mL. זרע 96-ובכן שטוח התחתונה צלחות סטרילי עם 100 μL/טוב המכיל תאים 4 x 104 A459.
    2. דגירה צלחות בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 (תאים יהיה בבית הגידול שלב יומן).
      הערה: שימוש חדש תא A549 המבחנה לאחר 23 מעברים. מומלץ לא להתחיל את הניסויים בקבוקון תא חדש נמצאת עדיין הקטעים הראשונים.
  2. זיהום בנגיף (יום 2)
    1. הכנת וירוס דילול טורי
      1. במהירות להפשיר בקבוקון קפוא יחיד של RSV בתוך אמבט מים 37 ° C עד כמעט לחלוטין הקרת ומניחים מיד על קרח. להכין 3 משכפל RSV כל וירוס מניות ניתן לבדיקה, להשתמש דילול מניות של וירוס הראשונית של 1:10 עם 100 μL של וירוס מדולל/טוב, להזמין לפחות עמודה אחת לשליטה שלילי.
        הערה: איור 1 מציג שליטה שלילי triplicates.
      2. להוסיף 100 μL של כל וירוס מדולל ב 1:10 שהפקידים בשורה A של 96-ובכן U-תחתון צלחת סטרילי. להוסיף μL 90/טוב של DMEM + עט 1000 IU/סטרפ ללא FCS שורות B ה
      3. לבצע 1:10 טורי דילולים למטה את הצלחת על ידי העברת μL 10 משורה A בשורה B. לערבב פתרון על-ידי pipetting תוכן לאורך 5 פעמים ולהמשיך את דילולים ten-fold עד השורה ה להשליך μL 10 הסופי כך שעוצמת הסופי בכל טוב הוא 90 μL.
        הערה: חשוב להשתמש עצות חדשות עבור כל אחד דילול.
    2. חיסון וירוס לתאים A549
      1. לאחזר cell plate(s) A549 מוכנים ביום הקודם. ודא A549 monolayers תא לוחית 96-ובכן ~ 80% confluent. למחוק מדיה על ידי בעדינות היפוך צלחת סופג בקלילות על מגבת נייר סופג סטרילי.
      2. לשטוף את כל בארות עם μL 100 ל- PBS פעמיים, למחוק PBS עודף על ידי בעדינות היפוך צלחת בקלילות סופג על מגבת נייר סופג סטרילי לשטוף אחרי זה. אל תאפשר צלחות להתייבש.
      3. העברה של דילולים וירוס מהצלחת טיטור ויראלי (איור 1) ולס המתאימות בצלחת תא A549. דגירה את הצלחת. בשביל 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. לאחר דגירה 1 h, decant supernatants באמצעות פיפטה (כדי למנוע זיהום לחצות). להוציא 90 μL/טוב.
      4. להוסיף 100 μL 1 x בינוני 199 (M199, ראה טבלה של חומרים) + 1.5% חומצה גליקולית תאית נתרן מלח (CMC) נמוך צמיגות + 2% FCS המכיל עט/סטרפ כדי מכל קידוח.
        הערה: 2 x M199 + 4% FCS + 2% עט/סטרפ ופתרונות CMC 3% צריך להיות מוכן מראש, המאוחסנים ב 4 ° C לשימוש עתידי. ודא כי הפתרון מחומם ב 37 מעלות צלזיוס לפני הוספת צלחות.
        1. להכין פתרון x M199 2: 1 שקית/500 מ"ל מזוקקים מים + 20 מ"ל FCS + אפשרות למצוא עט 10 מ"ל (להמציא 2 x MI99). לסנן את הפתרון באמצעות יחידת מסנן 0.22 μm.
        2. הכנה של 3% CMC, להוסיף 15 גרם של CMC לאט לתוך 500 מ ל מים מזוקקים. להמיס את CMC במים באמצעות חימום קדירות מתכתי ב 50 מעלות צלזיוס, אשר לוקח בערך 1 h של הכנה. לערבב היטב לעשות 3% CMC ו אוטוקלב הפתרון.
          הערה: יש להוסיף את CMC מלא במים כדי להיות מומס; הוספת מים בבית מוצק יבש מייצרת "גוש" של מוצק שקשה מאוד להתמוסס.
        3. להכין 1 x M199 + 1.5% CMC צמיגות נמוכה + 2% FCS המכיל עט/דלקת על ידי ערבוב 1:1 2-M199 ו- 3% CMC מוכן בשלב 1.2.2.4.2.
      5. תקופת דגירה צלחת של 3 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  3. פיתוח assay צלחת וניתוח (יום 5)
    1. קיבוע וצלחת assay המתפתח
      1. להתעלם M199 + CMC + 2% FCS המכיל עט/דלקת על ידי היפוך בעדינות את הצלחת. להוסיף לאט לאט (כדי להימנע להפריע את שכבת תאים) μL 200 קיבוע מאגר (אצטון 80%, 20% ל- PBS, המאוחסנים ב-20 ° C) לתקן תאים. דגירה ב-20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
      2. לבטל את המאגר קיבעון, כתם בעדינות על מגבת נייר סופג. להשאיר צלחת פנים עד יבש למשך 10 דקות.
        הערה: משלב זה ואילך, ניתן לבצע assay מחוץ למכסה BSL2.
      3. להכין 5% חלב diluent פתרון חסימה ב- PBS מסוננים המכילה 0.05% polysorbate 20 (PBS-polysorbate, ראה טבלה של חומרים). על לוח אחד, לחשב את אמצעי האחסון הדרושים לצורך חסימת בהתבסס על 200/110 ובקו בארות: 200/טוב x 110 בארות = 22 מ"ל (חלב מרוכז מ ל 1.1 diluent ב 20.9 mL מסונן PBS-polysorbate). בשלב זה, גם להמציא פתרון חסימה מספיק נוגדנים ראשיים ומשניים. על לוח אחד, לחשב את אמצעי האחסון הדרושים עבור כל הפתרונות נוגדן מבוסס על בארות 50/טוב, 110: בארות 110 x 50/טוב = 5.5 mL. לכן, הנפח הכולל של חלב diluent חוסם את הפתרון הנדרש וזמינותו הלוח היחיד הוא 33 מ.
      4. להוסיף 200 /well של פתרון חסימה. דגירה צלחת בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות להשליך את הפתרון על-ידי היפוך בעדינות את הצלחת, כתם על מגבת נייר סופג.
      5. להכין נוגדן עז X RSV שבערך (mAb-נוגדן ראשוני) מדולל בחסימה פתרון. הוסף /well 50 של הפתרון mAb, דגירה ב 37 ° C עבור 1 ח' לשטוף צלחת 3 פעמים עם PBS מסונן-polysorbate.
      6. להכין 1:5,000 אלקסה-עבור חיל הים החמור עז אנטי איג (נוגדנים משניים) מדולל בחסימה פתרון. הוסף /well 50 של הפתרון נוגדנים משניים, דגירה ב 37 ° C עבור 1 ח' לשטוף צלחת 5 פעמים עם PBS מסונן-polysorbate.
      7. לקרוא את לוחית הזיהוי בקורא נקודות אוטומטית באמצעות תעלת isothiocyanate (FITC) fluorescein ולספור הגדרות כמוצג באיור2. לעטוף את צלחת בנייר ולאחסן ב 4 º C. לכייל את המכשיר באמצעות צלחת שאינם בשימוש תרבות 96-ובכן, הזנת הגדרות לספור לפני וזמינותו.
        הערה: סריקה חוזרת תוך מספר ימים אפשרי אם נדרש. כיול והגדרת הרוזן יכול תישמר ולא שימשו את הסריקה בעתיד אם וזמינותו משתמשת מאותו סוג של צלחת המשמש את הכיול.
      8. בדוק את התמונות של בארות הפלאק החפץ או קטועים תא monolayers (איור 3). הכללת וולס עם monolayers תא קטועים.
        הערה: בהתאם לגודל של הפלאק החפץ, ספירות ידנית ייתכן שתצטרך לבצע עבור מאותן בארות או מאותן בארות ייתכן שתצטרך להיות מושלך מניתוח נתונים. קריטריונים לקבלת תוצאה חוקית כוללים אין תא שיבשו טפט או החפץ הפלאק זוהה שכפול אחד או יותר טוב, אין PFU זוהה בבארות שלילי (בארות ללא וירוס נוסף).
    2. לקבוע ריכוז ויראלי
      1. לבחור את שתי האחרונות דילולים איפה נקודות ניתן לספור בבירור. לחשב את המספר הממוצע של כתמים מבארות שכפל-דילול אותו. לחשב את נגיפי כייל נוגדנים (PFU לכל מ ל) של המדגם מניות באמצעות הנוסחה שלהלן:
        PFU/מ"ל = המספר הממוצע של הפלאק / (דילול גורם × נפח של וירוס מדולל נוספות הבאר)
        הערה: ריכוז הוירוס נקבע עבור כל מניה RSV יכול כעת לשמש וזמינותו PRN (שלב 2).

2. RSV ניטרול Assay

  1. צלחות זריעה (יום 1)
    1. Resuspend A549 תאים DMEM + 10% FCS + עט 1000 IU/סטרפ-/mL עונה 4 פרק 105. זרע 96-ובכן שטוח התחתונה צלחות סטרילי עם 100 μL/טוב המכיל 4 x 104 A459 תאים, דגירה צלחות בן לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 (תאים יהיה בבית הגידול שלב יומן).
      הערה: שימוש חדש תא A549 המבחנה לאחר 23 מעברים. לא מומלץ להשתמש A549 תאים לפני המעבר מספר 3.
  2. הכנת וירוס וסרום (יום 2)
    הערה: בהתאם לסוג לדוגמה, ישנם צעדים הנדרשים עבור דגימות מראש עיבוד לפני וזמינותו NAb. מומלץ להשתמש את RSV בינלאומי סטנדרטי סרה עכשיו זמינות על פי בקשה מן המכון הלאומי עבור פקדים (לסטנדרטיזציה) ותקני ביולוגי.
    1. הכנת בסרום
      1. להפשיר את הנסיוב התייחסות אנושית RSV (הפניה סרום, שופט), סרום לבחון דגימות-בטל-RT. חום הדוגמאות סרום וההתייחסות בנסיוב באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפני השימוש. להכין דילולים לפי התבנית צלחת (איור 4).
      2. להכין לדילול מטריים להכין הפניה למעורר מינימום של μL 110 של שופט מעורבבת עם DMEM + עט/סטרפ ללא FCS לכל צלחת assay (למשל, μL 1.5 של שופט, הנפח הכולל של 150 μL). להוסיף μL 110 בטחונות מדולל REF ב- A12 טוב של 96-ובכן U-תחתון צלחת סטרילי.
      3. להוסיף μL 55 DMEM + עט/סטרפ ללא FCS בארות B12 כדי H12 בעמודה 12. לבצע סידורי דילולים 1:2 את הלוח על ידי העברת 55 μL row A בשורה B, ערבוב פתרון על-ידי pipetting תוכן לאורך 5 פעמים, שתמשיך עד השורה ה להשליך את μL 55 הסופי של מדיה, כך שעוצמת הסופי בכל טוב הוא 55 μL. השתמש עצות חדשות עבור כל אחד דילול.
      4. להכין מטריים דילול של נסיוב הבדיקה דוגמאות. כל הדוגמאות סרום הם לבדיקה שהפקידים, להכין נפח מינימלי של μL/טוב 110 x 3 = 330 μL עבור דגימה בדיקת סרום.
      5. להוסיף μL 110 של כל מדגם בדיקת סרום מדולל (1: 100; S1 = סרום 1, S2 = סרום 2, וכו '.) כדי המתאימים בארות A1 אל A9 וגם E1 כדי E9 של צלחת סטרילי 96-ובכן לפי איור 4.
      6. להוסיף μL 55 של DMEM + עט/סטרפ ללא FCS כדי כל בארות מתויג אקס בצע טורי 1:2 דילולים לפי שלב 2.2.1.3 עד שורה D (עבור דגימות 1, 2 ו- 3). למחוק את μL 55 הסופי של מדיה כך שאמצעי האחסון הסופי היטב כל 55 μL. באופן דומה, לבצע הטורי דילולים 1:2 על דגימות 4, 5 ו- 6 עבור שורות E ה
        הערה: חשוב להשתמש עצות חדשות עבור כל אחד דילול.
      7. להוסיף μL 55 DMEM + עט/סטרפ ללא FCS בארות בעמודות 10 ו-11.
    2. הכנת וירוס
      1. במהירות להפשיר בקבוקון קפוא יחיד של RSV בתוך אמבט מים 37 ° C עד כמעט לחלוטין הקרת ומניחים מיד על קרח.
      2. לדלל וירוס DMEM + עט/סטרפ ללא FCS מבוסס על ריכוז aliquot RSV שנקבע בשלב 1.3.2. החל לדילול שנותן כ PFU/טוב 200. היכונו הנפח הכולל של 5.5 mL (בארות 100).
    3. הכנת תערובת וירוס-סרום
      1. להוסיף 55 של הנגיף מדולל בארות כל העמודות 1-9 ווולס שורות E-H של עמודות 10 ו-11 (בקרה חיובית) על פי התבנית צלחת (איור 4).
      2. להוסיף 55 DMEM + עט/סטרפ ללא FCS בארות כל שורות A-D של עמודות 10 ו-11 (בקרה שלילית). דגירה את הצלחת. בשביל 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    4. חיסון וירוס לתאים A549
      1. לפני סיום תקופת דגירה, לאחזר cell plate(s) A549 מוכנים בשלב 2.1.1. ודא A549 monolayers תא לוחית 96-ובכן ~ 80% confluent.
      2. למחוק מדיה על ידי בעדינות היפוך צלחת סופג בקלילות על מגבת נייר סופג סטרילי. לשטוף את כל בארות עם μL 100 ל- PBS פעמיים, למחוק PBS עודף על ידי בעדינות היפוך צלחת בקלילות סופג על מגבת נייר סופג סטרילי לשטוף אחרי זה. אל תאפשר צלחות להתייבש.
      3. העברת /well 100 של תערובת וירוס-סרום הבארות המתאימים בצלחת תא A549 בעקבות התבנית צלחת Incubate הצלחת. בשביל 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
      4. אחרי ה' 1, באמצעות פיפטה של, תוציא 90/היטב ולהוסיף 100 של prewarmed 1 x M199 + 1.5% CMC + 2% FCS + עט/סטרפ. תקופת דגירה צלחת של 3 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
        הערה: ודא כי הפתרון מחומם ב 37 מעלות צלזיוס לפני הוספת צלחות.
  3. פיתוח assay צלחת וניתוח (יום 5)
    1. לפתח קיבוע ואת וזמינותו הצלחת ביצוע השלבים 1.3.1.1 כדי 1.3.1.8.
    2. לקבוע את כייל ניטרול של 50%
      1. לקבוע שכייל ניטרול של 50% על-ידי חישוב המרחק פרופורציונלי בין סרום הדדיים של דילולים מעל ומתחת 50% של הפקד 'אין סרום' בארות (שליטה וירוס חיובי - עמודה 10, שורות E-H).
      2. לספור את מספר PFU (קרי, שלטי) הנובעות בודדים זיהומים נגיפיים סרום בארות, בארות שליטה ללא סרום. לחשב את מספר PFU אין נסיוב בקרה הבארות רשע וקבע את הערך 50%.
      3. לזהות דילולים סרום עם ספירות שהינם מיד מעל ומתחת הערך 50% אין נסיוב בקרה הבארות. באמצעות גרף למחצה להיכנס או תבנית גיליון אלקטרוני, להתוות את מספר PFU על ציר ה-x (סולם ליניארית), דילול סרום הדדיים בציר ה-y (יומן10 סולם). למתוח קו בין שתי נקודות וקרא titers 50% ניטרול של הבדיקה הדוגמאות סרום מהקו הזה.
        הערה: גליון assay RSV PRN (גליון משלים) משמש כדי לקבוע את כייל ניטרול של 50%.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

טיטרציה של מלאי וירוס בוצעה מ 1:10 עד 1:108 דילול כדי לקבוע ריכוז מניות וירוס לפני וזמינותו PRN (נציג תוצאות המוצג באיור5). איור 5, PFU ניתן לספור באופן אמין-דילולים של 1:104 ו- 1:105. המספר הממוצע של PFU מבארות triplicate-הדילול באותו מחושב. מא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

יש שפותחה ואנו ממוטב פשוטה ויעילה RSV מיקרו-ניטרול assay זה ניתן להתאים בקלות במעבדות רוב. זה וזמינותו הוא היכולת למדוד את היכולת זיהום נגיפי, כמו גם מדידת עיכוב של זיהום נגיפי מאת NAb ברמה התאית באמצעות סריקת תמונה ממוחשב. השימוש של פלטפורמה מבוססת הדמיה של מערכות מבוססות נוגדן ספציפי גדל יריד?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים תודה לכל המשתתפים מעורבים. אנו להכיר תוכנית תמיכה תשתיות מבצעיות של הממשלה ויקטוריאני. PVL היא נמען מלגת פיתוח הקריירה NHMRC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell line
A549ATCCCCL-185provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2ATCCVR-1540lot number 60430286
Reagents
AcetoneMerck1000142511
Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C)Life TechnologiesA11055
CMC sodium salt powderSigma-AldrichC5678-500G
DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C)Scientific Services – Tissue CultureMCRI in house supply
Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C)InterpathSFBS-F
Goat X RSV antibodyMerckAB1128
human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C)BEI ResourcesNR-4022Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)
M199 powderLife Technologies31100035
Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C)Australian Biosearch50-82-01
Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C)Life Technologies15140122
s.d.H2O from Milli-Q dispenserMerckIn-house dispensation
Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C)Scientific Services – Tissue CultureMCRI in house supply
Tween 20 polysorbateSigma-Aldrich9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL)Invitro TechnologiesFAL352070
Filter unit 0.22 μm (500 mL)Thermo FisherNAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL)Australia PLAM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid)Interpath655180
Sterile U-bottom plates (96-well with lid)Interpath650180
5 mL serological pipetteSigma-AldrichCLS4487-200EA
10 mL serological pipetteInterpath607180
25 mL serological pipetteSigma-AldrichCLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000Fisher BiotecTF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001Fisher BiotecTXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader systemAID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007

References

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Modjarrad, K., et al. WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus Vaccine Development Report from a World Health Organization Meeting held on 23-24 March 2015. Vaccine. 34 (2), 190-197 (2016).
  3. Giersing, B. K., Karron, R. A., Vekemans, J., Kaslow, D. C., Moorthy, V. S. Meeting report: WHO consultation on Respiratory Syncytial Virus (RSV) vaccine development, Geneva, 25-26 April 2016. Vaccine. , (2017).
  4. Mazur, N. I., et al. The respiratory syncytial virus vaccine landscape: lessons from the graveyard and promising candidates. Lancet Infect Diseases. 18 (10), e295-e311 (2018).
  5. Hosken, N., et al. A multi-laboratory study of diverse RSV neutralization assays indicates feasibility for harmonization with an international standard. Vaccine. 35 (23), 3082-3088 (2017).
  6. Zielinska, E., et al. Development of an improved microneutralization assay for respiratory syncytial virus by automated plaque counting using imaging analysis. Virology Journal. 2, 84(2005).
  7. van Remmerden, Y., et al. An improved respiratory syncytial virus neutralization assay based on the detection of green fluorescent protein expression and automated plaque counting. Virology Journal. 9, 253(2012).
  8. Varada, J. C., et al. A neutralization assay for respiratory syncytial virus using a quantitative PCR-based endpoint assessment. Virology Journal. 10, 195(2013).
  9. Tripp, R. A., Jorquera, P. A. Human respiratory syncytial virus: methods and protocols. , Humana Press. (2016).
  10. Suara, R. O., et al. Prevalence of neutralizing antibody to respiratory syncytial virus in sera from mothers and newborns residing in the Gambia and in The United States. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3 (4), 477-479 (1996).
  11. McDonald, J. U., Rigsby, P., Dougall, T., Engelhardt, O. Report on the WHO collaborative study to establish the 1st International Standard for antiserum to Respiratory Syncytial Virus. , Available from: http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/260488/WHO-BS-2017.2318-eng.pdf?sequence=1&isAllowed=y (2017).
  12. Wang, J. W., et al. Measurement of neutralizing serum antibodies of patients vaccinated with human papillomavirus L1 or L2-based immunogens using furin-cleaved HPV Pseudovirions. PLoS One. 9 (7), e101576(2014).
  13. Magnus, C., Reh, L., Trkola, A. HIV-1 resistance to neutralizing antibodies: Determination of antibody concentrations leading to escape mutant evolution. Virus Research. 218, 57-70 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143syncytial

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved