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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo studio descrive un throughput elevato, basato su formazione immagine di analisi di micro-neutralizzazione per determinare il titolo degli anticorpi neutralizzanti specifici per il virus respiratorio sinciziale (RSV). Questo formato di dosaggio è stato testato su tipi di campioni diversi.

Abstract

Respiratori sinciziali virus-specifici anticorpi neutralizzanti (RSV NAbs) sono un indicatore importante di protezione contro RSV. Un numero di formati diversi test è attualmente in uso in tutto il mondo c'è un'esigenza di un metodo preciso e ad alta produttività per la misurazione NAbs RSV. Descriviamo qui un'analisi micro-neutralizzazione basato su formazione immagine che è stata testata su sottogruppo RSV A e può essere adattata anche per RSV sottogruppo B e tipi di campioni diversi. Questo metodo è altamente riproducibile, con variazioni inter-saggio per l'antisiero di riferimento inferiore al 10%. Crediamo che questo test può essere facilmente stabilito in molti laboratori in tutto il mondo a costi relativamente bassi. Sviluppo di un'analisi migliore, ad alta produttività che misura RSV NAbs rappresenta un significativo passo avanti per la normalizzazione di questo metodo a livello internazionale, oltre ad essere critici per la valutazione di nuovi candidati vaccinali di RSV in futuro.

Introduzione

Virus respiratorio sinciziale (RSV) è la causa principale delle infezioni più basse delle vie respiratorie nella popolazione pediatrica in tutto il mondo1. Nonostante la sua alta difficoltà, non c'è ancora nessun vaccino o trattamento disponibile. Dal 2013, l'organizzazione mondiale della sanità (OMS) ha dichiarato lo sviluppo di vaccini di RSV come una priorità di ricerca principali, con annuale WHO consultazione riunioni2,3. L'OMS ha concordato sull'utilizzo RSV neutralizzando misura dell'anticorpo (NAb) per monitorare l'immunogenicità del vaccino, come questo è riconosciuto come il principale marker sierologico di protezione4. NAbs hanno dimostrato di proteggere contro l'infezione RSV severa in un certo numero di studi, nonché a studi clinici di palivizumab l'anticorpo monoclonale anti-RSV, attualmente la strategia solo profilattico disponibili4.

Ci sono diversi formati di dosaggio NAb usati dai laboratori in tutto il mondo, tra cui saggi basati su molecolare e cellulare, che hanno compiuto sforzi di standardizzazione impegnativo5,6,7,8. Tuttavia, l'analisi di neutralizzazione (PRN) riduzione della placca convenzionale che misura il numero di riduttore della placca formando unità (PFU) dalla presenza di un anticorpo specifico RSV rimane ancora il gold standard9. Qui, segnaliamo un protocollo PRN migliorato, semplificato e ad alta velocità che può essere utilizzato su numerose linee cellulari, per diversi ceppi di RSV e con un throughput di dosaggio aumentato. Questo protocollo è stato testato utilizzando campioni clinici da impostazioni diverse, come pure su campioni provenienti da esperimenti di modello animale.

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Protocollo

Nota: Tutte le fasi devono essere eseguite in un cappuccio BSL2 se non diversamente indicato. Titolazione virale è richiesto in anticipo un dosaggio PRN per determinare la concentrazione ottimale di RSV usata per il test PRN. Si raccomanda di aliquota le scorte di virus in un piccolo volume che verrà una volta scongelati e utilizzato per ogni dosaggio NAb. Inoltre è consigliabile utilizzare lo stesso stock virale per tutti i saggi di NAb eseguite per tutti i campioni provenienti da uno studio. Assicurarsi di terreni di coltura e tampone fosfato salino (PBS) è riscaldato a 37 ° C prima di aggiungere alla cella piastre.

1. Titolazione virale RSV

Nota: A seconda del numero di azioni di virus e il numero di duplicati, la piastra di dosaggio può essere impostata secondo la Figura 1. Ogni stock di virus deve essere titolato in triplice copia verso il basso la piastra di dosaggio, a partire dalla più alta concentrazione virale (cioè, 01:10). Titolazioni seriale possono essere in genere 01:10. Coltura delle cellule A549 e manutenzione, nonché la procedura cultura RSV è fatto utilizzando le procedure standard e non sono inclusi nel presente protocollo.

  1. Semina le piastre (1 giorno)
    1. Risospendere le cellule A549 in di Dulbecco per volta Eagles medium (DMEM) + 10% di siero fetale di vitello (FCS) + 1000 UI di penicillina/streptomicina (pen/strep) a 4 x 105/ml. Piastre sterili seme 96 pozzetti a fondo piatto con 100 μL/pozzetto contenente cellule 4 x 104 A459.
    2. Incubare le piastre durante la notte a 37 ° C, 5% CO2 (cellule sarà la crescita di registro-fase).
      Nota: Utilizzare nuovo flacone di cellule A549 dopo 23 passaggi. Si consiglia di non iniziare gli esperimenti quando un nuovo flacone di cella è ancora alle prime tre passaggi.
  2. Infezione da virus (giorno 2)
    1. Preparazione delle diluizioni seriali di virus
      1. Scongelare rapidamente un singolo flaconcino congelato di RSV in un bagnomaria a 37 ° C fino a quando quasi completamente scongelati e mettere immediatamente sul ghiaccio. Preparare 3 ripetizioni per ogni RSV brodo di virus per essere analizzati, usare una diluizione stock iniziale virus di 01:10 con 100 μL di virus diluito/pozzetto e riservare almeno una colonna per il controllo negativo.
        Nota: La figura 1 Mostra controllo negativo in triplici copie.
      2. Aggiungere 100 μL di ogni virus diluito alle 01:10 in triplice copia della riga A di un fondo U 96 pozzetti piastra sterile. Aggiungere 90 μL/pozzetto di DMEM + 1000 IU pen/strep senza FCS a righe B-H.
      3. Eseguire serial 01:10 diluizioni giù la piastra trasferendo 10 μL dalla fila alla soluzione B. Mix di pipettaggio contenuto su e giù per 5 volte di fila e continuare le diluizioni dieci volte fino alla riga H. Discard 10 μL di finale, in modo che il volume finale in ciascuna è ben 90 μL.
        Nota: È importante utilizzare nuovi suggerimenti per ogni diluizione.
    2. Inoculazione del virus alle cellule A549
      1. Recuperare A549 cell plate(s) preparato il giorno precedente. Assicurarsi che i monostrati di cellule umane A549 in piastre da 96 pozzetti siano ~ 80% confluenti. Gettare il terreno capovolgendo delicatamente piastra e leggermente macchiare il foglio di carta assorbente sterile.
      2. Lavare due volte tutti i pozzetti con 100 μL di PBS, eliminare l'eccesso di PBS capovolgendo delicatamente piastra e leggermente macchiare il foglio di carta assorbente sterile dopo ogni lavaggio. Non consentire piastre ad asciugare.
      3. Trasferire le diluizioni di virus dalla piastra di Titolazione virale (Figura 1) nei pozzetti corrispondenti sulla piastra delle cellule A549. Incubare la piastra per 1 h a 37 ° C, 5% CO2. Dopo 1 h di incubazione, decantare surnatanti utilizzando una pipetta (per evitare la contaminazione incrociata). Prendere fuori 90 μL/pozzetto.
      4. Aggiungere 100 μL di medium 1 x 199 (M199, vedi tabella materiali) + 1,5% sale di sodio carbossimetilcellulosa (CMC) bassa viscosità + 2% FCS contenente pen/strep a ciascun pozzetto.
        Nota: 2 x M199 + 4% FCS + pen/strep del 2% e 3% CMC soluzioni devono essere preparati in anticipo e conservato a 4 ° C per un uso futuro. Assicurarsi che la soluzione viene riscaldata a 37 ° C prima di aggiungere alle piastre.
        1. Preparare la soluzione di x M199 2: 1 bustina/500 mL di acqua distillata acqua + 20 mL FCS + penna 10ml/strep (compongono 2 x MI99). Filtrare la soluzione utilizzando un'unità filtrante di 0.22 μm.
        2. Per la preparazione di 3% CMC, aggiungere 15 g di CMC lentamente in 500 mL di acqua distillata. Sciogliere la CMC in acqua tramite riscaldatore metallico agitatore a 50 ° C, che dura circa 1 h di preparazione. Mix bene a fare 3% CMC ed autoclave la soluzione.
          Nota: La CMC solida deve essere aggiunto all'acqua al fine di essere sciolto; l'aggiunta di acqua al solido secco produce un "ciuffo" di solido che è molto difficile da sciogliere.
        3. Preparare 1 x M199 + 1,5% a bassa viscosità CMC + 2% FCS contenente pen/strep di miscelazione 1:1 2x M199 e 3% CMC preparata al punto 1.2.2.4.2.
      5. Incubare la piastra per 3 giorni a 37 ° C, 5% CO2.
  3. Lo sviluppo di piastra di test e analisi (giorno 5)
    1. Fissazione e sviluppo analisi piastra
      1. Scartare M199 + CMC + 2% FCS contenente pen/strep capovolgendo delicatamente la piastra. Aggiungere lentamente (per evitare di disturbare lo strato delle cellule) 200 μL di tampone di fissazione (80% di acetone, 20% PBS, conservati a-20 ° C) per fissare le cellule. Incubare a-20 ° C per 20 min.
      2. Scartare il buffer di fissazione e asciugare delicatamente il foglio di carta assorbente. Lasciare il viso piatto fino a secco per 10 min.
        Nota: Da questo punto in poi, analisi possono essere eseguita di fuori della cappa BSL2.
      3. Preparare soluzione bloccante diluente di latte 5% in PBS filtrato contenente 0,05% polisorbato 20 (PBS-polisorbato, Vedi Tabella materiali). Per una piastra, calcolare il volume necessario per blocco basato su pozzi 200/bene e 110: 200/pozzetto x 110 pozzi = 22 mL (1,1 mL concentrato di latte diluente a 20,9 mL filtrato PBS-polisorbato). In questa fase, inoltre compongono sufficiente soluzione bloccante per anticorpi primari e secondari. Per una piastra, calcolare il volume necessario per ogni soluzione di anticorpo basata su pozzi/50 e 110: 110 pozzi x 50/ben = 5,5 mL. Di conseguenza, il volume totale di latte diluente soluzione necessaria per l'analisi di una singola piastra di blocco è 33 mL.
      4. Aggiungere 200 /well di soluzione bloccante. Incubare la piastra a temperatura ambiente (TA) per 30 min. scartare la soluzione capovolgendo delicatamente la piastra e asciugare su carta assorbente.
      5. Preparare l'anticorpo di capra X RSV 1: 500 (mAb – anticorpo primario) diluito in soluzione di blocco. Aggiungere 50 /well della soluzione mAb e incubare a 37 ° C per 1 h. piastra lavare 3 volte con PBS-polisorbato filtrata.
      6. Preparare asino di Alexa Fluor 1:5,000 anti-capra IgG (anticorpo secondario) diluito in soluzione di blocco. Aggiungere 50 /well della soluzione anticorpo secondario e incubare a 37 ° C per 1 h. piastra di lavare 5 volte con PBS-polisorbato filtrata.
      7. Leggere la piastra su un lettore di macchie automatizzati utilizzando il canale di fluoresceina isotiocianato (FITC) e contare le impostazioni come mostrato nella Figura 2. Piastra di avvolgere in un foglio e conservare a 4 ° C. Tarare lo strumento utilizzando una piastra 96 pozzetti inutilizzati e l'immissione delle impostazioni di conteggio prima del dosaggio.
        Nota: Ri-scansione entro pochi giorni è possibile se necessario. La calibrazione e l'impostazione di conteggio può essere salvati e utilizzati per la futura scansione se il dosaggio viene utilizzato lo stesso tipo di piastra utilizzata per la calibrazione.
      8. Controllare le immagini di pozzi per manufatto placche o strati monomolecolari della cellula perturbato (Figura 3). Escludere i pozzetti con strati monomolecolari della cellula perturbato.
        Nota: A seconda delle dimensioni delle placche dell'oggetto, potrebbero essere necessario essere eseguita per quei pozzi conteggi manuali o quei pozzi potrebbero essere necessario essere scartato dall'analisi dei dati. Criteri per un risultato valido includere nessun perturbato cella monostrato o manufatto placche rilevate in più di una replica ben e nessun PFU rilevato nei pozzetti negativi (pozzi senza virus aggiunto).
    2. Determinare le concentrazioni di virale
      1. Scegliere le ultime due diluizioni dove macchie possono essere conteggiati chiaramente. Calcolare il numero medio di macchie dai pozzi di replicare con la stessa diluizione. Calcolare il titolo virale (PFU / mL) del campione d'archivio utilizzando la seguente formula:
        PFU/mL = numero medio di placche / (fattore di diluizione × Volume di virus diluito aggiunto al pozzo)
        Nota: La concentrazione di virus determinata per ogni stock di RSV ora può essere utilizzata nell'analisi della PRN (passaggio 2).

2. analisi di neutralizzazione RSV

  1. Semina le piastre (1 giorno)
    1. Risospendere le cellule A549 in DMEM + 10% FCS + 1000 IU pen/strep a 4 x 105/ml. Piastre sterili seme 96 pozzetti a fondo piatto con 100 μL/pozzetto contenente 4 x 104 A459 cellule e incubare le piastre durante la notte a 37 ° C, 5% CO2 (cellule sarà la crescita di registro-fase).
      Nota: Utilizzare nuovo flacone di cellule A549 dopo 23 passaggi. Non è consigliabile utilizzare cellule A549 prima numero di passaggio 3.
  2. Preparazione del siero e virus (giorno 2)
    Nota: A seconda del tipo di campione, ci sono passaggi necessari per la pre-elaborazione campioni prima del dosaggio di NAb. Si consiglia di utilizzare i sieri standard internazionali di RSV che sono ora disponibili su richiesta dell'Istituto nazionale per gli standard biologici e controlli (NIBSC).
    1. Preparazione della diluizione del siero
      1. Scongelare l'antisiero di riferimento umano RSV (siero di riferimento, REF) e siero test campioni a RT. calore-inattivare i campioni di siero e riferimento antisiero in un bagno di acqua a 56 ° C per 30 min prima dell'uso. Preparare diluizioni secondo il modello di piastra (Figura 4).
      2. Preparare la diluizione 1: 100 di preparare il Rif. un minimo di 110 μL di REF diluito in DMEM + pen/strep senza FCS per piastra di dosaggio (ad esempio, 1.5 μL di REF in un volume totale di 150 µ l). Aggiungere 110 μL di 1: 100 diluito REF in A12 bene di un fondo U 96 pozzetti piastra sterile.
      3. Aggiungere 55 μL di DMEM + pen/strep senza FCS pozzetti B12 a H12 nella colonna 12. Eseguire diluizioni 1:2 giù la piastra serie trasferendo μL 55 da riga A riga B, soluzione di miscelazione di pipettaggio contenuto su e giù per 5 volte e continuando fino alla riga H. scartare il μL 55 finale dei media affinché il volume finale in ciascuna è ben 55 μL. Utilizzare nuovi suggerimenti per ogni diluizione.
      4. Preparare la diluizione 1: 100 del siero campioni di prova. Come tutti i campioni di siero sono analizzati in triplice copia, preparare un volume minimo di μL/pozzetto 110 x 3 = 330 µ l per campione di siero.
      5. Aggiungere 110 µ l di ogni campione di siero diluito (1: 100; S1 = siero 1, S2 = siero 2, ecc.) ai rispettivi pozzetti A1 a A9 e anche E1 a E9 della piastra 96 pozzetti sterile secondo Figura 4.
      6. Aggiungere 55 μL di DMEM + pen/strep senza FCS in tutti i pozzetti etichettati X. Perform seriale diluizioni 1:2 secondo passaggio 2.2.1.3 fino alla riga D (per campioni 1, 2 e 3). Scartare il μL 55 finale dei media di modo che il volume finale in ciascun pozzetto è 55 μL. Allo stesso modo, eseguire il seriale diluizioni 1:2 per esempi 4, 5 e 6 per le righe E a H.
        Nota: È importante utilizzare nuovi suggerimenti per ogni diluizione.
      7. Aggiungere 55 μL di DMEM + pen/strep senza FCS pozzetti nelle colonne 10 e 11.
    2. Preparazione di virus
      1. Scongelare rapidamente un singolo flaconcino congelato di RSV in un bagnomaria a 37 ° C fino a quando quasi completamente scongelati e mettere immediatamente sul ghiaccio.
      2. Diluire il virus in DMEM + pen/strep senza FCS basato sulla concentrazione dell'aliquota RSV determinato al punto 1.3.2. Applicare una diluizione che dà circa 200 PFU/pozzetto. Preparare un volume totale di 5,5 mL (per 100 pozzi).
    3. Preparazione della miscela di virus-siero
      1. Aggiungere 55 del virus diluito a tutti i pozzetti delle colonne 1-9 e pozzi di righe E-H di colonne 10 e 11 (controllo positivo) secondo il modello di piastra (Figura 4).
      2. Aggiungere 55 di DMEM + pen/strep senza FCS in tutti i pozzetti di righe A-D di colonne 10 e 11 (controllo negativo). Incubare la piastra per 1 h a 37 ° C, 5% CO2.
    4. Inoculazione del virus alle cellule A549
      1. Prima del completamento del periodo di incubazione, recuperare A549 cell plate(s) preparata al punto 2.1.1. Assicurarsi che i monostrati di cellule umane A549 in piastre da 96 pozzetti siano ~ 80% confluenti.
      2. Gettare il terreno capovolgendo delicatamente piastra e leggermente macchiare il foglio di carta assorbente sterile. Lavare due volte tutti i pozzetti con 100 μL di PBS, eliminare l'eccesso di PBS capovolgendo delicatamente piastra e leggermente macchiare il foglio di carta assorbente sterile dopo ogni lavaggio. Non consentire piastre ad asciugare.
      3. Trasferire 100 /well della miscela siero-virus ai pozzetti corrispondenti sulla piastra delle cellule A549 seguendo il modello di piastra Incubare la piastra per 1 h a 37 ° C, 5% CO2.
      4. Dopo 1 h, utilizzando una pipetta, prendere 90/bene e aggiungere 100 di preriscaldata 1x M199 + 1,5% CMC + 2% FCS + pen/strep. Incubare la piastra per 3 giorni a 37 ° C, 5% CO2.
        Nota: Assicurarsi che la soluzione viene riscaldata a 37 ° C prima di aggiungere alle piastre.
  3. Lo sviluppo di piastra di test e analisi (giorno 5)
    1. Sviluppare la fissazione e l'analisi lastra 1.3.1.1 a 1.3.1.8 come segue.
    2. Determinare il titolo di neutralizzazione del 50%
      1. Determinare che il titolo di neutralizzazione del 50% calcolando la distanza proporzionale tra le diluizioni di siero reciproco sopra e sotto il 50% del controllo 'nessun siero' pozzi (controllo positivo del virus - colonna 10, righe E-H).
      2. Contare il numero di PFU (cioè, placche) derivanti da infezioni virali individuali nei pozzi del siero e nessun controllo del siero. Calcolare il numero medio di PFU nei pozzetti di controllo senza siero e determinare il valore di 50%.
      3. Identificare le diluizioni del siero con conteggi che sono immediatamente sopra e sotto il valore di 50% nei pozzetti di controllo senza siero. Utilizzando un modello di foglio di calcolo o grafico semi-log, tracciare il numero di PFU su asse x (scala lineare) e la diluizione del siero reciproco sull'asse y (scala logaritmica10 ). Tracciare una linea tra i due punti e leggere i titoli di neutralizzazione del 50% del test i campioni del siero da questa linea.
        Nota: Il foglio di lavoro test RSV PRN (Foglio di lavoro complementare) viene utilizzato per determinare il titolo di neutralizzazione del 50%.

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Risultati

La titolazione di uno stock di virus è stata effettuata da 01:10 a 01:108 diluizione per determinare la concentrazione di stock di virus prima del dosaggio del PRN (risultati rappresentativi illustrati nella Figura 5). Dalla Figura 5, PFU può contare in modo affidabile alle diluizioni di 01:104 e 01:105. È stato calcolato il numero medio di PFU da pozzi triplici con la stessa diluizione. Poich?...

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Discussione

Abbiamo sviluppato e ottimizzato un'analisi di micro-neutralizzazione di RSV semplice ed efficiente che può essere facilmente adattata nella maggior parte dei laboratori. Questo test è in grado di misurare la capacità di infezione virale così come l'inibizione di infezione virale di NAb a livello cellulare mediante scansione immagine automatizzata di misura. L'uso di una piattaforma basata su formazione immagine e sistemi basati su anticorpi specifici ha aumentato la specificità e la sensibilità di rilevazione spot...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano tutti i partecipanti coinvolti. Riconosciamo il programma di supporto dell'infrastruttura operativa del governo vittoriano. PVL è un destinatario NHMRC carriera sviluppo Fellowship.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell line
A549ATCCCCL-185provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2ATCCVR-1540lot number 60430286
Reagents
AcetoneMerck1000142511
Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C)Life TechnologiesA11055
CMC sodium salt powderSigma-AldrichC5678-500G
DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C)Scientific Services – Tissue CultureMCRI in house supply
Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C)InterpathSFBS-F
Goat X RSV antibodyMerckAB1128
human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C)BEI ResourcesNR-4022Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)
M199 powderLife Technologies31100035
Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C)Australian Biosearch50-82-01
Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C)Life Technologies15140122
s.d.H2O from Milli-Q dispenserMerckIn-house dispensation
Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C)Scientific Services – Tissue CultureMCRI in house supply
Tween 20 polysorbateSigma-Aldrich9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL)Invitro TechnologiesFAL352070
Filter unit 0.22 μm (500 mL)Thermo FisherNAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL)Australia PLAM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid)Interpath655180
Sterile U-bottom plates (96-well with lid)Interpath650180
5 mL serological pipetteSigma-AldrichCLS4487-200EA
10 mL serological pipetteInterpath607180
25 mL serological pipetteSigma-AldrichCLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960Fisher BiotecTF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000Fisher BiotecTF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001Fisher BiotecTXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader systemAID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007

Riferimenti

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