Eine verbesserte und hohen Durchsatz Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-Neutralisation Assay

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt einen hohen Durchsatz, Imaging-basierte Mikro-Neutralisation Assay der Titer von neutralisierende Antikörper spezifisch für respiratory syncytial Virus (RSV) zu bestimmen. Dieser Assay-Format wurde auf verschiedenen Probenarten getestet.

Zusammenfassung

Respiratory syncytial Virus-spezifischen neutralisierenden Antikörper (RSV NAbs) sind ein wichtiger Marker der Schutz gegen RSV. Eine Reihe von verschiedenen Assay-Formate sind derzeit weltweit im Einsatz so gibt es eine Notwendigkeit für eine präzise und Hochdurchsatz-Methode zur Messung der RSV NAbs. Wir beschreiben hier einen Imaging-basierte Mikro-Neutralisation-Assay, der auf RSV Untergruppe A getestet wurde und kann auch für RSV Untergruppe B und verschiedenen Probentypen angepasst werden. Diese Methode ist sehr reproduzierbar, mit Inter-Assay-Variationen für den Referenz-Antiserum wird weniger als 10 %. Wir glauben, dass dieser Test leicht in vielen Laboren weltweit relativ kostengünstig hergestellt werden kann. Entwicklung einer verbesserten, Hochdurchsatz-Assays, die RSV NAbs misst ist ein bedeutender Schritt nach vorn für die Standardisierung von dieser Methode international als entscheidend für die Bewertung der neuartigen RSV Impfstoffkandidaten in der Zukunft.

Einleitung

Respiratory syncytial Virus (RSV) ist die führende Ursache von Infektionen der unteren Atemwege in der pädiatrischen Population weltweit¹. Trotz seiner hohen Belastung gibt es noch keine Impfung oder Behandlung zur Verfügung. Seit 2013 hat die Weltgesundheitsorganisation (WHO) RSV Impfstoffentwicklung vorrangig Großforschungseinrichtungen, mit jährlichen WHO Beratung treffen^2,3erklärt. Die WHO hat vereinbart mit RSV neutralisierenden Antikörpern (NAb) Messung Impfstoff Immunogenität, zu überwachen, wie dies als großen serologische Marker für Schutz⁴erkannt wird. Jonas wurden zum Schutz vor schweren RSV-Infektion in einer Reihe von Studien, sowie klinischen Studien mit Anti-RSV monoklonalen Antikörper Palivizumab, derzeit nur prophylaktische Strategie zur Verfügung⁴gezeigt.

Es gibt mehrere NAb Assay Formate von Laboratorien weltweit, einschließlich der Zelle und molekulare-basierte Assays, die Standardisierungsbemühungen^5,6,7,8herausfordernde gemacht haben. Die Plaque-Reduzierung der konventionellen Neutralisation (PRN) Assay, der die Anzahl der reduzierten Plaque bilden Einheiten (PFU) durch die Anwesenheit von einer RSV-spezifischen Antikörper misst bleibt jedoch noch der Goldstandard-⁹. Hier berichten wir über ein verbessertes, vereinfachte und Hochdurchsatz-PRN-Protokoll, das auf zahlreichen Zelllinien für RSV-Sorten und mit erhöhten Assay Durchsatz verwendet werden kann. Dieses Protokoll wurde mit klinischen Proben aus verschiedenen Einstellungen sowie an Proben aus Tiermodell Experimenten getestet.

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Protokoll

Hinweis: Alle Schritte müssen in einer BSL2 Haube durchgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Virale Titration ist erforderlich im Vorfeld einer PRN-Test zur Bestimmung der optimalen RSV-Konzentration in der PRN-Assay verwendet. Es empfiehlt sich, aliquoten die Virus-Bestände in einem kleinen Volumen, die einmal aufgetaut und für jede NAb-Assay verwendet werden. Mit der gleichen virale bestand für alle NAb-Assays für alle Proben aus einer Studie durchgeführt wird auch empfohlen. Stellen Sie sicher, Kultur, Medien und Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ist bei 37 ° C erwärmt, bevor Sie Zellplatten hinzufügen.

1. RSV virale Titration

Hinweis: Je nach Virus-Bestände und die Anzahl der Duplikate kann die Assay-Platte gemäß Abbildung 1eingerichtet werden. Jeder Virus-Aktie sollte in dreifacher Ausfertigung der Assay-Platte, beginnend bei der höchsten virale Konzentration (d.h., 01:10) titriert. Serielle Titrationen können in der Regel werden 01:10. A549 Zellkultur sowie Wartung und RSV Kultur Verfahren erfolgt mit standard-Verfahren und sind in diesem Protokoll nicht enthalten.

1. Aussaat von Platten (Tag1)
   1. Aufschwemmen Sie A549 Zellen in Dulbeccos geändert Eagles Medium (DMEM) + 10 % fetalen Kälberserum (FCS) + 1000 IU Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) auf 4 x 10⁵/mL. Saatgut-96-Well flach-Boden sterilen Platten mit 100 μl/Well, 4 x 10⁴ A459 Zellen enthält.
   2. Platten über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO₂ inkubieren (Zellen werden in der Log-Phase Wachstum).
      Hinweis: Verwenden Sie neue A549 Zellen Fläschchen nach 23 Passagen. Es wird nicht gestartet die Experimente empfohlen, wenn eine neue Zelle Ampulle noch in den ersten drei Passagen.
2. Virus-Infektion (Tag2)
   1. Vorbereitung des Virus serielle Verdünnung
      1. Tauen Sie schnell ein einzelnes gefrorenen Fläschchen RSV in einem 37 ° C Wasserbad bis fast vollständig aufgetaut und sofort auf Eis. Bereiten Sie 3 Wiederholungen für jede RSV Virus Lager geprüft werden, verwenden eine anfängliche Virus Lager Verdünnung von 01:10 mit 100 μL der verdünnten Virus/gut und reservieren Sie mindestens eine Spalte für die negativ-Kontrolle.
         Hinweis: Abbildung 1 zeigt negative Kontrolle in Triplicates.
      2. Fügen Sie 100 μL jeder verdünnte Virus am 01:10 in dreifacher Ausfertigung der Reihe A von einer 96-Well U-Boden steril Teller. Reihen B, H. 90 μL/Well DMEM + 1000 IU Pen/Strep ohne FCS hinzufügen
      3. Führen Sie serielle 01:10 Verdünnungen unten die Platte durch die Übertragung von 10 μL von Reihe A r. B. Mix Lösung durch Pipettieren Inhalt nach oben und unten 5 Mal und die zehnfache Verdünnungen bis Reihe H. verwerfen die letzten 10 μL fortsetzen, so dass das Endvolumen in jedem gut 90 μL.
         Hinweis: Es ist wichtig, neue Tipps für jede Verdünnung verwenden.
   2. Virus Impfung A549 Zellen
      1. Abrufen von A549 Cell plate(s) am Vortag vorbereitet. Sicherstellen Sie, dass A549 Zellen Monoschichten in 96-Well-Platten ~ 80 % Zusammenfluss. Verwerfen Sie Medien durch die Platte vorsichtig umdrehen und leicht auf sterile saugfähigen Papiertuch abtupfen.
      2. Waschen Sie alle Vertiefungen mit 100 μl PBS zweimal, entsorgen Sie überschüssiges PBS durch Platte vorsichtig umdrehen und leicht beflecken auf sterile saugfähigen Papiertuch nach jedem Waschen. Lassen Sie Platten zum Trocknen nicht zu.
      3. Übertragen Sie die Virus-Verdünnungen von der viralen Titration Platte (Abbildung 1) in entsprechenden Vertiefungen auf A549 Zellplatte. Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO₂. Dekantieren Sie nach 1 h Inkubation Überstände mit einer Pipette (zur Vermeidung von Kreuzkontamination). Nehmen Sie 90 μL/gut.
      4. Hinzufügen von 100 μl 1 X Medium 199 (M199, siehe Tabelle der Materialien) + 1,5 % Natriumsalz Carboxymethylcellulose (CMC) geringe Viskosität + 2 % FCS mit Pen/Strep in jede Vertiefung.
         Hinweis: 2 x M199 + 4 % FCS + 2 % Pen/Strep und 3 % CMC Lösungen müssen im Voraus vorbereitet und bei 4 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert werden. Stellen Sie sicher, dass die Lösung bei 37 ° C erwärmt wird, bevor Sie zu Platten hinzufügen.
         1. Bereiten Sie 2 x M199 Lösung: 1 Beutel/500 mL destilliertes Wasser + 20 mL FCS + 10 mL Pen/Strep (zu 2 x MI99). Filtern Sie die Lösung mit einer 0,22 μm-Filter-Einheit.
         2. Für die Zubereitung von 3 % CMC, 15 g CMC langsam in 500 mL destilliertem Wasser hinzugeben. Auflösen der CMC im Wasser mithilfe von metallischen Rührer Heizung bei 50 ° C, ca. 1 h Vorbereitung führt. Mischung gut zu 3 % CMC und Autoklaven die Lösung.
            Hinweis: Die CMC solide muss zu dem Wasser hinzugefügt werden, um aufgelöst werden; Zugabe von Wasser zu den trockenen Volumenkörper erzeugt ein "Büschel" Festkörper, der sehr schwer zu lösen ist.
         3. Bereiten Sie 1 x M199 + 1,5 % CMC niedrige Viskosität + 2 % FCS Pen/Strep durch das Mischen von 1:1 mit 2 x M199 und 3 % CMC im Schritt 1.2.2.4.2 vorbereitet.
      5. 3 Tage bei 37 ° C, 5 % CO₂inkubieren Sie Platte.
3. Entwicklung von Assays Platte und Analyse (Tag 5)
   1. Fixierung und entwickelnden Assay-Platte
      1. M199 + CMC + 2 % FCS mit Pen/Strep durch vorsichtig umdrehen der Plattenrandes zu verwerfen. Fügen Sie langsam (zur Vermeidung von stören die Zellschicht) 200 μL der Fixierung Puffer (80 % Aceton, 20 % PBS, bei-20 ° C gelagert), Zellen zu beheben. Bei-20 ° C für 20 min inkubieren.
      2. Verwerfen des Fixierung-Puffers und Tupfen auf saugfähigem Papierhandtuch. Plattenfläche zu verlassen bis zu 10 min trocknen lassen.
         Hinweis: Von diesem Schritt ab kann Assay außerhalb der BSL2 Haube durchgeführt werden.
      3. Bereiten Sie 5 % Milch Verdünnungsmittel blockierende Lösung in gefilterten PBS mit 0,05 % Polysorbat 20 (PBS-Polysorbat, siehe Tabelle der Materialien). Für eine Platte, berechnen Sie das Volumen für Sperrung auf 200/gut und 110 Brunnen basiert benötigt: 200/Well X 110 Brunnen 22 mL = (1,1 mL konzentrierte Milch in 20,9 mL diluent gefiltert PBS-Polysorbat). In diesem Stadium auch ausreichend blockierende Lösung für primäre und sekundäre Antikörper bilden. Für eine Platte, berechnen Sie das Volumen für jeden Antikörperlösung auf Basis von 50/gut und 110 Brunnen benötigt: 50/gut X 110 Brunnen = 5,5 mL. Daher ist das Gesamtvolumen der Milch Verdünnungsmittel blockiert Lösung für eine einzelne Platte Assay erforderliche 33 mL.
      4. Fügen Sie 200 /well von blockierenden Lösung. Inkubieren Sie Platte bei Raumtemperatur (RT) 30 min. verwerfen die Lösung durch die Platte vorsichtig umdrehen und auf saugfähiges Küchenpapier Tupfen.
      5. Bereiten Sie 1: 500 X RSV Ziege Antikörper (mAb-Primärantikörper) verdünnt in blocking-Lösung vor. Fügen Sie 50 /well der mAb-Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 1 h waschen Platte 3 Mal mit gefilterten PBS-Polysorbat.
      6. Bereiten Sie 1:5,000 Alexa Fluor Esel Anti-Ziege IgG (Sekundärantikörper) verdünnt in blocking-Lösung vor. Fügen Sie 50 /well der Sekundärantikörper Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 1 h waschen Platte 5 Mal mit gefilterten PBS-Polysorbat.
      7. Lesen Sie Platte auf einem automatisierten Flecken Reader mit dem Fluorescein erfolgt (FITC) Channel zu und zählen Sie Einstellungen wie in Abbildung 2dargestellt. Platte in Folie wickeln und bei 4 ° c lagern Kalibrieren Sie das Gerät mit einer nicht verwendeten 96-Well-Kultur-Platte und Eingabe Anzahl Einstellungen vor dem Test.
         Hinweis: Innerhalb von wenigen Tagen zu scannen ist möglich, wenn erforderlich. Die Kalibrierung und Graf Einstellung können gespeichert und verwendet für die zukünftigen Scans, wenn der Test die gleiche Art von Platte, die für die Kalibrierung verwendet verwendet werden.
      8. Überprüfen Sie die Bilder der Brunnen für Artefakt Plaques oder gestörte Zelle Monoschichten (Abbildung 3). Brunnen mit gestörten Zelle Monolagen auszuschließen.
         Hinweis: Abhängig von der Größe der Artefakt Plaques manuelle Zählungen können für diese Brunnen durchgeführt werden müssen oder die Brunnen müssen aus der Datenanalyse verworfen werden. Kriterien für ein gültiges Ergebnis sind keine gestörten Zelle Monolage oder Artefakt Plaques in mehr als eine Wiederholung gut erkannt und keine PFU in negativen Brunnen (Brunnen ohne zusätzlichen Virus) nachgewiesen.
   2. Virale Konzentrationen zu bestimmen
      1. Wählen Sie die letzten beiden Verdünnungen, wo die Flecken deutlich gezählt werden kann. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Spots von replizieren Wells in der gleichen Verdünnung. Berechnen Sie die virale Titer (PFU pro mL) der Lager Probe mit Hilfe der folgenden Formel:
         PFU/mL = durchschnittliche Anzahl von Plaketten / (Verdünnung Faktor × Volumen des verdünnten Virus hinzugefügt, um den Brunnen)
         Hinweis: Der Viruskonzentration bestimmt für jede Aktie RSV kann jetzt in der PRN-Assay (Schritt 2) verwendet werden.

2. RSV Neutralisation Assay

1. Aussaat von Platten (Tag1)
   1. Aufschwemmen Sie A549 Zellen in DMEM + 10 % FCS + 1000 IU Pen/Strep auf 4 x 10⁵/mL. Saatgut-96-Well flach-Boden sterilen Platten mit 100 μl/Well mit 4 x 10⁴ A459 Zellen und inkubieren Sie Platten über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO₂ (Zellen werden in der Log-Phase Wachstum).
      Hinweis: Verwenden Sie neue A549 Zellen Fläschchen nach 23 Passagen. Es wird nicht empfohlen, A549 Zellen vor Durchgangsnummer 3 zu verwenden.
2. Virus und Serum-Vorbereitung (Tag2)
   Hinweis: Je nach Probentyp sind die erforderlichen Schritte für die Vorverarbeitung Proben vor der NAb-Assay. Es wird empfohlen, die RSV internationale standard Sera zu verwenden, die jetzt auf Anfrage vom nationalen Institut für biologischen Standards und Kontrollen (NIBSC) erhältlich sind.
   1. Vorbereitung der Serum-Verdünnung
      1. Auftauen der menschlichen RSV Referenz Antiserum (Referenz Serum, REF) und Serum Proben bei RT Hitze inaktivieren Serumproben und Antiserum in einem Wasserbad bei 56 ° C für 30 min vor dem Gebrauch zu verweisen. Bereiten Sie Verdünnungen gemäß der Platte Vorlage (Abbildung 4).
      2. Vorbereitung 1: 100 Verdünnung von der Ref-Vorbereitung mindestens 110 μL der REF verdünnt in DMEM + Pen/Strep ohne FCS pro Assay Platte (z.B., 1,5 μL der REF in einem Gesamtvolumen von 150 μL). Fügen Sie 110 μL von 1: 100 verdünnt REF in gut A12 von einer 96-Well U-Boden steril Teller.
      3. Vertiefungen B12 H12 in Spalte 12 55 μL DMEM + Pen/Strep ohne FCS hinzufügen. Durchführen Sie serielle Verdünnungen von 1:2 nach unten die Platte durch Übertragung von 55 μL von Reihe A, Reihe B, mixing-Lösung durch Pipettieren Inhalt nach oben und unten 5 Mal und weiter bis Reihe H. verwerfen die endgültige 55 μL der Medien so, dass das Endvolumen in jedem gut 55 μL. Verwenden Sie neue Tipps für jede Verdünnung.
      4. 1: 100 Verdünnung des Serums Testproben vorbereiten. Wie alle Serumproben in dreifacher Ausfertigung untersucht sind, bereiten Sie ein Mindestvolumen von 110 μl/Well x 3 = 330 μl pro Test Serumprobe.
      5. Fügen Sie 110 μL jeder verdünnte Serum Test Probe (1: 100; S1 = Serum 1, S2 = Serum 2, etc..) in entsprechenden Vertiefungen A1 bis A9 und auch E1 bis E9 der sterilen 96-Well Platte gemäß Abbildung 4.
      6. Fügen Sie 55 μL der DMEM + Pen/Strep ohne FCS in alle Vertiefungen gekennzeichnet X. Perform serielle Verdünnungen von 1:2 nach Schritt 2.2.1.3 bis Reihe D (für Proben 1, 2 und 3). Die letzten 55 μL der Medien zu verwerfen, so dass das Endvolumen in jede Vertiefung 55 μL. Ebenso führen der serielle Verdünnungen von 1:2 für Proben, 4, 5 und 6 Zeilen E bis H.
         Hinweis: Es ist wichtig, neue Tipps für jede Verdünnung verwenden.
      7. Brunnen in den Spalten 10 und 11 55 μL DMEM + Pen/Strep ohne FCS hinzufügen.
   2. Vorbereitung des virus
      1. Tauen Sie schnell ein einzelnes gefrorenen Fläschchen RSV in einem 37 ° C Wasserbad bis fast vollständig aufgetaut und sofort auf Eis.
      2. Verdünnen Sie Virus in DMEM + Pen/Strep ohne FCS anhand der Konzentration der RSV aliquoten bestimmt im Schritt 1.3.2. Anwenden einer Verdünnung, die etwa 200 PFU/Brunnen gibt. Bereiten Sie ein Gesamtvolumen von 5,5 mL (für 100 Brunnen).
   3. Vorbereitung der Virus-Serum-Mischung
      1. 55 des verdünnten Virus hinzu kommen alle Brunnen der Spalten 1 bis 9 und Brunnen von Stützenreihen E-H 10 und 11 (Positivkontrolle) entsprechend der Platte Vorlage (Abbildung 4).
      2. Alle Brunnen der Zeilen A-D Spalten 10 und 11 (Negativkontrolle) 55 DMEM + Pen/Strep ohne FCS hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO₂.
   4. Virus Impfung A549 Zellen
      1. Rufen Sie vor der Fertigstellung der Inkubationszeit A549 Cell plate(s) in Schritt 2.1.1 vorbereitet ab. Sicherstellen Sie, dass A549 Zellen Monoschichten in 96-Well-Platten ~ 80 % Zusammenfluss.
      2. Verwerfen Sie Medien durch die Platte vorsichtig umdrehen und leicht auf sterile saugfähigen Papiertuch abtupfen. Waschen Sie alle Vertiefungen mit 100 μl PBS zweimal, entsorgen Sie überschüssiges PBS durch Platte vorsichtig umdrehen und leicht beflecken auf sterile saugfähigen Papiertuch nach jedem Waschen. Lassen Sie Platten zum Trocknen nicht zu.
      3. Übertragen Sie 100 /well die Virus-Serum-Mischung in die entsprechenden Vertiefungen auf A549 Zellplatte nach der Platte Vorlage Inkubation der Platte für 1 h bei 37 ° C, 5 % CO₂.
      4. Nach 1 h, mit einer Pipette, 90/gut herausnehmen und fügen Sie vorgewärmt 100 1 x M199 + 1,5 % CMC + 2 % FCS + Pen/Strep. 3 Tage bei 37 ° C, 5 % CO₂inkubieren Sie Platte.
         Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Lösung bei 37 ° C erwärmt wird, bevor Sie zu Platten hinzufügen.
3. Entwicklung von Assays Platte und Analyse (Tag 5)
   1. Fixierung und Assay Platte folgende Schritte 1.3.1.1 zu 1.3.1.8 zu entwickeln.
   2. Die 50 %-Neutralisation-Titer zu bestimmen
      1. Bestimmen Sie die 50 %-Neutralisation-Titer durch die Berechnung der proportionalen Abstand zwischen die gegenseitige Serum Verdünnungen oben und unter 50 % des Steuerelements "kein Serum" (positive Virus Control - Spalte 10, Zeilen E-H) Brunnen.
      2. Die Anzahl der PFU (d.h. Plaketten) aus einzelnen Virusinfektionen in Serum Brunnen und kein Serum-Kontroll-Vertiefungen. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von PFU die kein Serum-Kontroll-Vertiefungen und bestimmen Sie den Wert von 50 %.
      3. Serum-Verdünnungen mit zählt die unmittelbar oberhalb und unterhalb der 50 % des Wertes des die kein Serum-Kontroll-Vertiefungen sind zu identifizieren. Mit einem semi-log Graph oder Arbeitsblattvorlage, zeichnen Sie die Anzahl der PFU auf der x-Achse (lineare Skala) und die gegenseitige Serum Verdünnung auf der y-Achse (Log₁₀ Skala). Zeichnen Sie eine Linie zwischen den beiden Punkten und lesen Sie 50 % Neutralisation Titer des Tests Serumproben aus dieser Linie zu.
         Hinweis: RSV PRN-Assay-Arbeitsblatt (Ergänzende Arbeitsblatt) wird verwendet, um die 50 %-Neutralisation-Titer zu bestimmen.

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Ergebnisse

Die Titration einer Virus-Aktie wurde durchgeführt von 01:10, 01:10⁸ Verdünnung der Viruskonzentration Lager vor der PRN-Assay (repräsentative Ergebnisse in Abbildung 5dargestellten) zu bestimmen. Aus Abbildung 5, PFU gezählt werden kann zuverlässig bei Verdünnungen von 01:10⁴ und 01:10⁵. Die durchschnittliche Anzahl der PFU aus dreifacher Brunnen bei der gleichen Verdünnung wurde berechnet...

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Diskussion

Wir haben entwickelt und optimiert, einen einfachen und effizienten RSV Mikro-Neutralisation-Assay, der leicht in den meisten Labors angepasst werden kann. Dieser Assay ist in der Lage, Virusinfektion Fähigkeit sowie die Messung der Hemmung der viralen Infektion durch NAb auf zellulärer Ebene mit computerisierten Bild scannen zu messen. Die Verwendung von einer Imaging-basierten Plattform und spezifische Antikörper-basierten Systeme ist die Spezifität und Sensitivität der Spoterkennung im Vergleich zu herkömmlichen...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell line
A549	ATCC	CCL-185	provided by Dr Keith Chappell, University of Queensland
Viral strains
RSV A2	ATCC	VR-1540	lot number 60430286
Reagents
Acetone	Merck	1000142511
Alexa-Fluor donkey anti-goat IgG (stored at 4 °C)	Life Technologies	A11055
CMC sodium salt powder	Sigma-Aldrich	C5678-500G
DMEM (no serum, 3.7 g/L NaHC, P/S) (stored at 4 °C)	Scientific Services – Tissue Culture		MCRI in house supply
Foetal calf Serum (stored in 50 mL aliquots at -20 °C)	Interpath	SFBS-F
Goat X RSV antibody	Merck	AB1128
human polyclonal antiserum to respiratory syncytial virus (RSV) (stored in 45 µL aliquots at -20 °C)	BEI Resources	NR-4022	Free order through BEI Resources upon registration. This serum belong to a panel of human antiserum and immune globulin to RSV (NR-32832)
M199 powder	Life Technologies	31100035
Milk diluent blocking solution (stored at 4 °C)	Australian Biosearch	50-82-01
Penicillin/Streptomycin (stored in 6mL aliquots at -20 °C)	Life Technologies	15140122
s.d.H2O from Milli-Q dispenser	Merck		In-house dispensation
Sterile 1x PBS for culture (stored at 4 °C)	Scientific Services – Tissue Culture		MCRI in house supply
Tween 20 polysorbate	Sigma-Aldrich	9005-64-5
General Consumables
Conical Falcon tubes (50 mL)	Invitro Technologies	FAL352070
Filter unit 0.22 μm (500 mL)	Thermo Fisher	NAL5660020
Sterile Eppendorf tubes (1.5 mL)	Australia PL	AM12400
Sterile flat-bottom plates (96-well with lid)	Interpath	655180
Sterile U-bottom plates (96-well with lid)	Interpath	650180
5 mL serological pipette	Sigma-Aldrich	CLS4487-200EA
10 mL serological pipette	Interpath	607180
25 mL serological pipette	Sigma-Aldrich	CLS4251-200EA
Tip Pipette 1-200 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960	Fisher Biotec	TF-200-L-R-S
Tip Pipette 5-20 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 96TIPS PKG960	Fisher Biotec	TF-20-L-R-S
Tip Pipette 100-1,000 µLClear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1000	Fisher Biotec	TF-1000-L-R-S
Tip Pipette 1-10 µL Clear Maxymum Recovery Racked Pre-sterilized 10RACKS x 100TIPS PKG1001	Fisher Biotec	TXLF-10-L-R-S
Equipments and softwares
ELISpot reader system	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
AID ELISpot software version 5.0	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasburg, Germany
Microsoft Excel 2007