Grabación simultánea de electrocardiografía y sangre invasiva presión medida en ratas

Resumen

Aquí, describimos una configuración para el registro simultáneo del electrocardiograma y presión arterial intrarterial (BP) en ratas experimentales, que se pueden hacer con equipo estándar en instalaciones y se pueden aplicar a fisiológico o farmacológico estudios para investigar los mecanismos patogénicos o terapéuticos en medicina cardiovascular.

Resumen

Para estudios relacionados con la fisiología cardiovascular o Fisiopatología, presión arterial (PA) y electrocardiografía son parámetros observacionales básicos. Investigación centrada en modelos de la enfermedad cardiovascular, potenciales dianas terapéuticas cardiovasculares o agentes farmacéuticos requiere una evaluación de cambios ritmo arteriales sistémicas de la presión y el corazón. En situaciones donde los sistemas de telemetría de radio no disponible o asequible, la técnica de canulación de la arteria femoral es una forma alternativa para obtener grabaciones de forma de onda de la presión intraarterial y mediciones sistémicas de BP. Esta técnica es económica y puede realizarse con el equipo estándar en instalaciones. Sin embargo, la grabación de la presión arterial invasiva requiere canulación de arterias pequeñas, que puede ser una desafiante habilidad quirúrgica. Aquí, presentamos paso a paso protocolos para arteria femoral procedimientos de canulación. Procedimientos claves incluyen la calibración del sistema de adquisición de datos, canulación de arteria femoral y disección de tejido y configuración del sistema para la grabación de la presión arterial canulación. También se incluyen procedimientos de registro de electrocardiografía de superficie. También presentamos ejemplos de grabaciones de BP de ratas normotensas e hipertensas. Este protocolo permite grabaciones directas confiables de BP sistémica con electrocardiografía simultánea.

Introducción

La presión arterial (PA) y electrocardiografía (ECG) son los parámetros básicos de medicina y fisiología cardiovascular. Modelos animales experimentales se han aplicado extensamente en la investigación biomédica para diversas enfermedades cardiovasculares como hipertensión insuficiencia cardíaca¹ y los procedimientos para la grabación de ECG y medición de BP puede realizarse en ratas experimentales.

Existen tres métodos para la medida de BP en ratas: canulación intraarterial (invasiva)², cola del pun ¢ o Pletismografía (no invasiva)³y telemetría de radio (invasiva). La fiabilidad de la medida de BP por pletismografía del pun ¢ o de la cola puede ser afectada por el manejo durante la grabación de animales. Por ejemplo, el brazalete de cola subestima los base BP los cambios que ocurren simultáneamente durante la sujeción y medición de fases⁴. Telemetría de radio se considera la mejor técnica "gold standard" para BP monitoreo y pulso en despierto y moviéndose libremente animales⁵. Sin embargo, puesto que radio telemetría hardware y software costoso, canulación intraarterial es también ampliamente utilizada como una alternativa económica.

Canulación intraarterial requiere considerable habilidad microquirúrgica pero produce las formas de onda real de la presión arterial. BP se puede registrar a través de un catéter lleno de solución salina, insertado en la arteria braquial o radial, femoral. Este método de medición directa de BP invasiva requiere preparación animal pre-quirúrgico, anestesia, inmovilización de animales de laboratorio, habilidad quirúrgica en la disección del tejido y la canulación arterial y calibración adecuado antes de adquirir la medida .

Roedor ECG de superficie es similar a ECG humano. Una rata ECG tiene secuencias de ondas P, complejos QRS, ondas T y de intervalos QT⁶. La onda P, intervalo PR, complejo QRS y ondas T reflejan despolarización atrial, conducción de los impulsos de la aurícula al nodo AV, despolarización ventricular y la repolarización, respectivamente. El intervalo QT se define como el período comprendido desde el inicio de la onda Q y el punto final de la onda T, donde vuelve a la base iso-eléctrico¹.

El ECG indica la sístole cardíaca y fases de la diástole; por lo tanto, el registro simultáneo del ECG de superficie se correlaciona con la medición invasiva de la BP. Usando una combinación de metodologías, es posible dilucidar cambios fisiopatológicos en un modelo de enfermedad o los efectos farmacológicos de una droga o terapia en medicina cardiovascular.

Una cepa de rata (SHR) hipertensiva espontánea había sido obtenida por endogamia de ratas Wistar con BP alta en Japón. La BP se eleva de 5 a 10 semanas de edad y se convierte en fijo de 30 a 35 semanas de edad⁷. Ratas de Wistar Kyoto (WKY) tienen BP sistólica 130 mmHg⁷ y se utilizan comúnmente como normo-tensive control. Utilizamos SHR y WKY para demostrar el resultado de la grabación de BP y ECG de canulación intraarterial.

Protocolo

Todos los experimentos animales descritos fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de Kaohsiung Medical University.

1. animal Care

1. Para evitar la canulación difícil debido al pequeño tamaño arterial, utilizar ratas con sobre 200 g de peso corporal.
2. Retire chow de la jaula y ratas rápidas durante la noche.
3. Ofrecer agua ad libidum a menos que haya un diseño experimental especial.

2. experimental Preparación

1. Obtener los siguientes materiales: pinzas con dientes (figura 1A), tijeras quirúrgicas (figura 1B), pinzas con puntas finas (figura 1, D 1), pinzas con puntas dobladas (Figura 1E), bulldog clamp vascular (Figura 1F ), cadena de seda aproximadamente 20 cm de longitud (figura 1), micro tijeras (figura 1 H), cánula intraarterial, un tubo estéril de polietileno (PE) con un diámetro interno de 0,5 mm y un diámetro exterior de 0,9 mm, 25 – 30 cm de longitud, conectado a una aguja 26 x 1/2 '' (figura 1I), dos llaves de tres vías (Figura 1J) para conectar la cánula intraarterial y las jeringas de presión transductor (figura 1 K) y 1 mL llenan con solución salina heparinizada (100 UI/mL).
2. Preparación de animales
   1. Anestesiar la rata por la inhalación de isoflurano (colocación de las ratas en una 25 cm x 25 cm x 14 cm inducción cámara saturada con 4% de isoflurano, seguido por el uso de la ojiva con 3% isoflurano).
      Nota: Si el animal no es lo suficientemente anestesiado, subir el caudal del isoflurano.
   2. Prueba de reflejo del dolor por pellizcarse los dedos del pie.
   3. Colocar la rata en una posición supina sobre una corta Junta de espuma de poliestireno (o cartón grueso). Fijar las cuatro patas con bandas de goma para inmovilizar el cuerpo (figura 2A).
      Nota: Para evitar posibles ruidos durante la grabación de ECG, la superficie de colocación no debe ser conductora.
3. Preparar los instrumentos para la grabación de BP y ECG. Incluyen una unidad de entrada analógica para adquirir señales, un transductor de presión con un hub compatible, tres cables de electrocardiograma con punta de aguja bipolar y un ordenador con el software adecuado.

3. calibración de transductor de presión

1. Antes de la iniciación de la grabación de BP, calibrar con un esfigmomanómetro de mercurio estándar (figura 1 L).
2. Saque el manguito del esfigmomanómetro y conectar la llave de tres vías en el tubo de inflación para el transductor de presión (figura 1 K) del sistema de adquisición de datos.
3. Tornillo de la válvula de aire hacia la derecha. Mantenga ojos en el manómetro y la pera de insuflación de bombeo. Cuando el medidor muestre 100 mmHg, cambiar la llave de tres vías para conectar el transductor de presión. Utilice 100 mmHg presión para la calibración. El factor de conversión para el cálculo de los BP determinarán automáticamente.
4. Libere la presión, girando la válvula de aire hacia la izquierda hasta que la presión del esfigmomanómetro esté a cero.
5. Repita el paso 3.2 con 200 mm de Hg.
6. Desconectar el transductor de presión desde el esfigmomanómetro de mercurio.
7. Conectar el transductor de presión con la llave de tres vías del catéter PE (figura 1I).

4. Mini-cirugía para la canulación de la arteria Femoral

1. Identificación de la superficie de la señal y la supresión de la piel (figura 2)
   1. Identificar la ubicación del pliegue inguinal (sangría en el cruce entre abdomen y muslo) (línea de guiones en la figura 2A).
   2. El sujetador de la capa completa de piel en el centro del pliegue inguinal. El pelaje puede ser raspado o quitado desde el sitio de la incisión con Tijeras eléctricas o una crema depilatoria antes de la incisión.
   3. Levantar la piel y cortarlo con las tijeras quirúrgicas en una orientación aproximadamente paralelo al muslo ipsilateral (figura 2B). El nervio femoral y los vasos están por debajo del tejido subcutáneo expuesto (figura 2).
2. Disección del tejido para exponer la arteria femoral
   1. Disecar el tejido con unas pinzas con puntas finas, capa por capa. Detener la disección a nivel de los vasos femorales. Asegúrese de que la disección no es lesionar los vasos por debajo.
   2. Cuidadosamente con pinzas (figura 1 o D 1) para eliminar el tejido blando a lo largo de los vasos y del nervio femoral para obtener buena observación. El nervio es fibra-como en textura. La vena es morado oscuro y la arteria es pulsátil (Figura 3A).
   3. Utilizar pinzas con puntas dobladas (Figura 1E) para extender la longitud expuesta de la arteria femoral y la vena (figura 3B).
3. Canulación de la arteria femoral (figura 3)
   1. Utilice pinzas para separar la vena femoral de la arteria y aplicar una pinza de bulldog en la arteria femoral cranially como sea posible (figura 3).
   2. Hacer un lazo flojo de las dos cuerdas de seda, una justo debajo de la pinza de bulldog y el otro en el polo caudal de la arteria femoral expuesta (figura 3D).
   3. Hacer un pequeño agujero en el lado ventral de la arteria femoral (figura 3E) con las tijeras micro (figura 1 H).
   4. Inserte la punta del catéter PE a través del orificio pequeño y haga avanzar el catéter cranially.
      Nota: No aplicar torsión mientras avanza el catéter PE. La fuerza de torsión puede torcer la arteria femoral y provocar estenosis luminal.
   5. Retire la pinza bulldog después de que el catéter PE se avanza firmemente en el lumen de la arteria femoral.
      Nota: Mantenga la vista en el catéter PE mientras se retira la pinza de bulldog de la arteria femoral. La observación de una masa de sangre en el catéter de PE asociado con la observación de pulso confirma su colocación en la luz arterial.
   6. Apriete la cuerda de seda superior para fijar la posición de la sonda de PE.
      Nota: Cualquier tirón accidental o dislocación de la sonda de PE puede resultar en hemorragia grave.
   7. Apriete la cuerda de seda inferior para prevenir el sangrado de la parte caudal de la arteria femoral.
4. Confirmación del éxito de la canulación de la arteria femoral
   1. Use una jeringa de 1 mL para inyectar 0,1 – 0,2 mL de solución salina heparinizada en la arteria femoral. La resistencia a la inyección debe ser trivial. Si se nota cualquier resistencia evidente tras la inyección, Compruebe la canulación todo otra vez.
      Nota: Asegúrese de que las llaves de paso de tres vías se conectan adecuadamente antes de aplicar cualquier presión negativa o la inyección de solución salina en la cánula de la arteria femoral. En este momento, cualquier inyección en el transductor de presión será necesario una recalibración.
   2. Compruebe si hay cualquier secreción alrededor del sitio de canulación. Si no es así, cubrir el sitio quirúrgico con una bola de algodón mojado.

5. registro de presión arterial

1. Después de un color liso para el catéter PE, fije la llave de tres vías del catéter de PE a uno en el transductor de presión (figura 4).
2. Asegúrese de que no hay ninguna burbuja de aire en el sistema de canulación. También Compruebe a las uniones de conexión de la llave de tres vías.
3. Iniciar los datos de sistema de adquisición con frecuencia de muestreo de 1000 Hz para grabar las ondas de Presión Arterial BP será demostrado (figura 6).
4. Permiten la instalación todo se estabilice por lo menos 3-5 minutos. En casos con señales inestables, tiempo de estabilización puede ampliarse a 15 min.
5. Consulte el sitio de canulación periódicamente para asegurarse de que no hay ningún sangrado.
   Nota: Al adquirir datos desde un transductor de presión, es importante colocar el transductor a nivel del corazón del animal.

6. superficie ECG

1. Revise los tres plomos de lo ECG bipolar para asegurarse de que el positivo, negativo, y los electrodos de referencia de platino están intactos.
2. Conecte los cables por vía subcutánea en la pata delantera izquierda, pata derecha y hindleg derecha (figura 5).
3. Coloque los cubos de electrodo a un amplificador de ECG a la medida con frecuencia de muestreo de 1000 Hz y el filtro de frecuencia de 3 a 500 Hz. Mantenga ECG conduce estable durante la grabación. Movimiento de los cables de ECG puede producir artefactos y líneas de base inestables.

7. animal eutanasia después de completar el experimento

1. Después de completar de la BP y la grabación de ECG, detener el sistema de adquisición. Retire los electrodos. Ligar la arteria femoral apretando la cuerda de seda previamente colocada justo después de retirar el catéter de PE.
2. Lugar a que las ratas individualmente en la cámara de eutanasia visible conectadas comprimido cilindros de gas de dióxido de carbono (CO₂). Sellar la tapa firmemente.
3. Introducir 100% CO₂ , con una tasa de llenado de 10% a 30% del volumen de la cámara por minuto.
4. Mantenga sus ojos en la rata; falta de respiración y color de los ojos se desvaneció debería aparecer dentro de 2−3 min.
   Nota: Si no se produce la cesación del movimiento respiratorio después de 3 minutos, el sistema debe examinarse la tasa de utilización de la cámara, fuente de CO₂ o fugas.
5. Deja de flujo de mantenimiento CO₂ a la cámara por 1 minuto más después de la respiración.
6. Determinar arresto cardiaco y respiratorio y observe las pupilas fijas y dilatadas para confirmar la muerte.
   Nota: Si la rata no está muerta sino en CO₂ narcosis, use un método secundario de la eutanasia como la toracotomía bilateral.

Resultados

Compramos SHR y normotensas ratas Wistar-Kyoto WKY del Centro Nacional de animales de laboratorio (Taipei, Taiwan). Todos los animales fueron alojados en un centro de control de temperatura (20−22 º C) con acceso libre al agua y chow estándar en un ciclo de 12 h luz/oscuridad.

Se utilizaron seis ratas de 47 semanas de edad y se pesaron antes de la medición BP y ECG. Los trazos representativos de grabación simultánea de EC...

Discusión

Canulación arterial invasiva permite una medición muy precisa de BP. Se puede hacer con un tubo de PE sin necesidad de un catéter de caro. Medición invasiva BP puede ser realizada simultáneamente con la grabación del ECG de superficie.

La curva de aprendizaje importante para este método es la habilidad experimental necesaria para canule pequeños vasos sanguíneos. En manos experimentadas, la tasa de éxito para la canulación de la arteria femoral puede acercarse al 100%. Práctica se ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyethylene tube	BECTON DICKINSON	427401	internal diameter of 0.5 mm, outer diameter of 0.9 mm
26G x 1/2"" needle	TERUMO	160426D
Adson Forceps	TOP Line	12-540	12 cm (4.75") Long, Straight, 1 x 2 Teeth
Bulldog vascular clamp	Teleflex	357581	8 mm
Computer	AUSUS	X453M
Exernal analog signal recording device	iWorx	T5141538	This allows the recording of up to three channels of ECG, EMG or EEG as well as GSR (skin conductance) from a single iWire input on the recording Module.
Graefe Forceps	AESCULAP Surgical Instruments	BD312R	MICRO DRESSING FORCEPS, CURVED, SERRATED, 105 mm, 4 1/8
Mecury sphygmomanometer	Spirit	CK-101
Pressure transducer	iWorx	IworxBP100
Semken Forceps	MEDE TECHNIK	10-104	100 mm
Software	LabScribe3
Surgical scissors	HEBU	1714	14.5 cm long
Syringe (1 mL)	TERUMO	160426D
Three-way stopcocks	Cole-Parmer	EW-30600-23
Tipped forceps	World Precision Instruments	504506	11 cm long, 0.1x0.06 mm Tips
Vannas Scissors	World Precision Instruments	500086	8.5 cm long, Straight, 0.025 x 0.015 mm Tips, 7mm super fine Blades