Identificar por-polifluorado química especies y con un flujo de trabajo combinado dirigida y no dirigida-detección de alta resolución espectrometría de masas

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para la cuantificación específica secuencial y análisis no dirigidos de compuestos fluorados en agua por espectrometría de masas. Esta metodología proporciona niveles cuantitativos de fluoroquímicos conocidos compuestos e identifica sustancias químicas desconocidas en muestras relacionadas con cálculos semicuantitativo de su abundancia.

Resumen

Históricos y emergentes por- y sustancias perfluorados (PFAS) han cosechado gran interés de las agencias públicas y de gobierno desde lo local a nivel federal. La continua evolución de la química de caídas presenta un desafío para el monitoreo ambiental, donde el desarrollo de métodos específicos queda necesariamente el descubrimiento de nuevos compuestos químicos. Por lo tanto, es necesario, que las metodologías que pueden detectar compuestos emergentes e inesperados, monitorear estas especies con el tiempo y resolver detalles de su estructura química para permitir futuras de trabajo en la salud humana. Con este fin, no se desea tratar análisis por espectrometría de masas de alta resolución ofrece un enfoque de detección de base amplia que puede combinarse con casi cualquier esquema de preparación de la muestra y proporciona capacidades significativas para la identificación de compuestos después de la detección. Adjunto, describimos un método de concentración muestra extracción en fase sólida (SPE) basado diseñado para la cadena más corta y más químicos hidrofílicos de caídas, como por los ácidos éter fluorado y sulfonatos y describir el análisis de muestras preparadas de esta manera en modos dirigidos y no dirigidos. Métodos específicos proporcionan cuantificación superior cuando los estándares de referencia están disponibles pero son intrínsecamente limitados a compuestos esperados al realizar el análisis. En cambio, un enfoque dirigido no puede identificar la presencia de compuestos inesperados y proporcionar alguna información sobre su estructura química. Información sobre características químicas puede utilizarse para correlacionar compuestos a través de ubicaciones de muestra y seguimiento de abundancia y ocurrencia en el tiempo.

Introducción

La clase de por- y sustancias perfluorados (PFAS) son contaminantes orgánicos persistentes con problema de salud pública significativo. El ácido de compuestos específicos perfluorooctanoico (PFOA) y perfluorooctanesulfonate (PFOS) tienen niveles Asesor de salud de agua potable por la EPA^1,2 y su mayor producción en Estados Unidos cesó en la década de 2000^3,4 . Para tener una comprensión significativa de las propiedades de las propuestas de materiales en el producto textil y fabricación de esferas, cientos, si no miles, de la química de propuestas alternativa se han desarrollado para llenar nichos de productos, incluyendo reemplazos para los compuestos obsoleto^5,6,7,8. Hay un curso necesita monitorizar los niveles ambientales de ácidos carboxílicos de cadena recta perfluorados y sulfonatos tal PFOS, PFOA y sus homólogos series relacionadas, pero compuestos químicos emergentes no están cubiertos por métodos establecidos como EPA Método 537⁹ y con frecuencia falta estándares analíticos para el análisis objetivo tradicional. La intención de este protocolo es pues doble. Proporciona una vía para el análisis de LC-MS/MS selectivo de especies de fluoroquímicos en agua donde los estándares analíticos están disponibles y detalles de la integración de un enfoque no dirigido, de alta resolución basados en espectrometría de masa, para análisis de datos permite la detección de compuestos desconocidos o inesperados en las mismas muestras.

Extracción en fase sólida (SPE) es una técnica establecida para la limpieza de la muestra y la concentración con las aplicaciones para muchos analitos y muestra matrices^10,11. Para el análisis de caídas, varias fases sólidas de retentivas como no polar, funcionalizados polar y columnas de intercambio iónico se han utilizado en diferentes grados para las subclases de las especies fluoradas en una amplia variedad de matrices^{9,12, 13,14,15,16}. Avances en análisis de muestras SPE mediante configuraciones en línea mucho aumentan el rendimiento del enfoque y mejoran la reproducibilidad de la manipulación de la muestra, pero el proceso fundamental permanece constante¹⁷. También se han realizado algunos esfuerzos para eliminar la concentración offline ECE usando inyecciones de gran volumen, pero estos requieren modificaciones a la cromatografía que los ponen fuera del ámbito de análisis casual^18,19 . Nuestro análisis de la muestra utiliza una fase retentiva poliméricos anión débil intercambio (cera) bien separar materiales ácidos de caídas de los tradicionales contaminantes orgánicos logrando factores de concentración muestra substancial. Esta fase de la cera es importante captar los ácidos de cadena corta perfluorados como sulfonato de perfluorobutane (PFBS) o éteres de polieter tales como ácido de dímero de oxido de hexafluoropropileno (HFPO-DA) que son más polares que los perfluorados legado de cadena más especies^20,21. Como ha habido un cambio significativo hacia la inclusión de éter y cadenas más cortas de fluorados en recientes caídas química⁵, esta selección de fase permite la recuperación más completa de compuestos novedosos para el análisis de MS.

Cuantificación específica de LC-MS/MS usando había autenticado estándares y etiquetado como estándares internos de isótopos estables proporciona un incomparable nivel de especificidad y sensibilidad para el análisis cuantitativo. Aunque este método es deseable en muchas situaciones, no es práctico para situaciones muy común en el análisis. Enfoques específicos trabajan solamente para las especies que se espera que en la muestra, y para que los métodos se han establecido previamente. Para los compuestos nuevos y emergentes, este enfoque no es capaz de detectar incluso especies que pueden ser de interés, independientemente de su química o concentración, y espectrómetros de masas de baja resolución son casi incapaces de proporcionar suficiente información para hacer tareas de química inequívocas de compuestos desconocidos. En consecuencia, ha surgido el campo de análisis orientada a no, aprovechar el potencial de los espectrómetros de masas moderna alta resolución para analizar muestras sin una hipótesis presupuesta y retroactivo asignar productos químicos características detectables en la muestra. Este enfoque se ha utilizado extensivamente en los campos de la biología^22,23,24 y ciencias ambientales^25,26,27 en numerosas clases de productos químicos. Productos químicos perfluorados son particularmente fácil de identificar en este método debido a sus patrones de masa espectrales únicas y cientos de compuestos se han descrito en apenas los últimos pocos años^5,28.

El protocolo aquí pretende alinear cuantificación de LC-MS/MS propuestas específica con la necesidad de identificar y controlar semi-cuantitativamente compuestos emergentes de interés. La fase SPE selección y técnicas de preparación de la muestra se pretenden asegurar la captura de más hidrofílicos ácidos emergentes de caídas de agua y puede ser menos adecuado para más especies poliméricas de cadena y no iónicos. Además, los datos generados por el análisis objetivo no están densos y de alta dimensionalidad, que hace necesario el uso de software de análisis de datos. Tales paquetes de software son con frecuencia proveedor específico y requieren modificación para operar entre las plataformas de instrumento. Donde sea posible, el proceso de análisis se ha descrito en forma genérica y alternativas de fuente abierta/freeware se hace referencia, pero la eficiencia y la exactitud de cualquier enfoque de software deben ser evaluados de forma individual.

Protocolo

1. colección de muestras de agua

1. Preparación de propuestas de acciones estándar
   1. Preparar una mezcla estándar de PFAS en metanol que contiene compuestos específicos de interés (por ejemplo, PFOA, PFOS, HFPO-DA) 1 ng/μl. Esto es la mezcla de propuestas indígenas. También existen mezclas preparadas comercialmente (es decir, experimentada mezcla A y B de la mezcla).
   2. Preparar una mezcla estándar que contiene isótopos estables emparejado marcado compuestos (SIL) de caídas (p. ej., ¹³C₄- PFOA, ¹³C₈- PFOS, ¹³C₃- HFPO-DA) en 1 ng/μl. Se trata de la mezcla es de caídas. También existen mezclas preparadas comercialmente (es decir, mezcla de MPAFC A y B de la mezcla).
      Nota: Si está disponible una versión SIL de las propuestas específicas, un sustituto con similar estructura y cadena de longitud puede utilizarse (por ejemplo, ¹³C₂- PFHxA para HFPO-DA)
2. Preparación de campo en blanco (FB), muestras de punto en blanco (SB)
   1. Llenar dos, polipropileno limpio de alta densidad (HDPE) o polipropileno (PP) frascos con 1.000 mL de laboratorio desionizada (DI), conocido por ser libre de caídas.
      PRECAUCIÓN: Los materiales caídas con frecuencia han undefined toxicidad y carcinogenicidad. Debe tenerse cuidado para evitar la exposición oral o de la piel a normas o soluciones.
   2. Añadir una cantidad de mezcla estándar caídas a una de las botellas en una concentración final equivalente a las concentraciones esperadas de la muestra (por ejemplo, 100 ng/L). Este es el punto en blanco (SB).
   3. Añadir 5 mL de ácido nítrico al 35% conservante a la espiga en blanco.
   4. Llevar muestra de SB y el campo antes en blanco a la ubicación del muestreo como controles.
3. Muestreo de campo
   Nota: Colector de muestra debe usar guantes de nitrilo y muestra de sistemas de flujos siempre que sea posible. Toma de muestras se debe fluir y alcancen antes de toma de muestras (2-3 min).
   1. Recoger 500-1.000 mL de agua de la ubicación del campo en una botella limpia de HDPE o PP.
   2. Añadir 5 mL de ácido nítrico al 35% conservante a botellas de la muestra y el campo en blanco.
      PRECAUCIÓN: el ácido nítrico es corrosivo y un oxidante fuerte

2. extracción de muestra de

Nota: Caídas son ubicuo y persistente. Asegúrese de que todos los disolventes son de la más alta calidad y han sido analizados bajo nivel contaminación de caídas. Enjuague a fondo todos los equipos de laboratorio utilizados para la preparación de las normas antes de preparar muestras y espacios en blanco.

1. Pretratamiento de la muestra
   1. Vierta cada muestra en un cilindro de polietileno de alta densidad graduada 1 L separado, previamente limpio y registro el volumen exacto.
   2. Añadir 10 mL de metanol al frasco vacio muestra, tápalo y agitar bien para aclarar propuestas fijado por adsorción desde el interior de la botella.
   3. Devolver la muestra de agua medido a la botella de lavado con el enjuague metanólico.
2. Curva estándar para cuantificación
   1. Llenar ocho, 1 botellas HDPE/PP L con agua desionizada libre de caídas.
   2. Seleccione ocho concentraciones separadas uniformemente cubriendo el rango de cuantificación deseada. Por ejemplo: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750 y 1.000 ng/L para una gama de 10-1.000 ng/L.
   3. Añadir una cantidad de mezcla nativa caídas a cada botella para obtener las concentraciones finales de PFAS en 2.2.2 (por ejemplo, 100 μl caídas mezcla A 1L de agua desionizada = 100 ng/L).
3. Adición de estándar interno
   Nota: Además del isótopo estable que etiqueta estándar interno (IS) es necesario sólo si se desean que los resultados cuantitativos además de análisis orientada a no.
   1. Agregue la mezcla de propuestas es a cada muestra a una concentración aproximadamente la mitad de la curva de calibración (por ejemplo, 250 μl de mezcla de caídas es = 250 ng/L)
4. Filtración
   1. Filtrar las muestras a través de filtros de fibra de vidrio GF/A (47 mm, 1,6 μm tamaño de poro) bajo vacío suave en un matraz de vacío previamente limpiado 1 L polietileno de alta densidad.
   2. Si partículas permanece en la botella, enjuague con agua desionizado en el filtro. Vertiendo el agua filtrado en la botella de muestra o un nuevo contenedor para extracción en fase sólida.
5. Extracción en fase sólida (SPE)
   Nota: Concentración de cartucho descrito aquí utiliza una bomba de pistón de flujo constante. Métodos alternativos de concentración usando un colector de vacío²⁰ o usando una configuración on-line de¹⁷ SPE-LC-MS son posibles pero no discutido.
   1. Condición de un cartucho de intercambio (cera) de aniones débilmente con 25 mL de metanol.
   2. Estado del cartucho de cera con un adicional 25 mL de agua desionizada.
   3. Posición bomba drenaje tubo en botellas de la muestra filtrada y cartuchos SPE con nombres correspondientes de la muestra de la etiqueta.
   4. 500 mL de muestra de agua a través del cartucho con un caudal constante de 10 mL/min (total 500 mL), desechando a través de flujo de líquido a la bomba.
      Nota: Volúmenes más grandes o más pequeñas pueden ser concentrados dependiendo de las concentraciones de la muestra prevista.
   5. Extraiga el cartucho de la bomba de pistón para la elución.
      Nota: Si la concentración de muestras adicionales utilizando la misma bomba, la bomba de pistón debe aclararse con 25 mL de metanol antes de instalar el cartucho siguiente para conseguir el equilibrio.
   6. Transferencia de cartucho SPE a un colector de vacío y equipar con depósito externo de cristal.
   7. Limpie el cartucho SPE con 4 mL de 25 mM, tampón de acetato de sodio 4.0 pH bajo vacío suave. Deseche el flujo a través. Cartucho de SPE lavar con 4 mL de metanol neutro.
      Nota: Neutro Lave fracción puede ser recopilada si se espera que los analitos polares no iónicos específicos. De lo contrario, descarte de desechos
   8. Coloque un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 mL por debajo de cada cartucho SPE a recoger el eluyente. Eluir la muestra con 4 mL de hidróxido de amonio 0.1% en metanol.
   9. Retire el tubo de elución y reducir el volumen de eluido a 500-1.000 μl por evaporación bajo corriente de nitrógeno seco en un baño de agua a temperatura ligeramente elevada (40 ° C).
   10. Concentrado muestra extractos pueden almacenar antes del análisis a temperatura ambiente.
6. Objetivo cuantificación LC-MS/MS
   1. Diluir 100 μl de muestra se extrae con 300 μL de tampón de acetato de amonio de 2 mM en un frasco de muestra HPLC.
   2. Calibrar y equilibrar un sistema HPLC y MS según instrucciones del fabricante.
      Nota: Comúnmente se detectan antecedentes caídas debido al uso de componentes de fluoropolímero de la mayoría de sistemas de LC y en la septa del vial de muestra. Confirme los niveles detectables en los espacios en blanco insignificantes antes de su uso. Modificación del sistema LC para reemplazar componentes de Teflon se sugiere siempre que sea posible. El uso de una columna analítica de "hold-up" junto a la válvula mezcladora de LC es también sugerido²⁹.
   3. Preparar un worklist analítica de la curva estándar, las muestras y una repetición adicional de la curva estándar para evaluar la deriva instrumental a través de la gestión. Una lista de tareas de ejemplo se muestra en la tabla 1.
   4. Analizar las muestras mediante métodos LC y MS para establecidos específico de interés. El gradiente de LC de ejemplo se muestra en la tabla 2 y MS parámetros del método se muestran en la tabla 3 y tabla 4. Más detallada puede encontrarse en McCord et al.²¹.
   5. Generar una curva estándar de las muestras estándar utilizando la proporción del área pico del analito a la norma interna frente a la concentración del analito. Generar una fórmula de regresión cuadrática con 1 / x ponderación para concentración predicción⁹.
   6. Cuantificar los analitos específicos en cada muestra utilizando las curvas estándar preparadas y proporción del área (área estándar es área) para cada medición.
   7. Si la concentración supera el intervalo de calibración, diluir la muestra original con agua DI añadió la concentración es adecuada y volver a extraer para la concentración en el rango adecuado.
7. Recopilación de datos de LC-MS/MS no dirigidos
   1. Diluir 100 μl de muestra se extrae con 300 μL de tampón de acetato de amonio de 2 mM en un frasco de muestra HPLC.
   2. Calibrar y equilibre un HPLC y MS alta resolución según las instrucciones del fabricante.
   3. Preparar una lista de tareas analítica como en 2.6.2.
   4. Usando el software del instrumento, recoger datos de LC-MS con una amplia exploración MS1 en modo dependiente de datos para recoger gradiente MS/MS. ejemplo LC en la tabla 5. Discusión adicional de opciones puede encontrarse en Strynar et al.³⁰ y³¹de Newton et al.
      Nota: Para mejor MS/MS análisis de datos dependiente de calidad pueden realizarse con una lista de ion preferido de un subconjunto de características restante después de procesar los datos en 2.8.1-2.8.8.
8. Tratamiento de datos orientada a no
   Nota: Se pueden realizar análisis de datos con una amplia gama de software y estos métodos no reflejan el método único o mejor para un conjunto de datos arbitrario. Siempre que sea posible, los pasos proporcionan una descripción genérica que se puede hacer en software alternativo. Procesamiento de los datos del ejemplo utilizados en este manuscrito se llevó a cabo utilizando el software específico del vendedor (Software 1 y 2 de Software) como se indica en Newton et al.³¹.
   1. Realizar extracción molecular característica de características químicas usando uno de varios software paquetes^32,33 o proveedor de software de código abierto para identificar masas monoisotopic, tiempos de retención y áreas de pico integrado de química Funciones.
      1. En 1 de Software, seleccione Agregar o quitar archivos de muestra > Agregar archivos y seleccione los datos en bruto en el experimento no dirigido, entonces golpear OK.
      2. En Software 1 Seleccione Batch recursivo característica extracción > método abierto... un método preestablecido, o manualmente editar la configuración de software. Profinder ajustes para la extracción de la característica se encuentran en la tabla 6.
      3. En el Software 1, después de la extracción de la característica, seleccione archivo > Exportar como CSV..., archivo > Exportar como CEF..., o archivo > Exportar como PFA... para su posterior procesamiento. Archivos CEF se asumen para el resto de la descripción.
      4. En Software 2 (MPP) crear un nuevo experimento con tipo no identificado y el tipo de flujo de trabajo Asistente de importación de datos y haga clic en Aceptar.
      5. En MPP Seleccione los archivos de datos y localizar los resultados exportados del Software 1 (CEF o PFA) para importar; luego haga clic en siguiente hasta que aparezcan opciones de Parámetros de alineación .
      6. En MPP, establezca los valores de alineación compuesto a 0.0 (alineación ya fue realizada en la extracción de la característica de Software 1, paso 2.8.1.2) luego haga clic en siguiente a través de los pasos hasta que termine .
   2. Filtro de identificación basados en análisis reproducibilidad. Donde hay múltiples muestras replicadas, las características deben estar presentes en > 80% del individuo replica y tiene un coeficiente de análisis de variación (CV) de < 30%
      1. En Seleccione MPP disposición Experimental > experimento agrupación y asignar a cada archivo raw un grupo correspondiente a su muestra de origen (es decir, deben ser repeticiones de la misma fuente en el mismo grupo). Pueden crear varios grupos correspondientes a variables anidadas (p. ej., instrumental vs repeticiones técnicas).
      2. En Seleccione MPP disposición Experimental > interpretación crear Seleccione el parámetro de experimento (es decir, de grupo) y haga clic en siguiente hasta que termine . Que se creará una categoría futuras filtrado puede operar en.
      3. En Seleccione MPP Control de calidad > filtro de frecuencia. Establecer entidades en Todas las entidades y la interpretación a la muestra Group(non-averaged) había creado en 2.8.2.2, luego del golpe siguiente.
      4. Para los parámetros de entrada, sistema de retención de la entidad en el 80% de la muestra en al menos una condición y haga clic en siguiente hasta que termine . Nombre de la lista de características de filtrado de frecuencia
      5. En Seleccione MPP Control de calidad > filtro sobre la muestra variabilidad. Encuentra la lista de personas a las funciones de filtrado de frecuencia de 2.8.2.4 y la interpretación a Group(non-averaged), luego del golpe siguiente.
      6. Seleccione el botón de radio para los Datos crudos y el rango de interés de coeficiente de variación < 30%. Haga clic en siguiente > acabado y guardar la lista como características de filtrado de CV.
   3. Quitar características donde no muestras tienen significativamente más alta (> 3 veces) la abundancia de la muestra en blanco (campo de FB).
      1. En Seleccione MPP análisis > cambio doble. Lista entidad a las Características de filtrado de CV y la interpretación de la muestra grupo luego del golpe a siguiente. Seleccione la opción de cambiar de doblez y contra única condición condición seleccionar FB o lo que era el nombre del grupo de la muestra procesada en blanco.
      2. En la pantalla siguiente, establece el corte doblez-cambio en 3.0 y haga clic al final de las instrucciones. Guarde la lista como Lista de filtrado de FC.
   4. Realizar comparaciones binarias de muestras individuales de interés contra una muestra de fondo apropiado (por ejemplo, aguas arriba y aguas abajo de un punto de origen) para determinar cambios de doblez de determinadas características químicas.
      1. En Seleccione MPP análisis > filtro en volcán parcela. Establecer la lista de personas en Lista de filtrado de FC y la interpretación al grupo.
      2. Para la condición de doble cambio par elegir dos muestras de comparación (por ejemplo, una sincronizado aguas arriba y aguas abajo muestra) y selecciona prueba Mann-Whitney no apareados.
      3. Para el análisis preliminar, no seleccione un valor para la corrección de pruebas múltiples en la pantalla siguiente, haga clic en a la parcela de resultado.
      4. En la pantalla de resultados Seleccione un atajo de doble cambio de 3.0 y un corte del valor de p en 0,1. Acabado y exportar la lista de Resultados Prelim.
   5. Para cada característica restante después de filtrar, generar representación química predicha de la masa exacta y espectro de masa compuesto.
      1. En el MPP, seleccione interpretación de resultados > IDBrowser identificación y la lista de personas Resultados Prelim .
      2. En el IDBrowser seleccionar identificar todos los compuestos con fórmula molecular generador (MFG) como método de identificación.
      3. En la fórmula de generar opciones Añadir F a la columna de elementos y definir el máximo a 50, a continuación, seleccione terminar. Tras generación fórmula seleccione Guardar y volver a regresar al MPP.
      4. En MPP, haga clic derecho en el filtrado y MFG emparejado de entidades y seleccione Exportar lista. Guardar los resultados.
   6. Examinar la masa monoisotopic de especies en la lista reducida característica química importante para las personas con defectos de masa de fluoración; ver tipo y Fiehn³⁴.
   7. Nota la serie de química que contienen motivos de polyfluorination comunes (CF₂ (m/z 49.9968), CF₂O (m/z 65.9917) CH₂CF₂O (m/z 80.0074), etc.) mediante un algoritmo de software o parcela de defecto de masa; ver sección discusión, Liu et al.¹⁷, Loos et al³⁵ y Dimzon et al³⁶.
   8. Buscar fórmulas químicas previstas o neutro masas contra la base de datos de EPA química Dashboard u otras bases de datos para devolver estructuras químicas posibles.
      1. Abra la herramienta de búsqueda de lotes de EPA Comptox productos químicos Dashboard (https://comptox.epa.gov/dashboard/dsstoxdb/batch_search) y pegar la lista de identificadores (fórmulas o masas) en el cuadro identificador, después de seleccionar el tipo de identificador (es decir, MS-listo Fórmula o masa de Monoisotopic).
      2. Seleccione Descargar datos químicos... y también seleccionar los datos de física/química/toxicología para posibles partidos de la lista desplegable.
   9. Usando la intuición química y datos de referencia disponibles, retire poco probable acerca de los partidos de la potencial lista de estructura química de cada formulación a base de viabilidad debido a la estabilidad química, características físicas tales como ionizability o hidrofobicidad, la presencia de la fabricación de productos químicos de fuentes cercanas, etcetera. En ausencia de datos adicionales, viabilidad espectral puede ser alineado puramente sobre la base de la prevalencia de la literatura; Ver McEachran et al³⁷.
   10. Confirmar estructuras utilizando estándares disponibles o MS/MS de alta resolución dirigida de fragmentos contra espectros de bases de datos, en silico los espectros teóricos o curación manual.

Resultados

Resultados cuantitativos de LC-MS/MS se encuentran en forma de ion-cromatogramas para el cromatograma de iones totales (TIC) y los cromatogramas de iones extraídos (EIC) de transiciones específicas química productos químicos medidos (figura 1). El área de pico integrado de una transición química se relaciona con la abundancia compuesta y puede ser utilizado para calcular la concentración exacta utilizando una curva de calibración normalizada a un estándar interno (figura 2). Respuesta baja o plana de analitos individuales indica que el intervalo de calibración está fuera del rango lineal del espectrómetro de masas, o que el instrumento requiere de ajuste y calibración. Mala precisión de repeticiones indica un problema con la inyección de la muestra o cromatografía inconsistente que requiere modificación de los parámetros de la LC.

Análisis no-dirigido usando un análisis completo de MS1 produce un TIC para muestras (figura 3), que permite la generación ad hoc de EIC para los iones individuales (figura 4). Cualquier punto del tiempo cromatográfico dado contiene señales de especies químicas y cuando se utiliza un espectrómetro de masas alta resolución, la huella isotópica del compuesto. Identificación de compuestos a partir de la exploración de MS1 se realiza mediante programación de un algoritmo de peak-picking utilizando uno de varios enfoques^38,39,40. Picking de picos rinde características químicas con una masa exacta medida y tiempo de retención cromatográficos, así como el espectro de masas de los iones y el área del pico cromatográfico. Esta información se almacena normalmente en un formato de base de datos digital para posterior procesamiento y filtrado, pero la naturaleza anidada e interconectada de los datos puede entenderse conceptualmente (figura 5).

Se filtra la lista de funciones para la reunión de varios criterios para ser seleccionado para la posterior investigación de compuestos. La primera y más sencilla es filtrado por defecto de masa (la diferencia entre la masa exacta de una función y su masa nominal). PFAS compuestos tienen defectos de masa negativo (figura 6) debido a su preponderancia de átomos de flúor y compuestos polifluorado defectos de masa positivas, pero substancialmente más pequeños que materiales orgánicos homólogo^31,34 . Un segundo método de filtrado paso es identificar serie homóloga que contiene unidades que se repiten comunes a especies de caídas, como CF₂ o CF₂O. identificación de éstos se puede hacer con masa de Kendrick defecto parcelas^17,36, o paquetes de software como R nontarget paquete³⁵ (figura 7).

Después de filtrado, asignación de identidad química de la lista de observados altamente diferenciado o tentativamente por / polifluorado especies pueden comenzar. Masa exacta proporciona una lista relativamente pequeña de fórmulas químicas posibles para emparejar pero es insuficiente para la identificación sin la adición de coincidencia espectral al patrón de isótopos del espectro de masas⁴¹. De alta resolución MS1 datos, uno o más supuestos fórmulas químicas se compara con la huella isotópica del espectro de masas y anotó (figura 8). Fórmulas para emparejar puede ser generadas usando ab initio un grupo definido de átomos o puede ser origen de una combinación de literatura informó compuestos y el contenido de una o más bases de datos. Los anfitriones nos EPA química Dashboard (https://comptox.epa.gov/dashboard/) una lista constantemente actualizada de PFAS compuestos identificados por la agencia, así como las listas compilada por otras organizaciones como la de NORMAN Network⁴².

Fórmulas químicas se pueden confirmar aún más, y cierta información estructural se puede garnered de espectros MS/MS (figura 9). Estructuras del candidato son de química bases de datos grandes tales como el tablero de instrumentos de química EPA, Pubchem, el registro de CAS, etcetera. Espectros previstos pueden ser generados o adquirieron usando una variedad de programas de fragmentación y asignado,⁴³ o espectros MS/MS pueden interpretarse manualmente.

Una matriz de datos de ejemplo está disponible en la información complementaria que contiene una matriz de toda característica de diez muestras (5 arriba, 5 abajo) recopilada aguas arriba y aguas abajo de una fuente puntual de fluoroquímicos. Cada fila representa una característica química con tiempo de retención asociada, masa neutra, espectro de masa y abundancia de materia prima para cada muestra. (Tabla suplementaria, hoja 1). Inicial de filtrado (Tabla suplementaria, hoja 2) para el defecto de masa negativa y significación estadística en un t-test no pareado entre aguas arriba y aguas abajo reducen el número de características "interesantes" química ~ 120. Fórmulas químicas previstas fueron obtenidos de Agilent IDBrowser y búsquedas contra el EPA Comptox productos químicos tablero de mandos, que volvió posible coincide con (Tabla suplementaria, hoja 3). El "top-hit" para cada fórmula química basada en fuentes de datos³⁷ fue asignado (Tabla suplementaria, hoja 4). Tenga en cuenta que más de la mitad de las restantes características no tienen partidos de alta calidad. Características identificadas con ninguna coincidencia pueden ser el resultado de la formación en fuente fragmentación/aducción, pobre asignación fórmula, o la identificación de PFAS no se encuentra en la base de datos de origen. Interpretación de los espectros crudos con el fin de validar las tareas está fuera del alcance de este manuscrito, pero más información se puede encontrar en las obras citadas^{15,30,31,44, 45}.

ID	Nombre de la muestra	Tipo de muestra	STD Conc	Frasco	Método de LC	Método de MS
1	DB_001	En blanco		1:, 1	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
2	DB_002	En blanco		1:, 1	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
3	DB_003	En blanco		1:, 1	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
4	DB_004	En blanco		1:, 1	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
5	DB_005	En blanco		1:, 1	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
6	FB	En blanco		1:, 2	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
7	10 enfermedades de transmisión sexual	Estándar	10	1:, 3	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
8	25 enfermedades de transmisión sexual	Estándar	25	1:, 4	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
9	50 std	Estándar	50	1:, 5	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
10	100 std	Estándar	100	1:, 6	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
11	250 std	Estándar	250	1:, 7	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
12	500 std	Estándar	500	1:, 8	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
13	750 std	Estándar	750	1:B, 1	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
14	1000 std	Estándar	1000	1:B, 2	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
15	DB_006	En blanco		1:B, 3	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
16	SB_DUP1	Analito		1:B, 4	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
17	SB_DUP2	Analito		1:B, 5	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
18	Sitio SW 03	Analito		1:B, 6	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
19	Sitio SW 16	Analito		1:B, 7	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
20	Sitio SW 30	Analito		1:B, 8	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
21	DB_007	Analito		1: C, 1	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
22	Sitio SW 19	Analito		1, 2: C	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
23	Sitio SW 48	Analito		1: C, 3	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
24	SW sitio 49	Analito		1: C, 4	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
25	Sitio SW 05	Analito		1, 5: C	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
26	Sitio SW 47	En blanco		1: C, 6	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
27	DB_008	Analito		1: C, 7	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
28	19_DUP sitio de SW	Analito		1: C, 8	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
29	Sitio SW 20	Analito		1, 1	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
30	Sitio SW 21	Analito		1, 2	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
31	SW sitio 46	Analito		1, 3	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
32	Sitio SW 47	Analito		1, 4	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
33	DB_009	En blanco		1, 5	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
28	Sitio SW 32	Analito		1, 6	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
29	Sitio SW 50	Analito		1, 7	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
30	Sitio SW 25	Analito		1, 8	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
31	21_DUP sitio de SW	Analito		1:E, 1	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
32	Sitio SW 52	Analito		1:E, 2	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
33	DB_010	En blanco		1:E, 3	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
34	FB	En blanco		1:, 2	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
35	10 enfermedades de transmisión sexual	Estándar	10	1:, 3	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
36	25 enfermedades de transmisión sexual	Estándar	25	1:, 4	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
37	50 std	Estándar	50	1:, 5	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
38	100 std	Estándar	100	1:, 6	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
39	250 std	Estándar	250	1:, 7	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
40	500 std	Estándar	500	1:, 8	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
41	750 std	Estándar	750	1:B, 1	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
42	1000 std	Estándar	1000	1:B, 2	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
43	DB_011	En blanco		1:B, 2	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
44	DB_012	En blanco		1:E, 4	PFAS grad 400uL/min - 9 min run	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min

Tabla 1: Ejemplo worklist para el análisis objetivo y cuantificación de las propuestas utilizando LC-MS/MS de

hora (min) 0	% A (acetato de amonio 2,5 mM en MeOH 5%) 90	% B (acetato de amonio 2,5 mM en el 95% MeOH) 10
5	15	85
5.1	0	100
7	0	100
7.1	90	10
9	90	10

Tabla 2: Gradiente de ejemplo para la separación de la LC en análisis específicos

Capilary voltaje (kv)	1.97
Cono de voltaje (V)	15
Extractor de voltaje (V)	3
Lente de RF (V)	0.3
Temp de la fuente	150
Desolvation Temp	40
Desolvation Gas caudal (L/hr)	300
Flujo de Gas del cono (L/hr)	2

Tabla 3: Parámetros de fuente de ionización para el análisis objetivo

CMP	Precursor	Producto	Tiempo de permanencia	Cono de voltaje (V)	Energía de la colisión (eV)
PFBA	212.80	168.75	0.01	15	10
C 13 4-PFBA ES	216.80	171.75	0.01	15	10
PFPeA	262.85	218.75	0.01	15	9
PFBS ° 1	298.70	79.90	0.01	40	30
PFBS ° 2	298.70	98.80	0.01	40	28
PFHxA ° 1	312.70	118.70	0.01	13	21
PFHxA ° 2	312.70	268.70	0.01	13	10
13C 2-PFHxA es	314.75	269.75	0.01	13	9
HFPO-DA 1°	329.16	168.90	0.01	10	12
HFPO-DA 2°	329.16	284.90	0.01	10	6
HFPO-DA ES DE 1°	332.16	168.90	0.01	10	12
HFPO-DA ES 2°	332.16	286.90	0.01	10	6
PFHpA ° 1	362.65	168.65	0.01	14	17
PFHpA ° 2	362.65	318.70	0.01	14	10
PFHxS ° 1	398.65	79.90	0.01	50	38
PFHxS ° 2	398.65	98.80	0.01	50	32
C 13 4-PFHxS es	402.65	83.90	0.01	50	38
PFOA ° 1	412.60	168.70	0.01	15	18
PFOA ° 2	412.60	368.65	0.01	15	11
C 13 4-PFOA ES	416.75	371.70	0.01	15	11
PFNA ° 1	462.60	218.75	0.01	15	17
PFNA ° 2	462.60	418.60	0.01	15	11
PFNA ES	467.60	422.60	0.01	15	11
PFOS ° 1	498.65	79.90	0.01	60	48
PFOS ° 2	498.65	98.80	0.01	60	38
C 13 4-PFOS ES	502.60	79.70	0.01	60	48
PFDA ° 1	512.60	218.75	0.01	16	18
PFDA ° 2	512.60	468.55	0.01	16	12
13 2 - PFDA ES	514.60	469.55	0.01	16	12

Tabla 4: Tabla de transición del ejemplo y parámetros de MS/MS para el contenido de experimentada-MXA, junto con HFPO-DA

hora (min)	% A (acetato de amonio 2,5 mM en MeOH 5%)	% B (acetato de amonio 2,5 mM en el 95% MeOH)
0	90	10
0.5	90	10
3	50	50
3.5	50	50
5.5	40	60
6	40	60
7	0	100
11	0	100

Tabla 5: Gradiente de ejemplo para la separación de la LC en análisis no dirigidos

Parámetro de profinder	Valor de ajuste
Extracción máxima altura filtro	800 cuentas
Ion(s) permitido	-H / H
Modelo de isótopo de extracción característica	Moléculas orgánicas comunes
Estados de carga permitida	2 - Jan
Compuesto iónico cuenta umbral	Dos o más iones
Tolerancia de alineación RT	0,40 min + 0.0%
Tolerancia total alineación	20,00 ppm + 2.0mDa
Post-Processing de altura absoluta de filtro	> = 10000 puntos en una muestra
Procesamiento posterior filtro de puntuación de MFE	> = 75 en una muestra
Algoritmo de integración de pico	2 ágil
Máxima integración altura filtro	> = 5000 puntos
Buscar por filtro de altura absoluta de Ion	> = 7500 puntos en una muestra
Buscar por filtro de puntuación de Ion	> = 50.00 en una muestra

Tabla 6: Característica Molecular extracción alineación configuración y software Profinder. Todos los valores conservan su configuración predeterminada para el procesamiento de datos.

Umbral de la abundancia de iones	Umbrales de la característica	Umbral de replicar (n = 5)	Tiempo de ejecución	Funciones	Pasar el umbral de replicar	Pasar el umbral de CV	Características hasta el 90% de las TIC
1 x S/N	2000	Ninguno	8.15	987	505	421	91
2 x S/N	5000	Ninguno	5.02	707	357	313	93
3 x S/N	10000	Ninguno	2.3	308	249	230	93
1 x S/N	2000	100%	3.3	603	339	297	92
2 x S/N	35000	100%	1,58	310	248	229	93
3 x S/N	10000	100%	1.45	202	190	182	92

Tabla 7: Comparación del tiempo de procesamiento de la muestra e identificaciones de característica química para umbrales de extracción de características diferentes.

Figura 1 : Total cromatograma de iones y cromatogramas de iones extraídos de un subconjunto de estándares de éter perfluorado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Curvas de calibración representante para compuestos demostrando calidad decreciente de la curva analítica construcción. Panel de la izquierda indica una calibración de alta calidad; El panel central indica un compuesto con mala precisión en duplicados de preparación, particularmente en concentraciones más altas; Panel derecho indica una curva con mala precisión y un bajo rango dinámico lineal, dando por resultado una respuesta plana en el extremo superior de la gama de calibración y no hay señal detectable en el extremo inferior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Overlaid cromatogramas de iones totales (TIC) para aguas superficiales extractos recogidos aguas arriba y aguas abajo de un sitio de producción de fluoroquímicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Cromatogramas de iones extraídos (EIC) para todos identificaron características química de una muestra de agua superficial que contiene múltiples clases de fluoroquímicos. Cada rastro químico es un color diferente para la diferenciación de. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Diagrama conceptual de la información cruda y prevista para una característica química identificada como ácido de dímero de oxido de hexafluoropropileno (HFPO-DA). Características químicas se compilan de extracción del software de datos de MS medidas y contienen cromatográficos (p. ej., tiempo de retención (RT)) e información de espectrometría de masas. Fórmula prevista, estructuras e identidades químicas se generan a partir de mediciones de materia prima para cada función. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Parcela de defecto de masa de elementos químicos identificados en un emisario de fabricación (rojo, izquierda) y agua de la superficie de referencia (azul, derecha). Compuestos fluorados caen cerca y por debajo de la punteada línea cero. Tenga en cuenta la persistente serie PFOS/PFOA en la muestra de agua de la superficie de fondo (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 : Parcela de defecto de masa masa vs no identificados características química de una muestra de agua superficial con serie homóloga identificado y etiquetado por el nontarget paquete R. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8 : Espectro de masa de un desconocido características químicas con intensidades isotópicas previstas de tres fórmula química posible con el mismo monoisotopic Massachusetts Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9 : Espectro de fragmentación de un éter perfluorado compuesto con anotado fragmento picos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10 : Representación gráfica de los umbrales de filtrado. De izquierda a derecha, umbral de abundancia de ion para espectros de masas característica química, cuentan con umbral de abundancia para las características cromatográficas extraídos y replicar el umbral para la frecuencia de detección de función en un experimento de inyección por triplicado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Preparación y manejo de muestra
La inclusión de normas de referencia/punto son de vital importancia para cualquier análisis objetivo, ya que proporcionan un respaldo para la comprobación de validez analítica. Falta de muestras QC impide cualquier evaluación de la exactitud de los resultados; la naturaleza ubicua de fluoroquímicos significa que posibilidad contaminación de muestras de campo, materiales de procesamiento, sistema LC-MS no es infrecuente y debe explicarse. Además, permite la validación del protocolo independientemente de la variación en la muestra día a día de procesamiento, como muchos de los pasos pueden ser muy variables, particularmente el SPE y muestra pasos de concentración. La extracción de ambos productos químicos perfluorados obsoleta y novedoso puede ser influenciada por la elección de la fase estacionaria para la concentración y componentes de las muestras de la fuente, tales como pH y salinidad⁴⁶. La influencia de las condiciones de la muestra se debe considerar si son clases particulares de pefluorinated químicos de interés. Esquemas de preparación de muestra alternativas para los extractos de agua pueden utilizarse si la configuración de laboratorio está disponible y el análisis de datos downstream sigue siendo similar.

Análisis de datos específicos
Compuestos con estándares disponibles y emparejado, estable isótopo marcado estándares internos, las principales preocupaciones para el análisis instrumental y determinación de límites de detección del método y rangos de información adecuados se pueden determinar en un base de laboratorio por laboratorio mediante métodos estándar, tales como relación señal a ruido de bajo nivel estándar picos de⁴⁷. En ausencia de estándares internos coincidentes errores de efectos de matriz pueden ocurrir, y back-predicción precisa de las muestras inoculadas se puede utilizar para estimar la exactitud de las mediciones. Cuando carece de normas para realizar una curva, una estimación cuantitativa de un desconocido puede ser hecha por el tratamiento idénticamente a un estándar estrechamente emparejado compuesta, pero son errores en la estimación del orden de 10 veces con una capacidad limitada para cuantificar la incertidumbre, ver McCord, Newton y Strynar²¹. En estos casos, aún se pueden recoger datos de tendencia, pero las estimaciones de concentración son inherentemente poco confiables.

Análisis de datos no orientados
Configuración de selección de pico tiene un impacto sustancial en el número de elementos químicos identificados, pero la calidad de la selección es también fuertemente afectada. Las decisiones de interés en cosecha pico son 1) intensidad de masas individuales para ser incluidos en los espectros, el umbral de la abundancia de iones 2) la intensidad del cromatógrama extraído picos a tener en cuenta las características, la característica abundancia umbral 3) detección frecuencia, el umbral de replicar y 4) variación analítica, el umbral de la CV (figura 10).

Configuración de umbrales irrealmente bajos resultados de recolección de pico en un incremento exponencial en el tiempo de la muestra para resolver características adicionales de la abundancia cada vez más bajo (Tabla 7). Los filtros de umbral de la abundancia de iones de masa espectrales características donde lo suficiente de la abundancia de cada isótopo no pasa el umbral. Idealmente Esto selecciona sólo para características con los espectros de MS calidad, asegurando que son características real químicos en lugar de ruido instrumental y permitiendo para la predicción de la fórmula en el proceso aguas abajo. Un umbral adecuado se basa en ruido instrumental, idealmente por lo menos 3 x el umbral de ruido de MS1 explora. Umbral de abundancia característica filtra características químicas basados en la intensidad o el área de la función cromatográfica extraída. Este paso permite el rechazo de los picos de baja abundancia, que suelen ser de mala calidad cromatográfica, tienen varianzas altas o son el resultado de otra extracción pobre software. Un umbral adecuado debe determinarse por experimento y partiendo de un nivel aceptable de generación de función deficiente (p. ej., características abajo la cromatografía inaceptablemente pobre de exposición umbral) de la matriz. Más control de calidad analítico puede ser utilizada para rechazar características nivel cromatográfico basado en identificación incompatible en repeticiones analíticas y preparatorias (umbral de replicación) o basada en la pobre reproducibilidad de repeticiones (umbral de CV). Los niveles apropiados dependen de la calidad de los programas de integración de pico utilizados y de las entidades químicas bajo investigación. Compuestos perfluorados de soluble en agua y ligeramente optimizado integración protocolos, deben identificarse características en 80% de analítica replica y CVs deben caer por debajo del 30%, como se detalla en la sección de métodos.

Los picos detectados análisis orientada a no no den estimaciones cuantitativas de las concentraciones de los materiales detectados. Además, la identidad de verdaderos desconocidos puede ser difícil de confirmar porque faltan nuevos compuestos de bases de datos públicamente disponibles. Nueva determinación estructural requiere un análisis extenso con varios métodos y requiere experiencia en espectrometría de masas y de la química. Sin embargo, la normalización de las áreas pico de características químicas puede proporcionar estimaciones semicuantitativa de las concentraciones de incógnitas de las especies conocidas²¹. Si se emplean el muestreo constante y los pasos de preparación, información de tendencia del tiempo para las especies individuales puede generarse para controlar la persistencia de una sustancia química en el futuro como la respuesta de una especie individual debe ser coherente salvo grandes variaciones en la matriz²¹.

La principal ventaja de este método es la extensibilidad de la tratamiento de muestra para permitir análisis específicos y descartando. Específicas análisis proporciona información cuantitativa equivalente o superior, grandemente carece de amplitud de análisis deseado cuando se trata con materiales nuevos y emergentes, así como su relación con materiales de matriz. Aplicación de una metodología específica, o incluso un sospechoso método de detección basado sólo en materiales conocidos y bases de datos limitadas es totalmente ciego a especies no observadas previamente, aunque pueden tener efectos significativos para la salud. Mejora de software y bases de datos se convierten en más robustos, la exactitud de identificación desconocida seguirá aumentando, con una disminución concomitante en la inversión de tiempo y nivel de conocimientos necesarios para analizar los datos multidimensionales generados por este enfoque. Sin embargo, los datos generados en la actualidad son de significativo valor futuro porque datos bancarios permite análisis post-hoc con software recién desarrollado y permite la comparación a través del tiempo aunque se desconoce la identidad de un compuesto detectado.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acqity ultra-high performance liquid chromatography system	Waters Corporation		Modified with PFCs analysis kit (176001744); equivalent UPLC system is acceptible if PFAS background is checked and confirmed to be low
Ammonium acetate	Fluka	17836	Mass spectrometry grade >99% pure
Ammonium Hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Balance	Mettler	AB204S
BEH C18 reverse phase UPLC column, 2.1×50 mm, 1.7 μm	Waters Corporation	186002350
Dual piston syringe pump	Waters Corporation	SPC10-C
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	ARK2183
Glass Microfiber Filters	Whatman	1820-070
High density polyethelye sample bottle	Nalgene	2189-0032
High Resolution Mass Spectrometer	Various		Mass Spectrometer should be capable of providing accurate mass to <10ppm and collecting MS/MS data.  Agilent 6530 qTOF and Thermo Fisher Orbitrap Fusion were used in this work
Methanol	Sigma-Aldrich
Nitric Acid (35% w/w)	Thermo Fisher Scientific	SVCN-5-1	Can be prepared in house using concentrated nitric acid and reagent water
Polypropylene Buchner funnel	ACE Glass	12557-09
Polypropylene cenitrfuge tube and cap	BD Falcon	352096
Polypropylene Vacuum Flask (1 L)	Nalgene	DS4101-1000
Quattro Premier XE triple quadrupole mass spectrometer	Waters Corporation		Equivalent triple-quadrupole or better system can be used instead, should provide high sensitivity and stability for targeted analysis
Reagent Water			Any source determined to be PFAS free
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	W302406
TurboVap nitrogen evaporator	Caliper Life Sciences	103198	Equivalent systems or rotary vacuum evaporator may be used instead
Weak anion exchange SPE cartridge (Oasis WAX Plus)	Waters Corporation	186003519
Standard Solutions
2,3,3,3-Tetrafluoro-2-(1,1,2,2,3,3,3-heptafluoropropoxy)propanoic acid (HFPO-DA)	Wellington	HFPO-DA
Additional targeted compound standards of interest			to be determined based on preliminary analysis and standard availability
Mass labeled HFPO-DA	Wellington	M2HFPO-DA
Native PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL)	Wellington	PFAC-MXA	or PFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest
Stable Isotope Labeled PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL)	Wellington	MPFAC-MXA	or MPFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest as appropriate for Native PFASs
Software
Mass Profiler Professional	Agilent		Or open source software packages
Profinder	Agilent		Or open source software packages