Identificazione- e specie chimica di Polyfluorinated con un flusso di lavoro combinato mirati e Screening di mirati spettrometria di massa ad alta risoluzione

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per la quantificazione mirati sequenziale e non mirati di analisi di composti fluorurati in acqua mediante spettrometria di massa. Questa metodologia fornisce livelli quantitativi di composti noti fluorochimici e identifica sostanze chimiche sconosciute in esempi correlati con stima semi-quantitativa della loro abbondanza.

Abstract

Storici ed emergenti per- e sostanze polyfluoroalkyl (PFAS) hanno raccolto significativo interesse dalle agenzie pubbliche e governative dal locale a livello federale. La continua evoluzione delle chimiche PFAS presenta una sfida per il monitoraggio ambientale, dove è in continuo sviluppo di metodi mirati ritardo necessariamente la scoperta di nuovi composti chimici. C'è un bisogno, pertanto, di avere metodologie previsionali che possono rilevare composti emergenti e inaspettati, monitorare queste specie nel tempo e risolvere i dettagli della loro struttura chimica per consentire futuri di lavoro nella salute umana. A tal fine, non mirati di analisi mediante spettrometria di massa ad alta risoluzione offre un approccio di ampia base di rilevamento che possa essere combinato con quasi ogni schema di preparazione del campione e fornisce funzionalità significative per l'identificazione di composti dopo il rilevamento. Qui, descriviamo un metodo di concentrazione di estrazione in fase solida (SPE) basata esempio sintonizzato per catena più corta e più idrofiliche chimiche PFAS, come per gli acidi fluorurati etere e sulfonati e descrivere l'analisi dei campioni preparati in questo modo in modalità mirate e non mirati. Metodi mirati forniscono quantificazione superiore quando norme di riferimento sono disponibili ma sono intrinsecamente limitate ai composti previsti durante l'esecuzione di analisi. Al contrario, un approccio non mirati può identificare la presenza di composti inaspettati e fornire alcune informazioni sulla loro struttura chimica. Informazioni sulle caratteristiche chimiche possono essere utilizzati per correlare composti attraverso percorsi di esempio e tenere traccia di abbondanza e l'avvenimento nel corso del tempo.

Introduzione

La classe di per- e sostanze polyfluoroalkyl (PFAS) sono inquinanti organici persistenti con preoccupazione significativa di salute pubblica. L'acido di composti specifici perfluoroottanoico (PFOA) e perfluorooctanesulfonate (PFOS) hanno livelli di consulenza di salute di acqua potabile impostati dall'EPA^1,2 e la loro produzione di US principali cessò nel 2000s^3,4 . Per ottenere una comprensione significativa per le proprietà di PFAS materiali nel prodotto tessile e dei consumatori di produzione sfere, centinaia, se non migliaia, di composizioni chimiche PFAS alternativi sono stati sviluppati per riempire nicchie di prodotto, tra cui sostituzioni per il deprecato composti^5,6,7,8. C'è un continuo bisogno di monitorare i livelli ambientali di acidi carbossilici a catena dritta perfluorurati e sulfonati tali PFOS, PFOA e loro correlati serie omologa, ma composti chimici emergenti non sono coperti da affermati metodi quali EPA Metodo 537⁹ e frequente mancanza standard analitici per un'analisi mirata tradizionale. L'intenzione del presente protocollo è quindi duplice. Esso fornisce un percorso per l'analisi LC-MS/MS mirata delle specie fluorochimici in acqua dove sono disponibili standard analitici e dettagli la perfetta integrazione di un approccio basati sulla spettrometria di massa ad alta risoluzione, non mirati per l'analisi dei dati che consente il rilevamento di composti sconosciuti o imprevisti negli stessi campioni.

Estrazione in fase solida (SPE) è una tecnica consolidata per la pulitura del campione e la concentrazione con applicazioni per molti analiti e campione matrici^10,11. Per l'analisi PFAS, più fasi solide ritentivi, tra cui non-polare, funzionalizzati polar e colonne a scambio ionico sono stati utilizzati in varia misura per le sottoclassi delle specie fluorurati in un'ampia varietà di matrici^{9,12, 13,14,15,16}. Gli avanzamenti nella analisi di campione SPE utilizzando configurazioni on-line notevolmente aumentano il throughput dell'approccio e migliorare la riproducibilità del trattamento del campione, ma il processo fondamentale rimane coerente¹⁷. Inoltre sono stati intrapresi alcuni sforzi per rimuovere la concentrazione in linea di SPE tramite iniezioni di grande volume, ma questi richiedono modifiche per la cromatografia che metterli fuori dal Regno della analisi casual^18,19 . La nostra analisi di esempio utilizza una fase ritentiva di scambio (cera) polimerici anione debole accuratamente separare materiali acidi PFAS dai contaminanti organici tradizionali ottenendo fattori di concentrazione notevole esempio. Questa fase di cera è importante per catturare gli acidi a catena corta perfluorurata come perfluorobutane sulfonato (PFBS) o eteri perfluorurati quali acido dimero di esafluoropropilene ossido (HFPO-DA) che sono più polari il più lunga catena legacy perfluorurati specie^20,21. Come c'è stato un significativo spostamento verso catene più corte fluorurati e inclusione di etere nel recente PFAS chimica⁵, questa selezione di fase consente un recupero più approfondita di nuovi composti per analisi MS.

Mirate la quantificazione di LC-MS/MS utilizzando autenticato standard e isotopo stabile con l'etichetta standard interni offre un impareggiabile livello di specificità e sensibilità per l'analisi quantitativa. Mentre questo approccio è utile in molte situazioni, non è pratico per le situazioni di tutto-troppo-comune in analisi. Approcci mirati funzionano solo per le specie che sono attesi per il campione, e per quali metodi sono stati stabiliti in precedenza. Per i composti nuovi ed emergenti, questo approccio non è in grado di rilevare anche specie che possono essere di interesse, indipendentemente dalla loro chimica o la concentrazione, e spettrometri di massa a bassa risoluzione sono quasi incapaci di fornire informazioni sufficienti per fare inequivocabile assegnazioni di chimiche dei composti sconosciuti. Di conseguenza, il campo di analisi non mirati è sorto, sfruttando la potenza di spettrometri di massa moderni ad alta risoluzione per analizzare campioni senza un'ipotesi presupposta e assegnare retroattivamente prodotti chimici a caratteristiche rilevabile nel campione. Questo approccio è stato usato estesamente nei campi della biologia^22,23,24 e scienze ambientali^25,26,27 su numerose classi di sostanze chimiche. Composti perfluorinati sono particolarmente semplici da identificare in questo metodo a causa dei loro unici modelli spettrali di massa, e centinaia di composti è stati descritti solo il passato pochi anni^5,28.

Il protocollo discusso qui è inteso per allineare la quantificazione di LC-MS/MS PFAS mirata con la necessità di identificare e monitorare semiquantitativamente emergenti composti di interesse. La fase SPE selezione e tecniche di preparazione del campione sono destinati a garantire la cattura di più idrofili acidi PFAS emergenti dall'acqua e può essere meno adatto per la più lunga catena polimerica specie e non ionici. Inoltre, i dati generati dall'analisi non mirati sono densi e di alta dimensionalità, che richiede l'uso di software di analisi dati. Tali pacchetti software frequentemente sono specifici del vendor e richiedono la modifica di operare tra le piattaforme di strumento. Ove possibile, il processo di analisi è stato descritto in modo generico e alternative open source/freeware vengono fatto riferimento, ma l'efficienza e l'accuratezza di qualsiasi approccio di software deve essere valutati su base individuale.

Protocollo

1. raccolta dei campioni di acqua

1. Preparazione di PFAS calci di densità Standard
   1. Preparare una miscela standard di PFAS in metanolo contenente eventuali composti a target di interesse (ad es., PFOA, PFOS, HFPO-DA) a 1 ng / µ l. Questa è la miscela di PFAS nativo. Sono disponibili anche miscele preparate commercialmente (cioè, PFAC Mix A e Mix B).
   2. Preparare una miscela standard contenente abbinato isotopo stabile etichettato composti PFAS (SIL) (ad es., ¹³C₄- PFOA, ¹³C₈- PFOS, ¹³C₃- HFPO-DA) a 1 ng / µ l. Questa è la miscela di PFAS è. Sono disponibili anche miscele preparate commercialmente (cioè, MPAFC Mix A e Mix B).
      Nota: Se non è disponibile una versione SIL del PFAS mirati, un surrogato di lunghezza simile struttura e catena può essere utilizzato (ad esempio, ¹³C₂- PFHxA per HFPO-DA)
2. Preparazione del campo vuoto (FB), campioni di Spike in bianco (SB)
   1. Riempire due, polipropilene pulito ad alta densità (HDPE) o polipropilene (PP) flaconi con 1.000 mL di laboratorio acqua deionizzata (DI), noto per essere PFAS gratis.
      Attenzione: Materiali PFAS frequentemente definita tossicità e/o carcinogenicità. Prestare la massima attenzione per evitare l'esposizione orale o cutanea agli standard o soluzioni di riserva.
   2. Aggiungere una quantità di miscela standard PFAS una delle bottiglie ad una concentrazione finale pari alle concentrazioni di campione previsto (ad es., 100 ng/L). Si tratta di Spike in bianco (SB).
   3. Aggiungere 5 mL di acido nitrico 35% conservante il vuoto di Spike.
   4. Trasportare sia campione di SB e il vuoto il campo sono nella posizione di campionamento come controlli.
3. Campionamento del campo
   Nota: Dispositivi di raccolta devono indossare guanti in nitrile e campione da sistemi che scorre dove possibile. Rubinetto per campioni dovrebbero poter fluire ed equilibrare prima del campionamento (2-3 min).
   1. Raccogliere 500-1.000 mL di acqua dalla posizione di campo in una bottiglia pulita dei PP o HDPE.
   2. Aggiungere 5 mL di acido nitrico 35% conservante per esempio bottiglie e campo vuoto.
      Attenzione: l'acido nitrico è corrosivo e un forte ossidante

2. estrazione del campione

Nota: PFAS sono onnipresenti e persistente. Assicurarsi che tutti i solventi sono di più alto grado e sono stati analizzati per la contaminazione di PFAS livello basso. Risciacquare accuratamente tutte le attrezzature di laboratorio utilizzate per la preparazione di norme prima di preparare i campioni e gli spazii in bianco.

1. Pretrattamento del campione
   1. Versare ogni campione in un separato, pre-pulito 1 L HDPE è laureato cilindro e registrare l'esatto volume.
   2. Aggiungere 10 mL di metanolo per la bottiglia campione svuotato, tappo e agitare bene per sciacquare PFAS adsorbito all'interno della bottiglia.
   3. Riportare il campione di acqua misurata la bottiglia sciacquata con il risciacquo metanolico.
2. Curva standard per la quantificazione
   1. Riempire otto, 1 L HDPE/PP bottiglie con acqua DI PFAS-libero.
   2. Selezionare otto concentrazioni equidistanti che copre l'intervallo di quantizzazione desiderata. Ad esempio: 10, 25, 50, 100, 250, 500, 750 e 1000 ng/L per una gamma di 10-1.000 ng/L.
   3. Aggiungere una quantità di miscela di PFAS nativo per ogni bottiglia di cedere le concentrazioni finali di PFAS in 2.2.2 (ad esempio, 100 µ l PFAS Mix A 1L di acqua DI = 100 ng/L).
3. Aggiunta di standard interno
   Nota: Aggiunta di isotopo stabile con l'etichetta standard interno (IS) è necessario solo se si desiderano risultati quantitativi oltre alle analisi non mirati.
   1. Aggiungere la miscela di PFAS è per ogni campione a una concentrazione di approssimare il punto centrale della curva di calibrazione (ad es., 250 µ l di miscela è PFAS = 250 ng/L)
4. Filtrazione
   1. Filtrare i campioni attraverso filtri di fibra di vetro GF/A (47 mm, diametro dei pori 1,6 µm) sotto vuoto delicato in una boccetta di vuoto dell'HDPE 1 L pre-pulito.
   2. Se il particolato rimane nella bottiglia, risciacquare con acqua deionizzata aggiuntiva nel filtro. Restituire l'acqua filtrata per la bottiglia di campione o un nuovo contenitore per estrazione in fase solida.
5. Estrazione in fase solida (SPE)
   Nota: Concentrazione di cartuccia descritto qui utilizza una pompa a pistone di flusso costante. Metodi alternativi di concentrazione utilizzando un collettore sottovuoto²⁰ o utilizzando un programma di installazione di SPE-LC-MS¹⁷ on-line sono possibili ma non discusso.
   1. Condizione di una cartuccia di scambio (cera) debole anione con 25 mL di metanolo.
   2. Condizione della cartuccia di cera con un ulteriore 25 mL di acqua deionizzata.
   3. Posizione pompa disegnare tubi in bottiglie di campione filtrato ed etichettare cartucce SPE con corrispondenti nomi di esempio.
   4. Pompa 500 mL di acqua di campione attraverso la cartuccia ad un flusso costante di 10 mL/min (500 mL in totale), scartando il flusso liquido ai rifiuti.
      Nota: Volumi maggiori o minori possono essere concentrati a seconda delle concentrazioni di campione previsto.
   5. Rimuovere la cartuccia dalla pompa a pistone per eluizione.
      Nota: Se la concentrazione esempi aggiuntivi utilizzando la stessa pompa, la pompa a pistone deve essere lavata con 25 mL di metanolo prima di installare la cartuccia successiva di equilibramento.
   6. Trasferire la cartuccia SPE ad un collettore sottovuoto ed equipaggiare con serbatoio esterno in vetro.
   7. Lavare la cartuccia SPE con 4 mL di 25mm, tampone a pH 4,0 sodio acetato sotto vuoto delicato. Scartare il flusso attraverso. Cartuccia SPE lavare con 4 mL di metanolo neutro.
      Nota: Neutral lavare frazione possa essere raccolti se specifici analiti polari non ionici sono attesi. In caso contrario, scartare per rifiuti
   8. Posto un tubo da 15 mL in polipropilene centrifuga sotto ogni cartuccia SPE per raccogliere eluente. Eluire il campione con 4 mL di idrossido di ammonio 0,1% in metanolo.
   9. Rimuovere il tubo di eluizione e ridurre il volume di eluato a 500-1.000 µ l per evaporazione sotto flusso di azoto secco in un bagno di acqua a temperatura leggermente elevata (40 ° C).
   10. Concentrato di campione estratti possono essere archiviati prima dell'analisi a temperatura ambiente.
6. Mirate la quantificazione LC-MS/MS
   1. Diluito 100 µ l di campione estratto con 300 µ l di tampone di acetato di ammonio 2 mM in una fiala del campione di HPLC.
   2. Calibrare ed equilibrare un sistemi HPLC e MS secondo le istruzioni del produttore.
      Nota: Sfondo PFAS comunemente vengono rilevati grazie all'utilizzo di componenti del fluoropolymer della maggior parte dei sistemi LC e nei setti fiala del campione. Confermare che i livelli rilevabili di spazi vuoti è trascurabile prima dell'uso. Modifica del sistema LC per sostituire i componenti di Teflon è suggerita dove possibile. L'uso di una colonna analitica "hold-up" adiacente alla valvola miscelatrice LC è anche suggerito²⁹.
   3. Preparare un worklist analitici comprensivi di curva standard, campioni e un ulteriore replica della curva standard per valutare la deriva strumentale in fuga. Una lista di lavoro di esempio è illustrato nella tabella 1.
   4. Analizzare i campioni utilizzando metodi LC e MS stabiliti per la destinazione presenti di interesse. Il gradiente di LC di esempio è mostrato nella tabella 2 e i parametri del metodo MS sono mostrati in tabella 3 e tabella 4. Ulteriore discussione dettagliata possa essere trovati nei McCord et al.²¹.
   5. Generare una curva standard dai campioni standard utilizzando il rapporto tra area del picco dell'analita per lo standard interno contro le concentrazioni di analita. Generare una formula di regressione quadratica con 1 / x ponderazione per concentrazione Pronostico⁹.
   6. Quantitate mirati analiti in ciascun campione utilizzando le curve standard preparate e rapporto di area (area standard / è area) per ogni misurazione.
   7. Se la concentrazione supera l'intervallo di taratura, diluire il campione originale con acqua DI addizionati con la concentrazione appropriata di IS ed estrarre di nuovo a portare la concentrazione nell'intervallo appropriato.
7. Raccolta di dati di LC-MS/MS non-mirato
   1. Diluito 100 µ l di campione estratto con 300 µ l di tampone di acetato di ammonio 2 mM in una fiala del campione di HPLC.
   2. Calibrare ed equilibrare un HPLC e MS ad alta risoluzione secondo le istruzioni del produttore.
   3. Preparare una lista di lavoro analitico come 2.6.2.
   4. Utilizzando il software dello strumento, raccogliere dati di LC-MS con una vasta analisi MS1 in modalità dipendente dai dati per raccogliere gradiente di MS/MS. esempio LC nella tabella 5. Ulteriore discussione delle impostazioni strumento si trovano in Strynar et al.³⁰ e³¹di Newton et al.
      Nota: Per una migliore MS/MS analisi della qualità dei dati-dipendente possono avvenire con un elenco preferito dello ione di un sottoinsieme di funzionalità restanti dopo l'elaborazione di dati in 2.8.1-2.8.8.
8. Elaborazione di dati non-mirato
   Nota: L'analisi dei dati può essere eseguita con una vasta gamma di software e questi metodi non riflettono il metodo unico, o meglio per un set di dati arbitrari. Ove possibile, passaggi forniscono una descrizione generica che può essere effettuata in software alternativo. Elaborazione dei dati di esempio utilizzati in questo manoscritto è stato effettuato utilizzando software specifici del fornitore (Software 1 e 2 di Software) come dettagliato in Newton et al.³¹.
   1. Eseguire l'estrazione molecolare caratteristica di caratteristiche chimiche utilizzando uno dei diversi software open source software pacchetti^32,33 o il fornitore per identificare massa monoisotopic, tempi di ritenzione e aree dei picchi integrato di chimica caratteristiche.
      1. Nel Software 1, selezionare file di esempio di Aggiungi/Rimuovi > Aggiungi file e selezionare i dati non elaborati dall'esperimento non mirati, quindi premere OK.
      2. In Software 1 selezionare Batch ricorsiva Feature Extraction > metodo aperto... per caricare un metodo prestabilito, o modificare manualmente le impostazioni del software. Profinder impostazioni per estrazione di caratteristiche sono disponibili nella tabella 6.
      3. Nel Software 1, dopo l'estrazione di funzionalità, selezionare File > Esporta come file CSV..., File > Esporta come CEF..., o File > Esporta come PFA... per un'ulteriore elaborazione. I file CEF si presuppone che per il resto della descrizione.
      4. Nel Software 2 (MPP) creare un nuovo esperimento di tipo non identificato e flusso di lavoro tipo Importazione guidata dati e fare clic su OK.
      5. In MPP Selezionare file di dati e individuare i risultati esportati Software 1 (CEF o PFA) da importare; quindi fare clic su successivo fino a quando non vengono visualizzate le opzioni di Allineamento parametro .
      6. In MPP, impostare i valori di allineamento Compound a 0.0 (allineamento è stata già eseguita l'estrazione di funzionalità del Software 1, passaggio 2.8.1.2) quindi fare clic su successivo i passaggi fino a quando la finitura è disponibile.
   2. Filtro identificazioni basati sulla riproducibilità analitica. Dove più campioni replicati sono disponibili, caratteristiche dovrebbero essere presenti in > 80% di individuo replica e hanno un'analitico coefficiente di variazione (CV) del < 30%
      1. In selezionare MPP messa a punto sperimentale > esperimento raggruppamento e assegnare ogni file raw un gruppo corrispondente al relativo campione di origine (cioè, replicati dalla stessa fonte dovrebbero essere nello stesso gruppo). Più gruppi possono essere creati corrispondenti alle variabili nidificate (ad es., instrumental vs tecnici replicati).
      2. In selezionare MPP messa a punto sperimentale > creare interpretazione quindi selezionare il parametro di esperimento (cioè, il gruppo) e fare clic su Avanti fino a quando la finitura è disponibile. Questo creerà una categoria che futuro filtraggio può operare su.
      3. In selezionare MPP controllo qualità > filtro di frequenza. Impostare Entity List per Tutte le entità e l'interpretazione per il campione Group(non-averaged) creato in 2.8.2.2, quindi premere successivo.
      4. Per i parametri di Input, impostare ritenzione di entità all'80% del campione in almeno una condizione, quindi fare clic su Avanti fino a quando il rivestimento è disponibile. Denominare l'elenco frequenza filtrata caratteristiche
      5. In selezionare MPP controllo qualità > filtro sulla variabilità del campione. Impostare l'elenco di entità per le caratteristiche di frequenza filtrata da 2.8.2.4 e l'interpretazione di Group(non-averaged), quindi premere successivo.
      6. Selezionare il pulsante di opzione per Dati grezzi e la gamma di interesse al coefficiente di variazione < 30%. Fare clic su successivo > fine e salvare l'elenco come CV filtrata caratteristiche.
   3. Rimuovere funzionalità dove nessun campioni sono significativamente più elevati (> 3 fold) abbondanza rispetto al campione di campo vuoto (FB).
      1. In selezionare MPP analisi > Fold Change. Impostare Entity List su CV filtrata caratteristiche e l'interpretazione per il campione di che gruppo quindi prossimo colpo. Selezionare l'opzione cambia piega a tutti contro singola condizione e selezione condizione FB o qualunque fosse il nome del gruppo per il campione preparato in bianco.
      2. Nella schermata successiva, impostare la frequenza di taglio piega-cambiamento a 3.0 e fare clic su attraverso fino alla fine dei prompt. Salvare l'elenco come FC elenco filtrato.
   4. Eseguire confronti binari dei singoli campioni di interesse contro un campione adeguato sottofondo (ad es., a Monte vs a valle di una sorgente puntiforme) per determinare la piega-modifiche per singole caratteristiche chimiche.
      1. In selezionare MPP analisi > filtro su Vulcano trama. Impostare l'elenco di entità all'Elenco filtrato di FC e l'interpretazione al gruppo.
      2. Per la condizione di piega-cambiamento coppia di scegliere due campioni per il confronto (ad es., un accoppiato a Monte e a valle di esempio) e selezionare test di Mann-Whitney spaiati.
      3. Per un'analisi preliminare, non selezionare un valore per la correzione di test multipli nella schermata seguente, scegliere attraverso la trama di risultato.
      4. Nella schermata risultati selezionare un taglio piega-cambiamento di 3.0 e un cut-off valore p a 0.1. Poi finire ed esportazione l'elenco come Risultati preliminare.
   5. Per ogni funzionalità restanti dopo il filtraggio, generare formula(s) chimica prevista dalla massa esatta e composito spettro di massa.
      1. In MPP, selezionare risultati interpretazione > identificazione IDBrowser e l'elenco di entità Prelim risultati .
      2. Nella IDBrowser selezionare identificare tutti i composti utilizzando Generatore di formula molecolare (MFG) come metodo di identificazione.
      3. Nella Formula generare opzioni aggiungere F nella colonna di elementi e impostare il massimo a 50, quindi selezionare fine. Dopo la generazione di formule selezionare salvare e tornare per tornare al MPP.
      4. In MPP, tasto destro del mouse il filtrato e MFG corrispondente nell'elenco di entità e selezionare Esporta elenco. Salvare i risultati.
   6. Esaminare la massa monoisotopic della specie nell'elenco ridotta caratteristica chimica significativa per quelli contenenti difetti massa indicativi di fluorurazione; vedere tipo e Fiehn³⁴.
   7. Nota serie chimica contenente motivi comuni polyfluorination (CF₂ (m/z 49.9968), CF₂O (m/z 65.9917), CH₂CF₂O (m/z 80.0074), ecc.) utilizzando un algoritmo di trama o software di difetto di massa; vedere sezione discussione, Liu et al.¹⁷, Loos et al³⁵ e Dimzon et al.³⁶.
   8. Ricerca formule chimiche previste o neutrale masse contro il database EPA chimica Dashboard e/o altri database per restituire potenziali strutture chimiche.
      1. Aprire lo strumento di ricerca di Batch di EPA Comptox prodotti chimici Dashboard (https://comptox.epa.gov/dashboard/dsstoxdb/batch_search) e incollalo nella casella di identificatore, l'elenco degli identificatori (formule o masse) dopo aver selezionato il tipo di identificatore (vale a dire, MS-pronto Formula o massa Monoisotopic).
      2. Selezionare Scarica dati chimici... e anche selezionare qualsiasi dati fisico/chimico/Tossicologia desiderato per possibili corrispondenze nell'elenco a discesa.
   9. Utilizzando intuizione chimica e dati di riferimento disponibile, rimuovere improbabile partite dall'elenco struttura chimica potenziale per ogni formula basata sulla fattibilità grazie alla stabilità chimica, proprietà fisiche quali ionizability o idrofobicità, la presenza di fabbricazione di prodotti chimici da fonti vicine, ecc. In assenza di ulteriori dati, fattibilità spettrale può essere classificato puramente sulla base di prevalenza di letteratura; Vedi McEachran et al.³⁷.
   10. Confermare le strutture utilizzando standard disponibili e/o mirate ad alta risoluzione MS/MS di corrispondenza di frammenti contro spettri dal database, in silico spettri teorici o curatela manuale.

Risultati

Risultati quantitativi di LC-MS/MS sono sotto forma di ione-cromatogrammi per il cromatogramma ionica totale (TIC) e i cromatogrammi di ioni estratti (EIC) di transizioni specifiche chimiche per le sostanze chimiche misurati (Figura 1). L'area dei picchi integrato di una transizione chimica è relativo all'abbondanza composto e può essere utilizzato per calcolare l'esatta concentrazione mediante una curva di calibrazione normalizzata di standard interno (Figura 2). Risposta di basso o piatto di singoli analiti indica che l'intervallo di calibrazione è esterno all'intervallo lineare di spettrometro di massa, o che lo strumento necessita di messa a punto e taratura. Scarsa precisione delle ripetizioni indica un problema con l'iniezione del campione o cromatografia incoerente che richiede la modifica dei parametri di LC.

Analisi non-mirato utilizzando una scansione completa di MS1 rendimenti un TIC per campioni (Figura 3), che permette per generazione ad hoc di EIC per singoli ioni (Figura 4). Qualsiasi punto determinato momento cromatografiche contiene segnali per specie chimiche e quando si utilizza uno spettrometro di massa ad alta risoluzione, l'impronta digitale isotopica del composto. Individuazione di composti dalla scansione MS1 viene eseguita a livello di codice da un algoritmo di picco-picking utilizzando uno dei diversi approcci^38,39,40. Raccolta di picco produce caratteristiche chimiche con una massa accurata misurata e tempo di ritenzione cromatografica, come pure lo spettro di massa dello ione e l'area dei picchi cromatografici. Queste informazioni vengono in genere memorizzate in un formato di database digitale per l'ulteriore elaborazione e filtraggio, ma la natura nidificata e interconnessa dei dati può essere compresa concettualmente (Figura 5).

L'elenco di funzionalità viene filtrato per composti soddisfi uno dei diversi criteri per essere selezionati per ulteriori indagini. Il primo e più semplice è filtro da difetto di massa (la differenza tra la massa esatta di una caratteristica e la sua massa nominale). PFAS composti hanno difetti di massa negativi (Figura 6) a causa della loro preponderanza di atomi di fluoro e composti polyfluorinated hanno difetti di massa positivi, ma sostanzialmente più piccoli di materiali organici omologhi^31,34 . Un secondo metodo di filtraggio passo consiste nell'identificare serie omologhe contenenti unità ripetute comune a PFAS specie, come CF₂ o CF₂O. identificare questi può essere fatto utilizzando Kendrick massa difetto trame^17,36, o pacchetti software come di R del nontarget pacchetto³⁵ (Figura 7).

Dopo il filtraggio, assegnazione di identità chimica sulla rosa dei candidati altamente differenzialmente osservato e/o provvisoriamente per / polyfluorinated specie può cominciare. Massa accurata fornisce un elenco relativamente piccolo di potenziali formule chimiche per la corrispondenza, ma non è sufficiente per l'identificazione senza l'aggiunta di spettrali corrispondenti al modello di isotopo di massa spettro⁴¹. Da alta risoluzione MS1 dati, una o più formule chimiche putative sono confrontate con l'impronta digitale isotopica dello spettro di massa e segnate (Figura 8). Formule per la corrispondenza può essere generate ab-initio utilizzando un pool definito di atomi o possono provenire da una combinazione di letteratura segnalati composti e il contenuto di uno o più database. I padroni di casa ci EPA chimica Dashboard (https://comptox.epa.gov/dashboard/) un elenco costantemente aggiornato di PFAS composti identificati dall'Agenzia, nonché elenchi compilato da altre organizzazioni quali il NORMAN Network⁴².

Formule chimiche possono essere ulteriormente confermate, e alcune informazioni strutturali possono essere raccolto da spettri MS/MS (Figura 9). Strutture del candidato sono disponibili da grandi basi di dati chimici come il cruscotto di chimica di EPA, Pubchem, il registro CAS, ecc. Predetti spettri possono essere generati o acquisite utilizzando una varietà di programmi di frammentazione e assegnate,⁴³ o spettri MS/MS possono essere interpretati manualmente.

Una matrice di dati di esempio è disponibile nelle informazioni supplementari contenenti matrici intera funzionalità da dieci campioni (5 a Monte, a valle 5) raccolti a Monte e a valle di una sorgente puntiforme fluorochimici. Ogni riga rappresenta una caratteristica chimica con tempo di conservazione associato, massa neutro, spettro di massa e crudo abbondanza per ogni campione. (Tabella supplementare, foglio 1). Iniziale (Tabella supplementare, foglio 2) per difetto di massa negativa e significatività statistica in un test t spaiato tra filtro a Monte e a valle riduce il numero delle caratteristiche chimiche "interessanti" a ~ 120. Formule chimiche previste sono sono ottenute da Agilent IDBrowser e cercate contro il cruscotto di prodotti chimici Comptox EPA, che restituito possibili corrispondenze (Tabella supplementare, foglio 3). Il "top-hit" per ogni formula chimica sulla base di fonti dati³⁷ è stato assegnato (Tabella supplementare, foglio 4). Si noti che oltre la metà delle rimanenti caratteristiche non hanno alcuna corrispondenza di alta qualità. Caratteristiche identificate con nessuna partita possono essere il risultato della formazione di frammentazione/addotti nell'origine, povero assegnazione formula, o l'identificazione di PFAS non trovato nel database di origine. Interpretazione degli spettri grezzi al fine di convalidare le assegnazioni è oltre la portata di questo manoscritto, ma maggiori informazioni possono essere trovate in opere citate^{15,30,31,44, 45}.

ID	Nome del campione	Tipo di campione	STD Conc	Flaconcino	Metodo LC	Metodo di MS
1	DB_001	In bianco		1: A, 1	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
2	DB_002	In bianco		1: A, 1	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
3	DB_003	In bianco		1: A, 1	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
4	DB_004	In bianco		1: A, 1	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
5	DB_005	In bianco		1: A, 1	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
6	FB	In bianco		1: A, 2	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
7	10 std	Standard	10	1: A, 3	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
8	25 std	Standard	25	1: A, 4	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
9	50 std	Standard	50	1: A, 5	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
10	100 std	Standard	100	1: A, 6	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
11	250 std	Standard	250	1: A, 7	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
12	500 std	Standard	500	1: A, 8	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
13	750 std	Standard	750	1: B, 1	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
14	1000 std	Standard	1000	1: B, 2	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
15	DB_006	In bianco		1: B, 3	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
16	SB_DUP1	Analita		1: B, 4	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
17	SB_DUP2	Analita		1: B, 5	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
18	Sito di SW 03	Analita		1: B, 6	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
19	Sito di SW 16	Analita		1: B, 7	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
20	Sito di SW 30	Analita		1: B, 8	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
21	DB_007	Analita		1: C, 1	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
22	Sito di SW 19	Analita		1: C, 2	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
23	Sito di SW 48	Analita		1: C, 3	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
24	SW sito 49	Analita		1: C, 4	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
25	Sito di SW 05	Analita		1: C, 5	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
26	SW sito 47	In bianco		1: C, 6	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
27	DB_008	Analita		1: C, 7	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
28	Sito di SW 19_DUP	Analita		1: C, 8	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
29	Sito di SW 20	Analita		1: D, 1	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
30	Sito di SW 21	Analita		1: D, 2	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
31	SW sito 46	Analita		1: D, 3	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
32	SW sito 47	Analita		1: D, 4	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
33	DB_009	In bianco		1: D, 5	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
28	SW sito 32	Analita		1: D, 6	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
29	SW sito 50	Analita		1: D, 7	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
30	Sito di SW 25	Analita		1: D, 8	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
31	Sito di SW 21_DUP	Analita		1: E, 1	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
32	SW sito 52	Analita		1: E, 2	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
33	DB_010	In bianco		1: E, 3	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
34	FB	In bianco		1: A, 2	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
35	10 std	Standard	10	1: A, 3	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
36	25 std	Standard	25	1: A, 4	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
37	50 std	Standard	50	1: A, 5	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
38	100 std	Standard	100	1: A, 6	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
39	250 std	Standard	250	1: A, 7	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
40	500 std	Standard	500	1: A, 8	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
41	750 std	Standard	750	1: B, 1	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
42	1000 std	Standard	1000	1: B, 2	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
43	DB_011	In bianco		1: B, 2	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min
44	DB_012	In bianco		1: E, 4	PFAS grad 400 UL BIOBLOCK/min - min 9 eseguire	PFCMXA + HFPO-DA MS/MS - 9 min

Tabella 1: Esempio worklist per analisi mirata e quantificazione di PFAS mediante LC-MS/MS

Tempo (min) 0	% A (acetato di ammonio di 2,5 mM in 5% MeOH) 90	% B (acetato di ammonio di 2,5 mM in 95% MeOH) 10
5	15	85
5.1	0	100
7	0	100
7.1	90	10
9	90	10

Tabella 2: Gradiente di esempio per la separazione di LC in analisi mirata

Capillare tensione (kv)	1,97
Cono in tensione (V)	15
Estrattore in tensione (V)	3
Lente di RF (V)	0.3
Temp di origine	150
Temp di desolvatazione	40
Flusso di Gas di desolvatazione (L/hr)	300
Flusso di Gas di cono (L/hr)	2

Tabella 3: Parametri di sorgente di ionizzazione per un'analisi mirata

CMP	Precursore	Prodotto	Tempo di sosta	Cono in tensione (V)	Energia di collisione (eV)
PFBA	212.80	168.75	0,01	15	10
13C. 4-PFBA È	216,80	171.75	0,01	15	10
PFPeA	262.85	218.75	0,01	15	9
PFBS ° 1	298,70	79.90	0,01	40	30
PFBS ° 2	298,70	98.80	0,01	40	28
PFHxA ° 1	312.70	118,70	0,01	13	21
PFHxA ° 2	312.70	268,70	0,01	13	10
13C. 2-PFHxA è	314.75	269.75	0,01	13	9
HFPO-DA 1°	329.16	168,90	0,01	10	12
HFPO-DA 2°	329.16	284.90	0,01	10	6
HFPO-DA È 1°	332.16	168,90	0,01	10	12
HFPO-DA È 2°	332.16	286.90	0,01	10	6
PFHpA ° 1	362.65	168.65	0,01	14	17
PFHpA ° 2	362.65	318.70	0,01	14	10
PFHxS ° 1	398.65	79.90	0,01	50	38
PFHxS ° 2	398.65	98.80	0,01	50	32
13C. 4-PFHxS è	402.65	83,90	0,01	50	38
PFOA ° 1	412.60	168.70	0,01	15	18
PFOA ° 2	412.60	368.65	0,01	15	11
13C. 4-PFOA È	416.75	371.70	0,01	15	11
PFNA ° 1	462.60	218.75	0,01	15	17
PFNA ° 2	462.60	418.60	0,01	15	11
PFNA È	467.60	422.60	0,01	15	11
PFOS ° 1	498.65	79.90	0,01	60	48
PFOS ° 2	498.65	98.80	0,01	60	38
13C. 4-PFOS È	502.60	79,70	0,01	60	48
PFDA ° 1	512,60	218.75	0,01	16	18
PFDA ° 2	512,60	468.55	0,01	16	12
2 13 - PFDA È	514.60	469.55	0,01	16	12

Tabella 4: Tabella di transizione di esempio e i parametri di MS/MS per il contenuto di PFAC-MXA, insieme a HFPO-DA

Tempo (min)	% A (acetato di ammonio di 2,5 mM in 5% MeOH)	% B (acetato di ammonio di 2,5 mM in 95% MeOH)
0	90	10
0,5	90	10
3	50	50
3.5	50	50
5.5	40	60
6	40	60
7	0	100
11	0	100

Tabella 5: Gradiente di esempio per la separazione di LC in analisi non mirati

Parametro profinder	Impostazione valore
Picco di estrazione altezza filtro	800 conteggi
Ion(s) consentito	-H / + H
Modello di caratteristica estrazione dell'isotopo	Molecole organiche comuni
Stati di pagamento consentiti	2 - Jan
Compound soglia conteggio dello ione	Due o più ioni
Tolleranza di allineamento RT	0,40 min + 0,0%
Tolleranza di massa di allineamento	20,00 ppm + 2.0mDa
Post-elaborazione altezza assoluta filtro	> = 10000 conteggi in un campione
MFE Punteggio filtro di post-elaborazione	> = 75 in un campione
Algoritmo di integrazione di picco	2 agile
Picco integrazione altezza filtro	> = 5000 conteggi
Trova di filtro di altezza assoluta di ioni	> = 7500 conteggi in un campione
Trova di Ion punteggio filtro	> = 50,00 in un campione

Tabella 6: Caratteristica molecolare estrazione e allineamento impostazioni per Profinder software. Tutti i valori non quotati mantenute le impostazioni predefinite per l'elaborazione dati.

Soglia di abbondanza di ioni	Soglie di funzionalità	Replicare la soglia (n = 5)	Tempo di esecuzione	Caratteristiche	Soglia di replicare pass	Soglia di CV pass	Caratteristiche al 90% di TIC
1 x S/N	2000	Nessuno	8.15	987	505	421	91
2 x S/N	5000	Nessuno	5.02	707	357	313	93
3 x S/N	10000	Nessuno	2.3	308	249	230	93
1 x S/N	2000	100%	3.3	603	339	297	92
2 x S/N	35000	100%	1.58	310	248	229	93
3 x S/N	10000	100%	1.45	202	190	182	92

Tabella 7: Confronto del tempo di elaborazione del campione e identificazioni caratteristica chimica per le soglie di estrazione differenti funzionalità.

Figura 1 : Totale cromatogramma ionico e cromatogrammi di ioni estratti per un sottoinsieme di standard di etere perfluorurati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Curve di calibrazione rappresentativo per composti dimostrando qualità decrescente della curva analitica costruzione. Più a sinistra pannello indica una calibrazione di alta qualità; Pannello centrale indica un composto con scarsa precisione attraverso i duplicati di preparazione, specialmente alle più alte concentrazioni; Pannello di destra indica una curva con scarsa precisione e una bassa gamma dinamica lineare, con conseguente risposta piatta all'estremità alta del range di calibrazione e nessun segnale rilevabile all'estremità inferiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Overlaid cromatogrammi ionica totale (TIC) per acque superficiali estratti raccolti a Monte e a valle di un sito di produzione fluorochimici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Ioni estratti cromatogrammi (EIC) tutti identificati caratteristiche chimiche da un campione di acqua di superficie che contiene più classi di fluorochimici. Ogni traccia chimica è un colore diverso per differenziazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Diagramma concettuale delle informazioni crude e previste per una caratteristica chimica identificata come acido dimero di esafluoropropilene ossido (HFPO-DA). Caratteristiche chimiche vengono compilati dall'estrazione software di dati grezzi da MS misurazioni e contengono cromatografiche (ad es., tempo di ritenzione (RT)) e informazioni di spettrometria di massa. Formula prevista, le strutture e le identità chimiche vengono generate dai dati di misurazione crudo per ogni funzionalità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6 : Difetto di massa trama per caratteristiche chimiche, identificato in una produzione foce (rosso, a sinistra) e acque superficiali di riferimento (blu, destra). Composti fluorurati cadono vicino e sotto il tratteggiata linea zero. Nota la serie PFOA/PFOS persistente del campione di acqua di superficie di sfondo (a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7 : Trama di difetto di massa massa vs per caratteristiche chimiche non identificate da un campione di acqua di superficie con serie omologa identificati ed etichettati dalla del nontarget pacchetto R. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8 : Lo spettro di massa di uno sconosciuto caratteristiche chimiche con intensità isotopica prevista di tre possibili formula chimica con la stessa monoisotopic mass. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9 : Spettro di frammentazione di un etere perfluorurati composto con annotato frammento picchi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10 : Rappresentazione grafica di filtraggio soglie. Da sinistra a destra, soglia di abbondanza di ioni per spettri di massa chimica caratteristica, dispongono di soglia di abbondanza per caratteristiche cromatografiche estratti e replicare la soglia per la frequenza di rilevamento di funzionalità in un esperimento di iniezione triplicate. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Preparazione e trattamento dei campioni
L'inclusione di norme di riferimento/spike sono di fondamentale importanza per qualsiasi analisi mirata, come essi forniscono un meccanismo di sostegno per il controllo di validità analitica. Mancanza di campioni QC impedisce qualsiasi valutazione dell'accuratezza dei risultati; il carattere ubiquitario di fluorochemicals significa che la contaminazione di possibilità dei campioni di campo, i materiali, o sistema LC-MS non è raro e deve essere contabilizzata. Inoltre, consente per la validazione del protocollo indipendentemente dalla variazione del campione quotidiane di elaborazione, come molti dei passaggi può essere altamente variabile, specialmente la SPE e procedure di concentrazione di esempio. L'estrazione di entrambi composti perfluorinati legacy e romanzo può essere fortemente influenzato dalla scelta della fase stazionaria per concentrazione e componenti dei campioni di origine, quali pH e salinità⁴⁶. L'influenza delle condizioni del campione dovrebbe essere considerato se particolari classi di prodotti chimici pefluorinated sono di interesse. Programmi di preparazione di campionamento alternativi per gli estratti dell'acqua possono essere utilizzati se il programma di installazione di laboratorio è disponibile e l'analisi dei dati a valle rimane simile.

Analisi mirata dei dati
Per composti con standard disponibili e isotopo stabile, abbinato con l'etichetta standard interni, la preoccupazione principale per l'analisi dei dati sono strumentali e la determinazione dei limiti di rilevabilità del metodo e idonee gamme di segnalazione possono essere determinate su un base di un laboratorio utilizzando approcci standard, come il rapporto segnale-rumore da basso livello standard picchi⁴⁷. In assenza di standard interni abbinati possono verificarsi errori da effetti matrice non corrispondenti e retro-previsione accurata dei campioni arricchiti può essere utilizzato per stimare l'accuratezza delle misurazioni. Quando in mancanza di norme per preparare una curva, una stima quantitativa di uno sconosciuto può essere ottenuta trattando in modo identico ad un livello strettamente abbinato composta, ma sono errori nella stima dell'ordine di 10 + piega con limitata capacità di quantificare l'incertezza, vedere McCord, Newton e Strynar²¹. In questi casi, dati di tendenza possono ancora essere raccolti, ma le stime di concentrazione sono intrinsecamente inaffidabili.

Analisi dei dati non mirati
Picco raccolta impostazioni hanno un impatto sostanziale sul numero di caratteristiche chimiche identificate, ma la qualità della selezione funzionalità è anche fortemente influenzata. Le decisioni di maggiore interesse la raccolta di picco sono 1) intensità delle singole masse da includere negli spettri, la soglia di abbondanza dello ione 2) l'intensità del cromatogramma Estratto picchi da considerarsi caratteristiche, il rilevamento delle feature abbondanza soglia 3) caratteristica frequenza, la soglia di replicare e 4) variazione analitica, la soglia di CV (Figura 10).

Impostazione delle soglie irrealisticamente basse per risultati di raccolta di picco in un aumento esponenziale nel tempo di campionamento per risolvere ulteriori caratteristiche di abbondanza sempre più bassa (tabella 7). I filtri di soglia dello ione-abbondanza di massa caratteristiche spettrali dove abbastanza dell'abbondanza dell'isotopo individuali non passare la soglia. Idealmente questo seleziona solo per le funzionalità con spettri MS di qualità, garantendo che sono caratteristiche chimiche reale anziché rumore strumentale e consentendo per la formula stima nella lavorazione successiva. Una soglia appropriata si basa su rumore strumentale, idealmente almeno 3 volte la soglia di rumore per MS1 scansioni. Soglia di abbondanza di funzionalità filtri caratteristiche chimiche basati sull'intensità o la zona della funzionalità cromatografica estratte. Questo passaggio consente di reiezione dei picchi di abbondanza bassa, che in genere sono di scarsa qualità cromatografica, hanno varianze alte o sono il risultato di altri estrazione software poveri. Una soglia appropriata deve essere determinata per esperimento a matrice basata su un livello accettabile di generazione di scarsa funzionalità (per esempio, caratteristiche sotto la cromatografia inaccettabilmente scarsa esposizione di soglia). Ulteriori QC analitico può essere utilizzato per rifiutare la funzionalità a livello cromatografica basata sull'identificazione incoerente in analitici e/o preparatori replicati (soglia di replica) o basato su scarsa riproducibilità attraverso repliche (soglia di CV). Livelli appropriati dipendono la qualità del picco integrazione software utilizzato e l'entità chimiche sotto inchiesta. Per composti perfluorinati solubile in acqua e protocolli di integrazione ottimizzata con leggerezza, caratteristiche devono essere identificate in 80 + % di analitica replica e CVs sono attesi a cadere sotto il 30%, come dettagliato nella sezione metodi.

I picchi rilevati dall'analisi non mirati non produrre stime quantitative delle concentrazioni dei materiali rilevati. Ulteriormente, l'identità del veri incognite possa essere difficile da confermare perché nuovi composti sono assenti da banche dati pubblicamente disponibili. Determinazione strutturale romanzo richiede un'approfondita analisi con più metodi e richiede competenze in chimica e spettrometria di massa. Tuttavia, normalizzare le aree dei picchi delle caratteristiche chimiche possono fornire stime semi-quantitativa delle concentrazioni di incognite da specie Nota²¹. Se vengono impiegate campionamento coerenza e passaggi di preparazione, informazioni sull'andamento in tempo per le singole specie possono essere generati per monitorare la persistenza di una sostanza chimica nel futuro come la risposta per una singola specie dovrebbe essere coerenza il blocco delle grandi variazioni nella matrice²¹.

Il vantaggio principale di questo metodo è l'estensibilità del trattamento del campione per permettere l'analisi sia mirata e immaturi. Mentre un'analisi mirata fornisce informazioni quantitative equivalenti o superiori, notevolmente manca ampiezza di analisi desiderato quando si tratta di materiali nuovi ed emergenti, come pure il loro rapporto di materiali a matrice. L'applicazione di una metodologia mirata, o persino un sospetto metodo di screening basato solo su materiali noti e database limitati è completamente cieco a specie precedentemente inosservata, anche se possono avere effetti significativi per la salute. Come software migliora e database diventano più robusti, la precisione di identificazione sconosciuto continuerà ad aumentare, con una concomitante diminuzione nell'investimento di tempo e livello di competenze necessarie per analizzare i dati multidimensionali generati da questo approccio. Tuttavia, i dati generati attualmente sono di significativo valore futuro perché dati bancari consente analisi post-hoc con software di nuova concezione e permette il confronto nel tempo anche se l'identità di un composto rilevato è attualmente sconosciuto.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acqity ultra-high performance liquid chromatography system	Waters Corporation		Modified with PFCs analysis kit (176001744); equivalent UPLC system is acceptible if PFAS background is checked and confirmed to be low
Ammonium acetate	Fluka	17836	Mass spectrometry grade >99% pure
Ammonium Hydroxide	Sigma-Aldrich	338818
Balance	Mettler	AB204S
BEH C18 reverse phase UPLC column, 2.1×50 mm, 1.7 μm	Waters Corporation	186002350
Dual piston syringe pump	Waters Corporation	SPC10-C
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	ARK2183
Glass Microfiber Filters	Whatman	1820-070
High density polyethelye sample bottle	Nalgene	2189-0032
High Resolution Mass Spectrometer	Various		Mass Spectrometer should be capable of providing accurate mass to <10ppm and collecting MS/MS data.  Agilent 6530 qTOF and Thermo Fisher Orbitrap Fusion were used in this work
Methanol	Sigma-Aldrich
Nitric Acid (35% w/w)	Thermo Fisher Scientific	SVCN-5-1	Can be prepared in house using concentrated nitric acid and reagent water
Polypropylene Buchner funnel	ACE Glass	12557-09
Polypropylene cenitrfuge tube and cap	BD Falcon	352096
Polypropylene Vacuum Flask (1 L)	Nalgene	DS4101-1000
Quattro Premier XE triple quadrupole mass spectrometer	Waters Corporation		Equivalent triple-quadrupole or better system can be used instead, should provide high sensitivity and stability for targeted analysis
Reagent Water			Any source determined to be PFAS free
Sodium Acetate	Sigma-Aldrich	W302406
TurboVap nitrogen evaporator	Caliper Life Sciences	103198	Equivalent systems or rotary vacuum evaporator may be used instead
Weak anion exchange SPE cartridge (Oasis WAX Plus)	Waters Corporation	186003519
Standard Solutions
2,3,3,3-Tetrafluoro-2-(1,1,2,2,3,3,3-heptafluoropropoxy)propanoic acid (HFPO-DA)	Wellington	HFPO-DA
Additional targeted compound standards of interest			to be determined based on preliminary analysis and standard availability
Mass labeled HFPO-DA	Wellington	M2HFPO-DA
Native PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL)	Wellington	PFAC-MXA	or PFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest
Stable Isotope Labeled PFCA/PFAS Mixture (2 ug/mL)	Wellington	MPFAC-MXA	or MPFAC-MXB; or individually prepared mixture containing compounds of interest as appropriate for Native PFASs
Software
Mass Profiler Professional	Agilent		Or open source software packages
Profinder	Agilent		Or open source software packages