Convección Mejorada Entrega de Vector Viral Asociado a Adeno Optogenético a la Corteza de Rhesus Macaque Bajo Guía de Imágenes de RMN en Línea

Resumen

Aquí, demostramos la convección guiada por resonancia magnética (RM) entrega mejorada (CED) de vectores virales en la corteza como un enfoque eficiente y simplificado para lograr la expresión optogenética a través de grandes áreas corticales en el cerebro macaco.

Resumen

En la optogenética de primates no humanos (NHP), infectar grandes áreas corticales con vectores virales es a menudo una tarea difícil y que requiere mucho tiempo. Aquí, demostramos el uso de resonancia magnética (RM) convección guiada entrega mejorada (CED) de vectores virales optogenéticos en corticas primarias somatosensoriales (S1) y motor (M1) de macacos para obtener una expresión cortical eficiente y generalizada de canales ióniones sensibles a la luz. Los vectores virales asociados a adenos (AAV) que codifican las opsin C1V1 de desplazamiento rojo fusionadas a proteínafluorescentes amarillas (EYFP) se inyectaron en la corteza de macacos de resus bajo CED guiado por RMN. Tres meses después de la infusión, imágenes epifluorescentes confirmaron grandes regiones de expresión optogenética (>130 mm²) en M1 y S1 en dos macacos. Además, pudimos registrar respuestas electrofisiológicas fiables de las áreas de expresión mediante matrices microelectrocortigráficas. El análisis histológico posterior y la inmunomancha contra el reportero revelaron una expresión optogenética generalizada y densa en M1 y S1 correspondiente a la distribución indicada por imágenes epifluorescentes. Esta técnica nos permite obtener expresión en grandes áreas de la corteza en un período de tiempo más corto con un daño mínimo en comparación con las técnicas tradicionales y puede ser un enfoque óptimo para el parto viral optogenético en animales grandes como los NCP. Este enfoque demuestra un gran potencial para la manipulación a nivel de red de circuitos neuronales con especificidad de tipo celular en modelos animales evolutivamente cerca de los seres humanos.

Introducción

La optogenética es una potente herramienta que permite la manipulación de la actividad neuronal y el estudio de las conexiones de red en el cerebro. La implementación de esta técnica en primates no humanos (NCP) tiene el potencial de mejorar nuestra comprensión de la computación neuronal a gran escala, la cognición y el comportamiento en el cerebro de los primates. Aunque la optogenética se ha implementado con éxito en los NCP en los últimos años^1,2,3,^4,5,6,7, un reto que los investigadores se enfrentan está alcanzando altos niveles de expresión en grandes áreas cerebrales en estos animales. Aquí, estamos proporcionando un enfoque eficiente y simplificado para lograr altos niveles de expresión optogenética en grandes áreas de la corteza en macacos. Esta técnica tiene un gran potencial para mejorar los estudios optogenéticos actuales en estos animales en combinación con la grabación de última generación^8,9 y la estimulación óptica¹⁰ tecnologías.

La entrega mejorada por convección (CED) es un método establecido de entrega de agentes farmacológicos y otras moléculas grandes, incluidos los vectores virales, al sistema nervioso central^11,12,13. Mientras que los métodos de administración convencionales implican múltiples infusiones de bajo volumen distribuidas en pequeñas regiones del cerebro, CED puede lograr una distribución más amplia y uniforme de los agentes con menos perfusiones. El flujo de fluido a granel (convección) impulsado por presión durante la perfusión permite una transducción distribuida más ampliamente y uniformemente del tejido objetivo al administrar vectores virales con CED. En estudios recientes, demostramos la transducción y posterior expresión optogenética de grandes áreas de masilla primaria (M1) y somatosensorial (S1) cortices⁹ y thalamus¹⁴ utilizando Resonancia magnética (MR) guiada por CED.

Aquí, delineamos el uso de CED para lograr la expresión optogenética en grandes áreas corticales con sólo unas pocas inyecciones corticales.

Protocolo

Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus sitios) de la Universidad de California, San Francisco y cumplen con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El siguiente procedimiento se realizó utilizando dos macacos machos adultos de 8 y 7 años de edad, con un peso de 17,5 kg y 16,5 kg (mono G y mono J), respectivamente.

NOTA: Utilice técnicas asépticas estándar para todos los procedimientos quirúrgicos.

1. Imágenes de línea de base

1. Sedar e intubar al animal y mantener la anestesia general bajo isoflurano (concentración cambiada entre 0 a 5% según sea necesario, dependiendo de los signos vitales como la frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca). Controle la temperatura del animal, la frecuencia cardíaca, la saturación de oxígeno, las respuestas electrocardiográficas y la presión parcial final del CO₂ durante todo el procedimiento.
2. Coloque el animal en un marco estereotaxico compatible con MR (consulte la Tabla de Materiales)en el que permanecerá durante todo el procedimiento. Conecte el animal a una máquina de isoflurano compatible con RM portátil y llévelo al escáner de RMN (3 T).
3. Adquirir T1 estándar (ángulo de volteo a 9o, tiempo de repetición/tiempo de eco a 668,6, tamaño de matriz: 192 x 192 x 80, espesor de la rebanada 1 mm) y T2 (ángulo de volteo a 130o, tiempo de repetición/tiempo de eco a 52,5, tamaño de matriz a 256 x 256 x 45, espesor de la rebanada a 1 mm) imágenes anatómicas MR como imágenes anatómicas MR referencia y para la planificación quirúrgica.
4. Recuperar al animal de la anestesia y transportarlo a la zona de alojamiento de los animales.
5. Utilice las imágenes T1 y T2 adquiridas para determinar la colocación de la craneotomía. La ubicación de la craneotomía se puede determinar con precisión haciendo coincidir el área cortical de interés de RM con el atlas cerebral macaco (Paxinos, Huang, Petride, Toga 2^nd Edition). Además, estas imágenes de referencia pueden proporcionar una estimación de las ubicaciones de la perfusión viral. Las regiones corticales de interés que se muestran aquí son M1 y S1.

2. Implantación de cámara compatible con RM

1. Sedar e intubar al animal y mantener la anestesia general con monitoreo anestésico estándar como en 1.1.
2. Coloque el animal en el marco estereotaxico compatible con RM en el que permanecerá durante la implantación de la cámara y la administración de vectores virales. Conecte el animal a una máquina de isoflurano compatible con MR portátil.
3. Crear una incisión sagital aproximadamente 2 cm de la línea media con una longitud de unos 5 cm con un bisturí.
4. Retire el tejido blando subyacente del cráneo con ascensores (ver Tabla de materiales).
5. Crear una craneotomía circular (2,5 cm de diámetro) para cubrir las trayectorias preplanificadas para las inyecciones utilizando un trephine (ver Tabla de Materiales).
   1. Baje el punto de centrado del trephine más allá del borde de la trephine. Crear una sangría en el centro de la craneotomía planificada lo suficientemente profundo en el cráneo para anclar la trephine usando el punto de centrado ajustable de la trephine. Tenga cuidado para evitar penetrar completamente a través de la profundidad del cráneo, ya que esto podría causar daño al tejido neural subyacente.
   2. Enjuague periódicamente el área con salina según sea necesario para mantener la humedad tisular a lo largo de la craneotomía.
   3. Una vez que se haya hecho el centro, baje el trephine sobre el cráneo y gire el trephine en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj mientras aplica presión descendente hasta que la tapa ósea se pueda extraer con fórceps. Tenga cuidado para evitar dañar el tejido subyacente con la trefina.
6. Enhebrar una sutura fina (tamaño 6-0) a través de la dura en el centro de la craneotomía y levantar la dura tirando suavemente de la sutura de la superficie del cerebro creando una tienda de campaña en el centro de la craneotomía.
7. A continuación, perforar la dura cerca del centro de la tienda usando tijeras oftálmicas finas para evitar dañar el cerebro. A continuación, corte la dura desde el centro hasta el borde de la craneotomía y continúe a lo largo del borde con tijeras opthalmic finas.
8. Monte la cámara cilíndrica compatible con CED a medida cED MR (Figura1; ver sección 4 para obtener instrucciones de producción) en el cráneo en la parte superior de la craneotomía para proporcionar soporte de cánula durante la perfusión de CED de modo que la curvatura de la brida de la cámara se alinee bien con la curvatura del cráneo.
9. Fije los implantes al cráneo con tornillos de plástico y acrílico dental o algunos tornillos de titanio.

3. Entrega de vectores virales

1. Poco después de implantar la cámara compatible con MR e insertar la rejilla de inyección de cánula (Figura1A-B, Figura suplementaria 1) en la cámara, llenar la rejilla con salina (0,9% NaCl) para visualizar los lugares de inyección a través de imágenes anatómicas de RM y llenar las cavidades de la cámara con gelatina absorbible estéril húmeda para mantener la humedad del cerebro (Figura 1F).
2. Cubra la piel y el cilindro con una cortina antimicrobiana estéril para mantener la esterilidad de los cilindros durante el transporte y las infusiones de RM. Coloque una cápsula de vitamina E para marcar la parte superior de la rejilla de inyección para una identificación positiva.
3. Mientras el animal permanece intubado, desconecte el tubo endotraqueal del circuito de anestesia y vuelva a conectarlo a una máquina de isoflurano compatible con RM portátil y transporte al animal al escáner de RMN.
4. Adquiera las imágenes T1 (ángulo de giro a 9o, tiempo de repetición/tiempo de eco, 668,6, tamaño de matriz 192 x 192, espesor de la rebanada de 1 mm, 80 rodajas) para calcular la distancia desde la parte superior de la rejilla de inyección y la superficie cortical. La cápsula de vitamina E es claramente visible en imágenes T1 y debe utilizarse como marcador para la parte superior de la rejilla de inyección (Figura2A). Utilice la herramienta de regla del software de imágenes MR para medir la distancia entre la parte superior de la rejilla de inyección y la superficie cortical.
5. Adquiera imágenes de T2 (ángulo de volteo de 130o, tiempo de repetición/tiempo de eco 52,5, tamaño de matriz 256 x 256, espesor de la rebanada a 1 mm, 45 rodajas) para determinar las guías de cánula óptimas para cada sitio en función del lugar de perfusión objetivo (Figura2B-C). Como se mencionó anteriormente, la cuadrícula de cánulas está llena de salina que es mejor visible en las imágenes T2. Usando el software de imágenes por RMN, desplácese a través de los planos coronal y sagital para encontrar la ubicación objetivo de la perfusión.
6. Después de descongelar el vector viral durante unas horas a temperatura ambiente, mezcle el vector viral con el gadoteridol del agente de contraste MR (Ratio de 250:1; 2mM Gd-DTPA, ver Tabla de Materiales)por pipeta o mezcla de vórtice.
   NOTA: La técnica presentada se probó para vectores AAV con un promotor CamKIIa expresión de conducción de C1V1 fusionado a EYFP (AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, titer: 2.5 x 10¹² moléculas de virus/ml; ver Tabla de Materiales).
7. Cargue el virus mezclado en un tubo IV de alta presión de 0,2 ml (ver Tabla de Materiales).
8. Establezca un campo estéril fuera del escáner de RMN para preparar la línea de perfusión viral.
9. Utilizando tubos IV de alta presión, conecte una larga línea de extensión (aproximadamente 3-5 metros, dependiendo de la ubicación de la bomba de perfusión con respecto al orificio de RM) a una jeringa de 3 ml compatible con RM y ceba con solución salina.
10. Conecte el extremo distal de la línea de extensión larga al extremo proximal del tubo IV de 0,2 ml cargado con el virus y conecte la cánula resistente al reflujo con una punta escalonada de 1 mm (Figura2D;ver sección 5 para las instrucciones de producción de cánulas) al extremo distal de este conjunto con un conector de catéter de estilo abrazadera (ver Tabla de Materiales)(Figura2E).
11. Por último, coloque la jeringa en una bomba compatible con MR (ver Tabla de materiales). Coloque el controlador de la bomba en la sala de control del escáner, ya que no es compatible con MR.
12. Utilizando las imágenes de RM anatómicas de línea base obtenidas antes, seleccione la ubicación de la rejilla de inyección de cánula y la profundidad de inserción necesarias para llegar al lugar de perfusión objetivo. Marque la profundidad de inserción en la cánula con cinta estéril.
13. Iniciar la perfusión a una velocidad de 1 l/min y validar visualmente el flujo del líquido en la línea de perfusión observando la expulsión de líquido desde la punta de la cánula.
14. Inserte la cánula manualmente a través de la rejilla de inyección a la profundidad objetivo mientras mantiene el flujo en la línea de perfusión, ya que esto evitará que el tejido penetrado obstruya la cánula durante la inserción.
15. Adquiera imágenes ponderadas rápidas (2 minutos) tensas T1 (ángulo de volteo a 30o, tiempo de repetición/tiempo de eco a 3,05, tamaño de matriz 128 x 128, espesor de la rebanada de 1 mm y 64 rodajas) para el monitoreo en línea de la perfusión vectorial viral.
16. Después de infundir 10 l del vector de tal manera que se infunde suficiente virus para detectar en el escáner de RM, obtener imágenes de RM para verificar la colocación correcta de la cánula como lo demuestra la propagación observada del virus. Si la profundidad de la cánula insertada es incorrecta, ajuste la profundidad en consecuencia o retire lentamente la cánula y vuelva a intentar la inserción como en 3.12.
17. Supervise la perfusión a través de la orientación de imágenes de RM en línea (flash T1 ponderado) y aumente la velocidad de perfusión a 5 l/min en 1 l/min cada pocos minutos (figura3A).
18. Después de infundir aproximadamente 40 l del vector viral, comience a reducir la velocidad de perfusión en pasos de 1 L/min y detenga la perfusión después de que se inyecte 50 l y deje la cánula en su lugar durante 10 minutos.
19. Retire lentamente la cánula del cerebro y muévase a la siguiente ubicación. Repita los pasos 3.9 a 3.19 para cada ubicación.
20. Cubra el cilindro con una cortina estéril al final de las inyecciones, antes del transporte animal. A continuación, transportar el animal de vuelta al quirófano.
21. Explantar la cámara compatible con RM y cerrar la incisión quirúrgica reemplazando el colgajo óseo y el músculo que cubre y suturando la piel utilizando técnicas asépticas estándar o reemplazar la cámara con un cilindro de titanio y dura artificial (ver 2016⁹) para el registro y la estimulación neuronal.

4. Producción de cámara compatible con MR

1. Fabricar la rejilla de inyección de cánula de nylon (Figura1A-B) mecanizando de acuerdo con las dimensiones especificadas (FiguraSuplementaria 1).
2. Imprima en 3D el cilindro compatible con MR de acrilonitrilo butadieno estireno (plástico ABS0 (Figura 1C-E) (véase Archivo suplementario 1–3; véase Tabla de materiales para impresoras y materiales 3D).
   NOTA: Un diseño mantiene una rejilla de inyección de cánula fija dentro del cilindro compatible con MR (Figura1C),mientras que otro permite la rotación de la rejilla, extendiendo la región de inyección (Figura1D-E).
3. Enrosque la rejilla de inyección de cánula y toque la cavidad correspondiente de la cámara compatible con MR de forma que ambas piezas exhiban el mismo roscado.
   NOTA: Se puede utilizar cualquier tipo de subprocesamiento siempre que ambos componentes tengan el mismo subproceso.
4. Inserte la rejilla de inyección de cánula de nylon atornillando el orificio roscado del cilindro compatible con MR.

5. Producción de cánulas resistente al reflujo¹³

1. Corte un tubo de sílice de 30 cm de largo con 0,32 mm ID y 0,43 mm de DIÁMETRO para el tubo de sílice interior (ver Tabla de Materiales)utilizando una cuchilla de afeitar.
2. Corte un tubo de sílice de 7,5 cm de largo y un tubo de sílice de 5 cm de largo con 0,45 mm ID y 0,76 mm de DIÁMETRO para el tubo de sílice exterior (ver Tabla de Materiales).
3. Adherir el tubo exterior de 7,5 cm al tubo interior de 30 cm con cianoacrilato de tal manera que el tubo interior se extienda 1 mm más allá del tubo exterior, haciendo que el paso resistente al reflujo (Figura2D). Para asegurarse de que el cianoacrilato no entre en el interior del tubo interior, coloque el cianoacrilato en el exterior del tubo interior lejos de la punta de la cánula.
4. Pegue el tubo de sílice de 5 cm de largo en el otro extremo del tubo interior para su fijación al conector del catéter estilo abrazadera (ver paso 3.10).

Resultados

Entrega mejorada por convección (CED) bajo la Guía de RMN

La propagación del vector viral se monitorizó durante la perfusión de CED bajo la guía de imágenes de RM en línea (Figura3A). En este estudio, S1 y M1 de dos monos fueron atacados (Figura3B). Los volúmenes de distribución tridimensional se estimaron en un análisis post-hoc de las imág...

Discusión

Aquí, delineamos una técnica factible y eficiente para lograr la expresión optogenética a gran escala en la corteza primaria somatosensorial y motora de NHP por CED guiada por RMN. El uso de CED guiado por RMN presenta ventajas significativas sobre los métodos tradicionales de infusión viral en el cerebro NHP. Una de estas ventajas es la capacidad de lograr la expresión en grandes áreas con menos infusiones necesarias. Por ejemplo, con métodos convencionales, múltiples inyecciones de 1-2 l de la expresión de r...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL High Pressure IV Tubing	Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA	533640
0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing	Polymicro Technologies	1068150027
0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing	Polymicro Technologies	1068150625
AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP	Penn Vector Core, University of Pennsylvania
ABS plastic	Stratasys, MN, USA	ABSplus-P430
Antimicrobial incise drape	3M	6650EZ	Ioban Drape
Dental Acrylic	Henry Schein, Inc.	1013117	Acrylic Bonding Agent
Elevators	VWR International, LLC.	10196-564	Langenbeck Elevator, Wide Tip
Fine suture	McKesson Medical-Surgical Inc.	1034505
Gadoteridol	Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ	0270-1111-04
Laser for light stimulation	Omicron-Laserage, Germany	PhoxX 488-60
MR compatible 3 cc syringe	Harvard apparatus, Holliston, MA, USA	59-8377
MR Imaging Software	Pixmeo	OsiriX MD 10.0
MR-Compatible Pump	Harvard apparatus, Holliston, MA, USA	Harvard PHD 2000
MR-compatible stereotaxic frame	KOPF	1430M MRI
Perifix Clamp Style Catheter Connector	B-Braun, Bethlehem, PA, USA	N/A
Plastic Screws	Plastics 1	0-80 x 1/8N	Nylon screws
Titanium screws	Crist Instrument Co., Inc.	6-YCX-0312	Self-tapping bone screws
Trephine	GerMedUSA Inc,	SKU:GV70-42
uPrinter SE 3D printer	Stratasys, MN, USA	N/A
Vitamin E Capsule	Pure Encapsulations, LLC.	DE1
Wet sterile absorbable gelatin	Pfizer Inc.	AZL0009034201	Gelfoam