在在线 MRI 图像的指导下,对流增强将视遗传阿德诺相关病毒载体输送到 Rhesus Macaque 的皮质

摘要

在这里,我们演示了磁共振 (MR) 引导的对流增强病毒载体到皮层 (CED) 到皮层作为一种有效和简化的方法,以实现光遗传学表达在大型皮质区域在猴脑。

摘要

在非人类灵长类动物(NHP)光遗传学中,用病毒载体感染大型皮质区域通常是一项困难而耗时的任务。在这里,我们演示了使用磁共振 (MR) 引导对流增强交付 (CED) 光遗传学病毒载体到原发性躯体感觉 (S1) 和运动 (M1) 皮质的猴获得高效, 广泛皮质表达光敏性电子通道。在MR引导的CED下,将编码红移蛋白C1V1的Adeno相关病毒(AAV)载体注射到恒河猴皮层中,将这种蛋白注入黄色荧光蛋白(EYFP)。输液后三个月,显微荧光成像在M1和S1中确认两只猴子有大面积的光遗传学表达(>130 mm 2)。此外,我们还能够使用微电皮学阵列记录来自表达区域的可靠光唤起电生理反应。后来对记者进行组织学分析和免疫染色后发现,M1和S1中广泛而密集的光遗传学表达与表显荧光成像所指示的分布相对应。与传统技术相比,这种技术使我们能够在较短的时间内获得皮层大面积的表达,损害最小,并且可能是大型动物(如NHPs)的光遗传学病毒传播的最佳方法。这种方法显示了在动物模型中具有细胞型特异性的神经回路的网络级操作的巨大潜力。

引言

光遗传学是一个强大的工具,允许操作神经活动和研究大脑中的网络连接。在非人类灵长类动物(NHPs)中实施这种技术有可能增强我们对灵长类动物大脑中大规模神经计算、认知和行为的理解。虽然光遗传学近年来在NHP中已经成功实施了1、2、3、4、5、6、7,这是一个挑战,研究人员面对的是这些动物在大脑大区域实现高水平的表达。在这里,我们提供一种高效和简化的方法,以实现高浓度的光遗传学表达在大脑皮层的大片区域在猴。这项技术具有巨大的潜力,可以结合最先进的记录8、9和光学^刺激10技术,提高这些动物目前的光遗传学研究。

对流增强传递(CED)是一种既定的方法,将药理剂和其他大分子(包括病毒载体)输送到中枢神经系统11、12、13。传统的输液方法涉及分布在大脑小区域的多个低容量输注,而CED可以以更少的输注实现更广泛、更均匀的代理分配。输注过程中压力驱动的散装流体流动(对流)允许在使用CED传播病毒载体时更广泛地均匀地分布目标组织。在最近的研究中,我们使用磁共振(MR)引导的CED演示了大面积原马达(M1)和躯体感觉(S1)皮^质9和丘拉丘14的转导和后续光遗传学表达。

在这里,我们概述了使用CED实现光遗传学表达在大型皮质区域,只需几个皮质注射。

研究方案

所有程序均经加州大学旧金山机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准,并符合《实验室动物护理和使用指南》。以下手术分别使用两只8岁、7岁的成年雄性河河猴,体重分别为17.5公斤和16.5公斤(猴子G和猴子J)。

注:对所有外科手术使用标准无菌技术。

1. 基线成像

1. 在异胶下对动物进行隔离和插管,维持一般麻醉(浓度根据需要变化在0至5%之间,取决于呼吸速率和心率等生命体征)。在整个过程中监测动物的温度、心率、氧饱和度、心电图反应和CO2的末潮部分压力。
2. 将动物置于与 MR 兼容的立体框架中(参见材料表),在整个过程中,它将保留在其中。将动物连接到便携式 MR 兼容异形胶机,并将其传送到 MRI 扫描仪 (3 T)。
3. 获取标准 T1(翻转角度 = 9°,重复时间/回波时间 = 668.6,矩阵大小 = 192 x 192 x 80,切片厚度 = 1 mm)和 T2(翻转角度 = 130°,重复时间/回波时间 = 52.5,矩阵大小 = 256 x 256 x 45,切片厚度 = 1 mm)解剖 MR 图像作为基线 参考和手术规划。
4. 从麻醉中恢复动物,并将其运送到动物居住区。
5. 使用采集的 T1 和 T2 图像确定颅骨切除术的位置。颅内切除术的位置可以通过将MR的皮质区域与猴脑图集(帕克西诺斯、黄、彼得里德、托加第2^版)进行精确确定。此外,这些基线图像可以提供病毒输注位置的估计。此处演示的感兴趣皮质区域是 M1 和 S1。

2. MR 兼容腔室植入

1. 通过标准麻醉监测,对动物进行麻醉和插管,保持常规麻醉,如1.1。
2. 将动物置于与 MR 兼容的立体框架中,使其在整个腔室植入和病毒载体输送过程中保持。将动物连接到便携式 MR 兼容异类胶机。
3. 用手术刀从中线约2厘米,长约5厘米,创建一个下垂切口。
4. 使用电梯从颅骨中取出底层软组织(参见材料表)。
5. 创建一个圆形颅骨切除术(直径2.5厘米),以覆盖预先规划的轨迹,用于使用颤音注射(见材料表)。
   1. 将颤音的中心点降低到颤音的边缘。在颅骨底部足够深的计划颅内切除术的中心创建一个缩进,以便使用可调节的颅骨中心点锚定颅骨。小心避免完全穿透颅骨的深度,因为这可能导致对底层神经组织的损害。
   2. 根据需要定期用盐水冲洗区域,以保持整个颅骨切除术的组织水分。
   3. 做心后,将颅骨降至头骨上,顺时针和逆时针旋转三脚架,同时施加向下压力,直到用钳子取出骨帽。小心避免用颤音破坏底层组织。
6. 穿过颅内切除术中心的杜拉(大小6-0)的细缝合线,通过轻轻地从大脑表面拉出缝合线,在颅内切除术的中心形成一个帐篷来提升杜拉。
7. 接下来,用精细的眼科剪刀刺穿帐篷中心附近的杜拉,以避免损害大脑。然后,将 Dura 从中心切到颅骨切除术的边缘,然后沿边缘使用精细的眼科剪刀继续。
8. 将圆柱形定制 CED MR 兼容室(图1;参见第 4 节,了解生产说明)安装到颅骨顶部颅骨,在 CED 输注期间提供管状支撑,使腔室法兰的曲率对齐以及头骨的曲率。
9. 使用塑料螺钉和牙科丙烯酸或几个钛螺钉将植入物固定到头骨上。

3. 病毒载体传递

1. 植入 MR 兼容腔室并将导管注射网格(图 1A-B,补充图1)插入腔室后不久,向网格中填充盐水(0.9% NaCl),以便通过 MR 解剖图像和用湿无菌吸收明胶填充腔体以保持大脑的水分(图1F)。
2. 用无菌抗菌素窗帘覆盖皮肤和气缸,以保持输油罐在输送和 MR 输注过程中的无菌性。放置一个维生素E胶囊,在注射网格的顶部标记,以进行阳性识别。
3. 当动物保持插管时,从麻醉回路中分离内切管,并将其重新连接到便携式MR兼容的异氟拉机,然后将动物运送到MRI扫描仪。
4. 获取 T1 图像(翻转角度 = 9°,重复时间/回波时间 = 668.6,矩阵大小 = 192 x 192,切片厚度 = 1 mm,80 切片),以计算与喷射网格顶部和皮质表面的距离。维生素E胶囊在T1图像中清晰可见,应作为注射网格顶部的标记(图2A)。使用 MR 成像软件的标尺工具测量喷射网格顶部与皮质表面之间的距离。
5. 获取 T2 图像(翻转角度 = 130°,重复时间/回波时间 = 52.5,矩阵大小 = 256 x 256,切片厚度 = 1 mm,45 片),根据输注的目标位点确定每个站点的最佳导管导轨(图 2B-C)。如前所述,管状网格中充满了盐水,在 T2 图像中最明显。使用MR成像软件,滚动通过日冕和下垂平面,找到输液的目标位置。
6. 在室温下解冻病毒载体几个小时后,通过移液器或涡旋混合将病毒载体与MR造影剂加多特利多尔(比250:1;2mM Gd-DTPA,见材料表)混合。
   注:该技术对AAV载体进行了测试,其C1V1的CamKIIa启动子驱动表达融合到EYFP(AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP,点位:2.5 x 10¹²病毒分子/mL;见材料表)。
7. 将混合病毒加载到 0.2 mL 高压 IV 管中(参见材料表)。
8. 在 MR 扫描仪外部建立无菌场,用于准备病毒输注管。
9. 使用高压 IV 管,将长延长线(约 3-5 米,取决于输注泵相对于 MR 孔的位置)连接到 MR 兼容的 3 mL 注射器和带盐水的质。
10. 将长延长线的远端连接到装有病毒的 0.2 mL IV 管的近端,并将抗回流管用 1 mm 阶梯尖(图 2D;参见第 5 节的导管生产说明)连接到此组件带有夹式导管连接器(参见材料表)(图 2E)。
11. 最后,将注射器设置在兼容 MR 的泵中(参见材料表)。将泵控制器放在扫描仪控制室中,因为它与 MR 不兼容。
12. 使用之前获得的基线解剖 MR 图像,选择到达目标输注部位所需的管状注射网格位置和插入深度。使用无菌胶带标记管上的插入深度。
13. 以 1 μL/min 的速率开始输注,并通过观察液体从管尖喷出来目视验证输液管中的流量。
14. 将导管手动通过注射网格插入目标深度,同时保持输液管中的流量,因为这将防止渗透的组织在插入过程中堵塞导管。
15. 获取快速(2分钟)闪光T1加权图像(翻转角度= 30°,重复时间/回波时间= 3.05,矩阵大小 = 128 x 128,切片厚度 = 1 mm,64片),用于在线监测病毒载体输注。
16. 注入载体的 ±10 μL,以便注入足够的病毒以在 MR 扫描仪中检测后,获取 MR 图像以验证正确的管状放置,这明显表现在观察到的病毒传播中。如果插入的导管深度不正确,请相应地调整深度或缓慢地拆下导管,然后重新尝试插入,如 3.12 中。
17. 通过在线 MR 图像(闪存 T1 加权)的引导监控输注,并将输注速率提高到 5 μL/min,每隔几分钟增加 1 μL/min 步数(图 3A)。
18. 注入大约40μL的病毒载体后,开始将输注速率降低1μL/min步数,并在注射+50μL后停止输注,并将导管留在原位10分钟。
19. 慢慢从大脑中取出导管,并移动到下一个位置。对每个位置重复步骤 3.9 到 3.19。
20. 在动物运输前,在注射结束时用无菌窗帘盖住气缸。然后把动物运回手术室。
21. 要么切除MR兼容室,通过更换骨瓣和上覆肌肉,并使用标准的无菌技术缝合皮肤,或者用钛缸和人造Dura替换腔室,关闭手术切口(参见Yazdan-Shahmorad等人2016^年9),用于神经记录和刺激。

4. 兼容MR的腔室生产

1. 根据指定的尺寸加工尼龙管状注射网格(图1A-B)(补充图1)。
2. 3D 打印 MR 兼容的气缸,用丙烯酰胺苯乙烯(ABS0 塑料 (图 1C-E)(参见补充文件 1⁄3;参见 3D 打印机和材料的材料表)。
   注:一种设计在MR兼容的圆柱体内维护一个固定的管状喷射网格(图1C),而另一种设计允许网格旋转,从而扩展喷射区域(图1D-E)。
3. 螺纹导管喷射网格,然后敲击 MR 兼容腔室的相应腔,使两个片件呈现相同的螺纹。
   注:如果两个组件具有相同的螺纹,则可以使用任何类型的螺纹。
4. 将尼龙管扣喷射网格拧入兼容 MR 的气缸的螺纹孔中。

5. 抗回流环管生产¹³

1. 使用剃刀刀片切割 30 厘米长、ID 为 0.32 mm 和 0.43 mm 的内硅管(参见材料表)的硅管。
2. 切割一个7.5厘米长和5厘米长的硅管,0.45毫米ID和0.76毫米外硅管的外径(见材料表)。
3. 将 7.5 厘米外管粘附到 30 厘米内管中,使用氰丙烯酸酯,使内管延伸到外管外 1 mm,使反流步骤(图2D)。为确保氰化丙烯酸酯不会进入内管内部,将氰丙烯酸酯放在远离管尖的内管外侧。
4. 将 5 厘米长的硅胶管粘贴到内管的另一端,以连接到夹式导管接头(参见步骤 3.10)。

结果

在 MRI 指导下对流增强交付 (CED)

病毒载体的传播在CED输注期间在在线MR图像的指导下监测(图3A)。在这项研究中,两只猴子的S1和M1成为攻击目标(图3B)。雅兹丹-沙赫莫拉德等人于2016^年9月9日对MR图像(图3C)进行了事后分析,证实了对大?...

讨论

本文概述了一种可行、高效的技术,通过MR引导的CED在NHP原发性躯体感觉和运动皮层中实现大规模光遗传学表达。与NHP大脑中传统的病毒输注方法相比,MR引导的CED的使用具有显著的优势。其中一个优势是能够在需要输注的大面积区域获得表达。例如,在常规方法中,在直径为 2-3 mm 的区域1、2、5、17 中多次注入 1-2 μL 的载体...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL High Pressure IV Tubing	Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA	533640
0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing	Polymicro Technologies	1068150027
0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing	Polymicro Technologies	1068150625
AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP	Penn Vector Core, University of Pennsylvania
ABS plastic	Stratasys, MN, USA	ABSplus-P430
Antimicrobial incise drape	3M	6650EZ	Ioban Drape
Dental Acrylic	Henry Schein, Inc.	1013117	Acrylic Bonding Agent
Elevators	VWR International, LLC.	10196-564	Langenbeck Elevator, Wide Tip
Fine suture	McKesson Medical-Surgical Inc.	1034505
Gadoteridol	Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ	0270-1111-04
Laser for light stimulation	Omicron-Laserage, Germany	PhoxX 488-60
MR compatible 3 cc syringe	Harvard apparatus, Holliston, MA, USA	59-8377
MR Imaging Software	Pixmeo	OsiriX MD 10.0
MR-Compatible Pump	Harvard apparatus, Holliston, MA, USA	Harvard PHD 2000
MR-compatible stereotaxic frame	KOPF	1430M MRI
Perifix Clamp Style Catheter Connector	B-Braun, Bethlehem, PA, USA	N/A
Plastic Screws	Plastics 1	0-80 x 1/8N	Nylon screws
Titanium screws	Crist Instrument Co., Inc.	6-YCX-0312	Self-tapping bone screws
Trephine	GerMedUSA Inc,	SKU:GV70-42
uPrinter SE 3D printer	Stratasys, MN, USA	N/A
Vitamin E Capsule	Pure Encapsulations, LLC.	DE1
Wet sterile absorbable gelatin	Pfizer Inc.	AZL0009034201	Gelfoam