Convezione Consegna migliorata del vettore virale optogenetico adeno-associato alla Corteccia di Rhesus Macaque Sotto la guida di immagini MRI online

Riepilogo

Qui, dimostriamo la risonanza magnetica (MR) guidata dalla convezione migliorata (CED) dei vettori virali nella corteccia come un approccio efficiente e semplificato per ottenere l'espressione optogenetica attraverso grandi aree corticali nel cervello macaco.

Abstract

Nell'optogenetica dei primati non umani (NHP), infettare grandi aree corticali con vettori virali è spesso un compito difficile e dispendioso in termini di tempo. Qui, dimostriamo l'uso di risonanza magnetica (MR) convezione avanzata consegna (CED) di vettori virali optogenetici in cortici somatosensoriali primari (S1) e motori (M1) di macachi per ottenere un'espressione corticale efficiente e diffusa di canali ionici sensibili alla luce. I vettori virali associati ad adeno (AAV) che codificano l'opsin C1V1 con spostamento rosso sono stati iniettati nella corteccia dei macachi rhesus sotto il CED guidato dalla RM. Tre mesi dopo l'infusione, l'imaging epifluorescente ha confermato ampie regioni di espressione optogenetica (>130 mm²) in M1 e S1 in due macachi. Inoltre, siamo stati in grado di registrare risposte elettrofisiologiche affidabili evocate dalla luce dalle aree che esprimono utilizzando array microelettrocorticografici. L'analisi istologica successiva e l'immunostaining contro il reporter hanno rivelato un'espressione optogenetica diffusa e densa in M1 e S1 corrispondente alla distribuzione indicata dall'imaging epifluorescente. Questa tecnica ci permette di ottenere l'espressione su vaste aree della corteccia entro un periodo di tempo più breve con danni minimi rispetto alle tecniche tradizionali e può essere un approccio ottimale per la consegna virale optogenetica in animali di grandi dimensioni come gli NNP. Questo approccio dimostra un grande potenziale per la manipolazione a livello di rete dei circuiti neurali con specificità di tipo cellulare nei modelli animali evolutivamente vicini agli esseri umani.

Introduzione

L'optogenetica è un potente strumento che consente la manipolazione dell'attività neurale e lo studio delle connessioni di rete nel cervello. L'implementazione di questa tecnica nei primati non umani (NHP) ha il potenziale per migliorare la nostra comprensione del calcolo neurale su larga scala, cognizione, e il comportamento nel cervello dei primati. Sebbene l'optogenetica sia stata implementata con successo negli NFP negli ultimi anni^{1,2,3,4,5,6,7}, una sfida che ricercatori faccia sta raggiungendo alti livelli di espressione in grandi aree del cervello in questi animali. Qui, stiamo fornendo un approccio efficiente e semplificato per raggiungere alti livelli di espressione optogenetica in vaste aree della corteccia nei macachi. Questa tecnica ha un grande potenziale per migliorare gli studi optogenetici attuali in questi animali in combinazione con la registrazione all'avanguardia^8,9 e stimolazione ottica¹⁰ tecnologie.

La convezione avanzata Delivery (CED) è un metodo consolidato di consegna di agenti farmacologici e altre grandi molecole, tra cui vettori virali, al sistema nervoso centrale^11,12,13. Mentre i metodi di consegna convenzionali comportano infusioni multiple a basso volume distribuite tra piccole regioni del cervello, il CED può ottenere una distribuzione più ampia e uniforme degli agenti con meno infusioni. La convezione (convezione) di fluido sfuso guidato dalla pressione durante l'infusione consente una trasduzione più ampia e uniforme del tessuto bersaglio quando si forniscono vettori virali con CED. In studi recenti, abbiamo dimostrato la trasduzione e la successiva espressione optogenetica di ampie aree del motore primario (M1) e somatosensoriale (S1) cortices⁹ e talamo¹⁴ utilizzando la risonanza magnetica (MR) guidato CED.

Qui, illustreremo l'uso del CED per ottenere l'espressione optogenetica in grandi aree corticali con solo poche iniezioni corticali.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dall'Università della California, San Francisco Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e sono conformi alla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. La seguente procedura è stata eseguita utilizzando due macachi rhesus maschi adulti di 8 e 7 anni di età, del peso rispettivamente di 17,5 kg e 16,5 kg (scimmia G e scimmia J).

NOTA: utilizzare tecniche asestetiche standard per tutte le procedure chirurgiche.

1. Imaging di base

1. Sedare e intubare l'animale e mantenere l'anestesia generale sotto isoflurane (la concentrazione è cambiata tra 0 e 5% in base alle esigenze, a seconda dei segni vitali come la frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca). Monitorare la temperatura dell'animale, la frequenza cardiaca, la saturazione di ossigeno, le risposte elettrocardiografiche e la pressione parziale finale delle maree di CO₂ durante tutta la procedura.
2. Posizionare l'animale in un telaio stereotassico compatibile con MR (vedere la Tabella dei Materiali) in cui rimarrà per tutta la procedura. Collegare l'animale a una macchina portatile di isoflurane compatibile con MR e trasportarlo allo scanner MRI (3 T).
3. Acquisire il T1 standard (angolo di rilancio - 9o, tempo di ripetizione/eco - 668,6, dimensione della matrice: 192 x 192 x 80, spessore della fetta , 1 mm) e T2 (angolo di rilancio : 130 , tempo di ripetizione/tempo di eco , 52,5, dimensione della matrice, 256 x 256 x 45, spessore della fetta e 1 mm di immagini MR anatomiche) come linea di base riferimento e per la pianificazione chirurgica.
4. Recuperare l'animale dall'anestesia e trasportarlo nell'area di alloggiamento degli animali.
5. Utilizzare le immagini T1 e T2 acquisite per determinare il posizionamento della craniotomia. La posizione della craniotomia può essere determinata con precisione abbinando l'area corticale di interesse da MR con l'atlante del cervello del macaco (Paxinos, Huang, Petride, Toga 2^nd Edition). Inoltre, queste immagini di base possono fornire una stima per le posizioni dell'infusione virale. Le regioni corticali di interesse qui dimostrate sono M1 e S1.

2. Impianto camera compatibile con MR

1. Sedare e intubare l'animale e mantenere l'anestesia generale con monitoraggio anestetico standard come in 1.1.
2. Posizionare l'animale nel telaio stereotassico compatibile con MR in cui rimarrà durante l'impianto della camera e la consegna di vettori virali. Collegare l'animale a una macchina isoflurane compatibile con MR portatile.
3. Creare un'incisione sagittale a circa 2 cm dalla linea mediana con una lunghezza di circa 5 cm con un bisturi.
4. Rimuovere il tessuto molle sottostante dal cranio utilizzando ascensori (vedere Tabella dei materiali).
5. Creare una craniotomia circolare (di2,5 cm di diametro) per coprire le traiettorie pre-pianificate per le iniezioni utilizzando una trefinene (vedere Tabella dei materiali).
   1. Abbassare il punto di centratura della trefra oltre il bordo della trefrina. Creare un'indentazione al centro della craniotomia pianificata sufficientemente profonda nel cranio per ancorare la trefrautilizzando utilizzando il punto di centratura regolabile della trefra. Prestare attenzione per evitare di penetrare completamente attraverso la profondità del cranio in quanto ciò potrebbe causare danni al tessuto neurale sottostante.
   2. Lavare periodicamente l'area con la salina in base alle esigenze per mantenere l'umidità dei tessuti per tutta la craniotomia.
   3. Una volta che il centro è stato fatto, abbassare la trephine sul cranio e ruotare la trefrade in senso orario e antiorario mentre si applica la pressione verso il basso fino a quando il tappo osseo può essere rimosso con pinze. Prestare attenzione per evitare di danneggiare il tessuto sottostante con la trephine.
6. Infilare una sutura fine (taglia 6-0) attraverso la dura al centro della craniotomia e sollevare la dura tirando delicatamente la sutura dalla superficie del cervello creando una tenda al centro della craniotomia.
7. Successivamente, forare la dura vicino al centro della tenda utilizzando forbici oftalmiche fini per evitare di danneggiare il cervello. Quindi tagliare la dura dal centro al bordo della craniotomia e continuare lungo il bordo con forbici opfaliche fini.
8. Montare la camera cilindrica compatibile cED MR (Figura1; vedere la sezione 4 per le istruzioni di produzione) sul cranio sulla parte superiore della craniotomia per fornire supporto cannula durante l'infusione cED in modo tale che la curvatura della flangia della camera si allinea bene con la curvatura del cranio.
9. Fissare gli impianti al cranio utilizzando viti di plastica e acrilico dentale o alcune viti in titanio.

3. Consegna vettoriale virale

1. Subito dopo aver impiantato la camera compatibile con MR e inserito nella camera la griglia di iniezione della cannula (Figura1A-B, Figurasupplementare 1 ) , riempire la griglia con riempire le cavità della camera con gelatina asorbente sterile bagnato per mantenere l'umidità del cervello (Figura 1F).
2. Coprire la pelle e il cilindro con un incisione antimicrobico sterile per mantenere la sterilità dei cilindri durante il trasporto e le infusioni di MR. Posizionare una capsula di vitamina E per contrassegnare la parte superiore della griglia di iniezione per l'identificazione positiva.
3. Mentre l'animale rimane intubato, staccare il tubo endotracheale dal circuito di anestesia e riattaccarlo a una macchina isoflurane compatibile con MR portatile e trasportarlo allo scanner MRI.
4. Acquisire immagini T1 (angolo di rilancio - 9o, tempo di ripetizione / eco - 668,6, dimensione della matrice - 192 x 192, spessore della fetta , 1 mm, 80 fette) per calcolare la distanza dalla parte superiore della griglia di iniezione e la superficie corticale. La capsula di vitamina E è chiaramente visibile nelle immagini T1 e deve essere utilizzata come marcatore per la parte superiore della griglia di iniezione (Figura 2A). Utilizzare lo strumento righello del software di imaging MR per misurare la distanza tra la parte superiore della griglia di iniezione e la superficie corticale.
5. Acquisire immagini T2 (angolo di capovolgimento - 130 gradi, tempo di ripetizione/eco - 52,5, dimensione della matrice : 256 x 256, spessore della fetta : 1 mm, 45 fette) per determinare le guide cannula ottimali per ogni sito in base al sito mirato di infusione (Figura2B-C). Come accennato in precedenza, la griglia cannula è piena di salina che è meglio visibile nelle immagini T2. Utilizzando il software di imaging MR, scorrere i piani coronali e sagittali per trovare la posizione di destinazione dell'infusione.
6. Dopo aver scongelato il vettore virale per alcune ore a temperatura ambiente, mescolare il vettore virale con l'agente di contrasto RM gadoteridol (Rapporto di 250:1; 2mM Gd-DTPA, vedi Tabella dei materiali) con pipetta o vortice miscelazione.
   NOT: La tecnica presentata è stata testata per i vettori AAV con un'espressione di guida DiCKIIa di C1V1 fusa su EYFP (AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP, titro: 2,5 x 10¹² molecole di virus/mL; vedi Tabella dei materiali).
7. Caricare il virus misto in un tubo IV ad alta pressione da 0,2 ml (vedere Tabella dei materiali).
8. Stabilire un campo sterile all'esterno dello scanner MR per preparare la linea di infusione virale.
9. Utilizzando tubi IV ad alta pressione, collegare una lunga linea di estensione (circa 3-5 metri, a seconda della posizione della pompa di infusione rispetto al foro MR) ad una siringa DA 3 mL compatibile con MR e prime con salina.
10. Collegare l'estremità distale della linea di estensione lunga all'estremità prossimale del tubo da 0,2 mL IV caricato con il virus e attaccare la cannula resistente al reflusso con una punta a gradini di 1 mm (Figura 2D; vedi sezione 5 per le istruzioni di produzione della cannula) all'estremità distale di questo assieme con un connettore catetere in stile morsetto (vedere Tabella dei materiali) ( Figura2E).
11. Infine, impostare la siringa in una pompa compatibile con MR (vedere Tabella dei materiali). Posizionare il controller della pompa nella sala di controllo dello scanner in quanto non è compatibile con MR.
12. Utilizzando le immagini MR anatomiche di base ottenute in precedenza, selezionare la posizione della griglia di iniezione di cannula e la profondità di inserimento necessarie per raggiungere il sito di infusione bersaglio. Contrassegnare la profondità di inserimento sulla cannula utilizzando un nastro sterile.
13. Iniziare l'infusione ad una velocità di 1 l/min e convalidare visivamente il flusso del fluido nella linea di infusione osservando l'espulsione del fluido dalla punta della cannula.
14. Inserire manualmente la cannula attraverso la griglia di iniezione alla profondità di destinazione mantenendo il flusso nella linea di infusione, in quanto ciò impedirà al tessuto penetrato di intasare la cannula durante l'inserimento.
15. Acquisire immagini ponderate T1 flash veloce (angolo di capovolgimento : 30 gradi, tempo di ripetizione/eco: 3,05, dimensione della matrice: 128 x 128, spessore della fetta, 1 mm, 64 fette) per il monitoraggio online dell'infusione di vettori virali.
16. Dopo aver infuso 10 l del vettore in modo tale da un numero sufficiente di virus da rilevare nello scanner MR, ottenere immagini MR per verificare il corretto posizionamento della cannula come evidente dalla diffusione osservata del virus. Se la profondità della cannula inserita non è corretta, regolare la profondità di conseguenza o rimuovere lentamente la cannula e ritentare l'inserimento come in 3.12.
17. Monitorare l'infusione tramite la guida di immagini MR online (flash T1 ponderata) e aumentare il tasso di infusione a 5 l/min di 1 l/min di passi ogni pochi minuti (Figura3A).
18. Dopo aver infuso circa 40 l del vettore virale, iniziare a ridurre la velocità di infusione di 1 gradini luna/min e fermare l'infusione dopo 50 dollari e lasciare la cannula in posizione per 10 minuti.
19. Rimuovere lentamente la cannula dal cervello e passare alla posizione successiva. Ripetere i passaggi da 3.9 a 3.19 per ogni posizione.
20. Coprire il cilindro con un drappo sterile alla fine delle iniezioni, prima del trasporto degli animali. Quindi trasportare l'animale di nuovo alla sala operatoria.
21. Espiantare la camera compatibile con MR e chiudere l'incisione chirurgica sostituendo il lembo osseo e il muscolo sovrastante e suturando la pelle utilizzando tecniche asettiche standard o sostituire la camera con un cilindro di titanio e dura artificiale (vedi Yazdan-Shahmorad et al. 2016⁹) per la registrazione neurale e la stimolazione.

4. Produzione di camere compatibili con MR

1. Fabbricare la griglia di iniezione di cannula in nylon (Figura 1A-B) mediante lavorazione in base alle dimensioni specificate (Figura supplementare 1).
2. Stampa 3D del cilindro compatibile con MR in acrylonitrile butadiene titino (plastica ABS0 (Figura 1C-E) (vedere File supplementare 1–3; vedere Tabella dei materiali per stampante e materiali 3D).
   NOT: Un progetto mantiene una griglia di iniezione di cannula fissa all'interno del cilindro compatibile con MR (Figura 1C), mentre un altro consente la rotazione della griglia, estendendo la regione di iniezione (Figura 1D-E).
3. Infilare la griglia di iniezione della cannula e toccare la cavità corrispondente della camera compatibile con MR in modo che entrambi i pezzi presentino lo stesso filettatura.
   NOT: È possibile utilizzare qualsiasi tipo di filettatura, a condizione che entrambi i componenti abbiano lo stesso threading.
4. Inserire la griglia di iniezione di cannula in nylon avvitandonel foro del cilindro compatibile con MR.

5. Produzione Cannula resistente al reflusso¹³

1. Tagliare un tubo di silice lungo 30 cm con ID 0,32 mm e 0,43 mm OD per il tubo di silice interno (vedi Tabella deimateriali) utilizzando una lama di rasoio.
2. Tagliare un tubo di silice lungo 7,5 cm e 5 cm con ID 0,45 mm e 0,76 mm OD per il tubo di silice esterno (vedere Tabella dei materiali).
3. Aderisci al tubo esterno di 7,5 cm al tubo interno di 30 cm con il cianoacrylato in modo che la camera d'aria si estenda per 1 mm oltre il tubo esterno, rendendo il passo resistente al reflusso (Figura 2D). Per garantire che il cianoacrylato non entri all'interno del tubo interno, posizionare il cianoacrylato all'esterno del tubo interno lontano dalla punta della cannula.
4. Incollare il tubo di silice lungo 5 cm all'altra estremità del tubo interno per l'attacco al connettore catetere in stile morsetto (vedere il passaggio 3.10).

Risultati

Convezione Enhanced Delivery (CED) sotto MRI Guidance

La diffusione del vettore virale è stata monitorata durante l'infusione di CED sotto la guida delle immagini MR online (Figura 3A). In questo studio, S1 e M1 di due scimmie sono stati presi di mira (Figura 3B). I volumi di distribuzione tridimensionali sono stati stimati in un'analisi post-hoc delle...

Discussione

Qui, descriviamo una tecnica fattibile ed efficiente per ottenere espressione optogenetica su larga scala nella corteccia somatosensoriale e motoria di NHP da CED guidata da MR. L'uso del CED a guida MR presenta vantaggi significativi rispetto ai metodi tradizionali di infusione virale nel cervello NHP. Uno di questi vantaggi è la capacità di raggiungere l'espressione su grandi aree con meno infusioni richieste. Ad esempio, con i metodi convenzionali, iniezioni multiple di 1-2 L dell'espressione di rendimento vettorial...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL High Pressure IV Tubing	Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA	533640
0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica Tubing	Polymicro Technologies	1068150027
0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing	Polymicro Technologies	1068150625
AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP	Penn Vector Core, University of Pennsylvania
ABS plastic	Stratasys, MN, USA	ABSplus-P430
Antimicrobial incise drape	3M	6650EZ	Ioban Drape
Dental Acrylic	Henry Schein, Inc.	1013117	Acrylic Bonding Agent
Elevators	VWR International, LLC.	10196-564	Langenbeck Elevator, Wide Tip
Fine suture	McKesson Medical-Surgical Inc.	1034505
Gadoteridol	Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ	0270-1111-04
Laser for light stimulation	Omicron-Laserage, Germany	PhoxX 488-60
MR compatible 3 cc syringe	Harvard apparatus, Holliston, MA, USA	59-8377
MR Imaging Software	Pixmeo	OsiriX MD 10.0
MR-Compatible Pump	Harvard apparatus, Holliston, MA, USA	Harvard PHD 2000
MR-compatible stereotaxic frame	KOPF	1430M MRI
Perifix Clamp Style Catheter Connector	B-Braun, Bethlehem, PA, USA	N/A
Plastic Screws	Plastics 1	0-80 x 1/8N	Nylon screws
Titanium screws	Crist Instrument Co., Inc.	6-YCX-0312	Self-tapping bone screws
Trephine	GerMedUSA Inc,	SKU:GV70-42
uPrinter SE 3D printer	Stratasys, MN, USA	N/A
Vitamin E Capsule	Pure Encapsulations, LLC.	DE1
Wet sterile absorbable gelatin	Pfizer Inc.	AZL0009034201	Gelfoam