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Resumen

Aquí describimos la inmunoprecipitación Rev en presencia de replicación del VIH-1 para espectrometría de masas. Los métodos descritos pueden utilizarse para la identificación de factores nucleolares implicados en el ciclo infeccioso VIH-1 y son aplicables a otros modelos de enfermedades para la caracterización de vías poco estudiadas.

Resumen

El ciclo infeccioso VIH-1 requiere interacciones virales con proteínas con factores de huésped para facilitar la replicación viral, el empaquetado y la liberación. El ciclo infeccioso requiere además la formación de complejos proteicos virales/huésped con ARN VIH-1 para regular el empalme y permitir el transporte nucleocitolasmático. La proteína HIV-1 Rev logra la exportación nuclear de ARNM VIH-1 a través de la multimerización con objetivos de acción cisintrónicos - el elemento de respuesta Rev (RRE). Existe una señal de localización nucleolar (NoLS) dentro del coOH-terminus del motivo rico en arginina Rev (ARM), permitiendo la acumulación de complejos Rev/RRE en el nucleolus. Se especula con factores nucleolares para apoyar el ciclo infeccioso del VIH-1 a través de varias otras funciones, además de mediar la exportación nuclear independiente del ARNm y el empalme. Describimos un método de inmunoprecipitación de Rev de tipo salvaje (WT) en comparación con las mutaciones nucleolares Rev (deleción y mutaciones Rev-NoLS de un solo punto) en presencia de replicación del VIH-1 para espectrometría de masas. Los factores nucleolares implicados en el transporte nucleocitotoplasm (nucleophosmin B23 y nucleolin C23), así como los factores de empalme celular, pierden la interacción con Rev en presencia de mutaciones Rev-NoLS. Se identifican otros factores nucleolares, como el esnoRNA C/D 58, para perder la interacción con las mutaciones de Rev, pero su función en el ciclo de replicación del VIH-1 sigue siendo desconocida. Los resultados presentados aquí demuestran el uso de este enfoque para la identificación de factores nucleolares virales/anfitriones que mantienen el ciclo infeccioso VIH-1. Los conceptos utilizados en este enfoque son aplicables a otros modelos virales y de enfermedades que requieren la caracterización de vías poco estudiadas.

Introducción

El núcleo se postula como el suelo de interacción de varios factores de huésped celular y virales necesarios para la replicación viral. El núcleo es una estructura compleja subdividida en tres compartimentos diferentes: el compartimento fibrilar, el compartimento fibrilar denso y el compartimento granular. La proteína HIV-1 Rev se localiza específicamente dentro de compartimentos granulares; sin embargo, se desconoce la razón de este patrón de localización. En presencia de mutaciones de un solo punto dentro de la secuencia NoLS (mutaciones de Rev 4, 5 y 6), Rev mantiene un patrón nucleolar y se ha demostrado previamente para rescatar la replicación del VIH-1HXB2, sin embargo, con una eficiencia reducida en comparación con WT Rev1 . Todas las mutaciones de un solo punto son incapaces de sostener el ciclo infeccioso VIH-1NL4-3. En presencia de múltiples mutaciones de un solo punto dentro de la secuencia NoLS (mutaciones De Rev-NoLS 2 y 9), se ha observado que Rev se dispersa por todo el núcleo y el citoplasma y no ha podido rescatar la replicación del VIH-1HXB2 1. El objetivo de este estudio proteómico es descifrar factores celulares nucleolares y no nucleolares involucrados en la vía infecciosa VIH-1 mediada por Rev. Las condiciones de inmunoprecipitación de Rev se optimizan mediante la interacción con la fosfoproteína nucleolar B23, que previamente se ha demostrado que pierde la interacción con Rev en presencia de mutaciones nucleolares.

Los factores celulares Rev han sido ampliamente estudiados en el pasado; sin embargo, esto se ha hecho en ausencia de patogénesis viral. Una proteína, en particular, que se caracteriza en este estudio a través de la interacción Rev durante la replicación del VIH-1 es la fosfoproteína nucleolar B23 - también llamada nucleofosmina (NPM), numatrina, o NO38 en anfibios2,3, 4. B23 se expresa como tres isoformas (NPM1, NPM2 y NPM3) - todos los miembros de la familia de chaperosina nuclear de nucleophosmin/nucleoplasmina5,6. El chaperosón molecular NPM1 funciona en el montaje adecuado de nucleosomas, en la formación de complejos proteicos/ácidos nucleicos implicados en las estructuras de alto orden de cromatina7,8, y en la prevención de la agregación y el desdoblamiento erróneo de las proteínas diana a través de un dominio del núcleo N-terminal (residuos 1-120)9. La funcionalidad NPM1 se extiende a la génesis ribosoma a través del transporte de partículas preribosomales entre el núcleo y el citoplasma10,11, el procesamiento del ARN preribosomal en la secuencia del espaciador transcrito interno 12,13, y la detención de la agregación nucleolar de proteínas durante el ensamblaje ribosomal14,15. NPM1 está implicado en la inhibición de la apoptosis16 y en la estabilización de los supresores tumorales ARF17,18 y p5319,revelando su doble papel como factor oncogénico y supresor tumoral. NPM1 participa en las actividades celulares de estabilidad del genoma, replicación centrosoma y transcripción. NPM1 se encuentra en nucleólidos durante la interfase del ciclo celular, a lo largo de la periferia cromosómica durante la mitosis, y en cuerpos prenucleolares (PNB) al final de la mitosis. NPM2 y NPM3 no están tan bien estudiados como NPM1, que sufre niveles alterados de expresión durante la neoplasia maligna20.

NPM1 está documentado en el cierre nucleocitotoplasmático de varias proteínas nucleares/nucleolares a través de un NES interno y NLS9,21 y se informó previamente para impulsar la importación nuclear de proteínas VIH-1 Tat y Rev. En presencia de las proteínas de fusión B23-binding-domain---galactosidase, Tat localiza erróneamente dentro del citoplasma y pierde la actividad de transactivación; esto demuestra una fuerte afinidad de Tat para B232. Otro estudio estableció un complejo estable Rev/B23 en ausencia de ARNm que contienen RRE. En presencia de ARNm RRE, Rev se disocia de B23 y se une preferentemente al VIH RRE, lo que conduce al desplazamiento de B2322. Se desconoce dónde, a nivel subnuclear, se lleva a cabo la transactivación de Tat y el proceso de intercambio de Rev de B23 por ARNm del VIH. Ambas proteínas se postulan para entrar en el nucleolus simultáneamente a través de la interacción B23. Se espera la participación de otras proteínas celulares del huésped en la vía nucleolar del VIH. Los métodos descritos en esta investigación proteómica ayudarán a dilucidar la interacción del nucleol con los factores celulares del huésped involucrados durante la patogénesis del VIH-1.

La investigación proteómica se inició a través de la expresión de mutaciones de un solo punto Rev NoLS (M4, M5 y M6) y múltiples sustituciones de arginina (M2 y M9) para la producción de VIH-1HXB2. En este modelo, una línea celular HeLa que expresa establemente la VIH-1HXB2 (HLfB) deficiente de Rev está transllenada de mutaciones nucleolares WT Rev y Rev que contienen una etiqueta de bandera al final de los 3'. La presencia de WT Rev permitirá que se produzca replicación viral en el cultivo HLfB, en comparación con las mutaciones Rev-NoLS que no rescatan la deficiencia de Rev (M2 y M9), o permiten que se produzca la replicación viral, pero no tan eficientemente como WT Rev (M4, M5 y M6)1. El lisato celular se recoge 48 horas más tarde después de la proliferación viral en presencia de la expresión Rev y se somete a inmunoprecipitación con un tampón de lisis optimizado para la interacción Rev/B23. Se describe la optimización del tampón de lisis utilizando diferentes concentraciones de sal, y los métodos de elución de proteínas para HIV-1 Rev se comparan y analizan en geles SDS-PAGE teñidos de plata o coomassie. El primer enfoque proteómico implica el análisis directo de una muestra eluida de WT Rev, M2, M6 y M9 expresados por espectrometría de masas en tándem. Un segundo enfoque por el cual los eludos de WT Rev, M4, M5 y M6 se sometieron a un proceso de extracción de gel se compara con el primer enfoque. Se analiza la afinidad de péptidos con las mutaciones Rev-NoLS en comparación con WT Rev y se muestra la probabilidad de identificación de proteínas. Estos enfoques revelan factores potenciales (nucleolar y no nucleolar) que participan en el transporte y empalme de ARNm VIH-1 con Rev durante la replicación del VIH-1. En general, las condiciones de lisis celular, IP y elución descritas son aplicables a las proteínas virales de interés para la comprensión de los factores celulares del huésped que activan y regulan las vías infecciosas. Esto también es aplicable al estudio de los factores de huésped celular necesarios para la persistencia de varios modelos de enfermedad. En este modelo proteómico, HIV-1 Rev IP está optimizado para la interacción B23 a factores nucleolares dilucidos involucrados en la actividad de cierre nucleocitolasmático y la unión de ARNm VIH-1. Además, se pueden desarrollar líneas celulares que expresan establemente modelos de enfermedades infecciosas que son deficientes para las proteínas clave de interés, similara a la línea celular HLfB, para estudiar las vías infecciosas de interés.

Protocolo

1. Cultivo celular

  1. Mantener HLfB en el medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina y 1 mM de piruvato sódico dentro de placas de 100 mm tratadas con cultivo de tejido. Mantener los cultivos celulares a 37oC en una incubadora humidificada suministrada con 5% de CO2. Paso de células confluentes a una densidad celular de 1 x 106 celdas/ml.
  2. Deseche los medios de cultivo celular. Enjuague suavemente las células con 10 ml de 1 solución salina con fosfato (PBS). Retire y deseche el 1x PBS sin interrumpir la capa de celda.
  3. Agregue 2 mL de 1x solución trypsin-EDTA a las células. Mece el plato para recubrir la monocapa e incubar a 37oC dentro de una cámara humidificada durante 5 min.
  4. Toque firmemente el lado del plato con la palma de la mano para separar las células. Resuspenda las células separadas en 8 ml de medios de cultivo fresco. Gire las células a 400 x g durante 5 min.
  5. Deseche los medios de cultivo sin interrumpir el pellet celular. Resuspenda el pellet celular en 10 ml de medios de cultivo fresco. Subcultivo 1 ml de células concentradas con 9 ml de medios de cultivo fresco dentro de placas de 100 mm tratadas con cultivo de tejido.
    NOTA: Para cada mutación Rev-NoLS, las placas de cultivo HLfB o HeLa de 3x 100 mm producirán suficiente lisado proteico para el análisis de manchas occidentales y espectrometría de masas. Agregue placas adicionales para un control positivo WT Rev y un control negativo. El volumen de celda de subcultivo requerirá optimización con el uso de diferentes tipos de celda.

2. Expresión de mutaciones de la bandera Rev-NoLS-3 durante la replicación del VIH-1

  1. Aumente el cultivo celular HLfB a una densidad celular de 2 x 106 células/ml. Prepare 4 ml de suspensión de ADN de fosfato cálcico para cada placa de 100 mm de la siguiente manera.
    1. Etiquetar dos tubos de 15 ml en 1 y 2. Añadir 2 mL de 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl y 1,5 mM Na2HPO4 [pH 7.12]) al tubo 1. Añadir TE 79/10 (1 mM Tris-HCl y 0,1 mM EDTA [pH 7.9]) al tubo 2. El volumen de TE 79/10 es 1.760 mL - el volumen de ADN.
    2. Añadir 20 g de plásmido que contiene la mutación Rev-NoLs-3'flag de interés al tubo 2 y mezclar su contenido a través de la resuspensión. Añadir 240 l de 2 M CaCl2 al tubo 2 y mezclar de nuevo a través de la resuspensión.
    3. Transfiera la mezcla del tubo 2 al tubo 1 en sentido de gota, mezclando suavemente. Deje que la suspensión se situya a temperatura ambiente durante 30 min.
  2. Añadir 1 ml de la suspensión con gotas a cada uno de los cultivos de 3 celdas, placas de 100 mm mientras se arremolina suavemente el medio. Devolver las placas a la incubadora y dejar la mezcla de transfección durante 6 h. Reemplazar la mezcla de transfección por 10 ml de medios de cultivo fresco e incubar las células durante 42 h.

3. Recolección de lisato de proteína viral

  1. Deseche el medio celular 48 h después de la transfección. Coloque cada placa de 100 mm sobre un lecho de hielo. Etiquete los tubos de 15 ml para cada muestra de mutación Rev-NoLS y coloque los tubos en hielo.
  2. Enjuague suavemente las células con 10 ml de PBS 1x preenfriado sin interrumpir la capa celular. Deseche el 1x PBS. Añadir 3 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 137 mM NaCl y 1% de detergente X-100 [ver la Tabla de Materiales]),tratado con cóctel inhibidor de proteasa, a cada una de las placas de 100 mm.
  3. Utilice un rascador de celdas para interrumpir la capa de celda. Incline la placa y raspe suavemente y reúna las células en una piscina. Recoger el lisado celular utilizando un micropipeta de 1.000 ml y mezclar los lysates celulares de cada una de las tres placas de 100 mm en el tubo preetiquetado de 15 ml.
  4. Incubar el lisado celular sobre hielo durante 15 minutos, vórtice cada 5 min. Centrifuge el lisado celular a 15.000 x g durante 5 min.
  5. Recoger el sobrenadante proteico sin interrumpir el pellet de desechos celulares y transferirlo a otro tubo estéril de 15 ml. Obtener la concentración de lisato de proteína viral utilizando el método Bradford (ver sección 4).
  6. Guarde una alícuota de la muestra de entrada (20 g) para el análisis de inmunoblot occidental. Agregue 2x tampón de muestra (20% glicerol, 0.02% azul bromofenol, 125 mM Tris-Cl [pH 6.8], 5% SDS, y 10% 2-mercaptoetanol) al volumen final. Hervirla a 95oC durante 10 min y guardar la muestra de entrada a -20oC.

4. Ensayo bradford

NOTA: Prepare 10x albúmina sérica bovina (BSA) a partir de 100x BSA stock antes de generar curvas estándar de proteínas.

  1. Agua alícuota en tubos de microcentrífuga para los siguientes espacios en blanco y estándares: En blanco a 800 l; Estándar 1 a 2 mg/ml, 798 ml; Estándar 2 a 4 mg/ml, 796 l; Estándar 3 a 6 mg/ml, 794 l; Estándar 4 x 8 mg/ml, 792 l; Estándar 5 a 10 mg/ml, 790 l. Aliquot 10x BSA en las siguientes normas designadas: Estándar 1 a 2 l; Estándar 2 a 4 l; Estándar de 3 a 6 l; Estándar 4 x 8 l; Estándar de 5 a 10 l.
  2. Preparar una mezcla de muestras de proteínas mezclando 795 ml de agua con 5 ml de muestras de proteínas. Añadir 200 ml de reactivo de colorante de ensayo de proteína (ver la Tabla de Materiales)a cada muestra de color blanco, estándar y proteico. Vortex las muestras brevemente para una mezcla uniforme e incubar a temperatura ambiente (18-20 oC) durante 5 min.
  3. Transfiera las muestras de blanco, estándares y proteínas a cubetas. Mida las concentraciones de proteínas a una Do de 595 nm.

5. Coinmunoprecipitación de Rev-NoLS-3'flag

  1. Enjuague 25 ml de perlas de gel de afinidad M2 (ver la Tabla de Materiales)con 500 ml de tampón de lisis, tratado con cóctel inhibidor de proteasa. Enjuague más perlas de gel de afinidad para cada muestra de mutación y controles.
    NOTA: Preparar suficientes perlas de gel de afinidad M2 para dos geles (50 l) - uno para el análisis de inmunoblot occidental y el otro para la tinción de proteínas y espectrometría de masas.
  2. Girar a 820 x g durante 2 min a 4oC. Retire el sobrenadante. Enjuague 2 veces más.
  3. Añadir lisato de proteína viral (1 mg/ml en 5 ml de volumen total) a las perlas de afinidad M2 preenjuagadas. Ajuste el volumen total utilizando el búfer de lisis.
  4. Incubar la reacción durante 3 h, girando a 4oC. Centrifugar las perlas de afinidad M2/leja de proteína viral a 820 x g durante 1 min.
  5. Recoger el sobrenadante y guardar una alícuota de la muestra post-IP (20 g) para el análisis de inmunoblot occidental. Mida la concentración proteica del lisado post-IP. Recoger 20 g para inmunoblotting occidental.
  6. Agregue 2x búfer de muestra al volumen final. Hervirla a 95oC durante 10 min y guardar la muestra post-IP a -20oC.
  7. Enjuague las perlas M2 con 750 ml de tampón de lisis y lave las perlas en un rotador a 4 oC durante 5 minutos.
  8. Repita los pasos 5.7 para dos lavados más en un rotador a 4 oC durante 5 min. Después del tercer lavado, retire cualquier rastro de tampón de lisis del complejo de perlas M2/co-IP usando una punta larga de carga de gel.
    NOTA: Pellizque el extremo de la punta de carga de gel con pinzas planas antes de eliminar cualquier cantidad traza del tampón de lisis. Esto evitará la interrupción y la toma de las cuentas M2.
  9. Resuspenda las perlas M2 en 55 ml de búfer de carga 2x. Hervir la muestra a 95 oC durante 10 min.
  10. Cargar 25 ml de eluido en dos geles SDS-PAGE separados (un gel para inmunoblotting occidental y el otro para la tinción de Coomassie).

6. Preparación de geles SDS-PAGE

  1. Convierte dos geles de resolución de 15% SDS-acrilamida mezclando los siguientes reactivos en un tubo de 50 ml (a un volumen final de 40 ml, suficiente para cuatro geles): 4,16 ml de agua ultrapura, 15 ml de acrilamida 40%:bisacrilamida (29:1), 10 ml de 1,5 M Tris-HCl (pH 8.8) , 400 s de 10% de SDS, 400 ml de 10% de persulfato de amonio y 40 ml de TEMED.
  2. Mezclar el gel de resolución invirtiendo el tubo de 50 ml varias veces. Pipetear la mezcla de gel de resolución en un aparato de gel occidental prelimpiado (cuatro geles - tres para la inmunoblotting occidental y uno para la tinción de Coomassie /plata).
  3. Pipetear suavemente suficiente agua para cubrir la capa superior de la mezcla de gel. Deje que el gel de resolución se polimerice.
  4. Vierta la capa de agua del gel de resolución, utilizando un limpiaparabrisas de tarea delicada (ver la Tabla de Materiales)para absorber el exceso de agua.
  5. Lanzar dos geles de apilamiento de 5% SDS-acrilamida mezclando los siguientes reactivos en un tubo de 50 ml (a un volumen final de 20 ml, suficiente para cuatro geles): 11,88 ml de agua ultrapura, 2,5 ml de 40% acrilamida:bisacrilamida (29:1), 5,2 ml de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 200 s de 10% de SDS, 200 ml de 10% de persulfato de amonio y 20 ml de TEMED.
  6. Mezclar el gel de apilamiento invirtiendo el tubo de 50 ml varias veces. Pipetear la mezcla de gel de apilamiento por encima del gel de resolución en la parte superior del aparato.
  7. Coloque un peine de casete de gel que contenga el número adecuado de carriles en el gel de apilamiento. Absorber cualquier desbordamiento de la mezcla de gel utilizando un limpiaparabrisas de tarea delicada (ver la Tabla de Materiales). Deje que el gel de apilamiento se polimerice por completo.
  8. Inundar el aparato de gel occidental con 1 tampón de carrera occidental (5x concentración: 250 mM Tris-Cl [pH 8.3], 1.92 M glicina, 0.5% SDS, y 10 mM EDTA).
  9. Tire suavemente del peine de casete de gel del gel de apilamiento. Permita que el búfer de ejecución occidental 1x llene los pozos de carga. Enjuague cada pozo con 1 búfer de funcionamiento occidental utilizando una jeringa antes de cargar las muestras.
  10. Cargue las muestras de inmunoblot occidentales en cada gel correspondiente (muestras de entrada, muestras coinmunopreciadas y muestras post-IP). Cargue los marcadores de proteína de gel occidental.
  11. Cargue las muestras coinmunopreciadas para la tinción de Coomassie/plata en otro gel. Cargue los marcadores de proteína de gel occidental.
  12. Conecte el aparato de gel en funcionamiento a una fuente de alimentación y ejecute los geles a 100 V hasta que el tinte de carga llegue al gel de resolución. Aumente la tensión a 140 V hasta que el tinte de carga llegue a la parte inferior del gel de resolución.

7. Transferencia de la mancha occidental

  1. Desmontar el aparato de gel occidental. Cortar y desechar el gel de apilamiento, dejando el gel de resolución intacto.
  2. Transfiera suavemente los geles de resolución a una bandeja limpia llena de tampón de transferencia occidental (25 mM Tris, 194 mM de glicina, 0.005% SDS, 20% de metanol) y remoje durante 15 min.
  3. Montar el aparato de transferencia de gel de la siguiente manera.
    1. Corte tres membranas de transferencia PVDF y seis trozos de papel filtrante (ver la Tabla de Materiales)al tamaño del gel de resolución.
    2. Remoje la membrana PVDF en metanol durante 5 min. Hidratarla en agua durante 5 min. Coloque la membrana PVDF en el tampón de transferencia occidental hasta que esté lista para usar.
    3. Coloque el cassette del soporte de gel en una bandeja de vidrio llena parcialmente con tampón de transferencia occidental, con el lado negro en la parte inferior.
    4. Coloque una almohadilla de espuma empapada con tampón de transferencia occidental contra el lado negro del cassette del soporte de gel.
    5. Humedezca un pedazo de papel de filtro en el búfer de transferencia occidental y colóquelo encima de la almohadilla de espuma. Coloque el gel de resolución encima del papel de filtro.
      NOTA: Coloque el gel de resolución en la orientación de carga correcta que se transferirá a la membrana PVDF.
    6. Coloque una membrana de transferencia PVDF encima del gel de resolución. Humedezca un pedazo de papel de filtro con tampón de transferencia occidental y colóquelo encima de la membrana de transferencia PVDF.
    7. Coloque otra almohadilla de espuma empapada con tampón de transferencia occidental en la parte superior del papel de filtro. Doble cuidadosamente el lado blanco del cassette del soporte de gel en la parte superior de la almohadilla de espuma empapada. Bloquee el cassette firmemente.
    8. Coloque el cassette del soporte de gel en el conjunto del electrodo del aparato de transferencia. Repita los pasos 7.3.4-7.3.8 para cada gel de resolución restante.
    9. Llene el tanque del aparato de transferencia con el tampón de transferencia occidental. Coloque una varilla de agitación en el tanque del aparato.
    10. Coloque el tanque del aparato encima de una placa de agitación. Ajuste el ajuste de agitación a 5-6, asegurándose de que la barra de agitación no esté atascada ni golpeando los cassettes del soporte de gel.
    11. Conecte el aparato de transferencia de gel a una fuente de alimentación y transfiera el gel a 100 V durante 1 h a 4 oC.

8. Inmunoblotting

  1. Retire el cassette del soporte de gel y coloque el lado negro hacia abajo contra una bandeja para hornear de vidrio limpio. Abra el cassette y deseche cuidadosamente la almohadilla de espuma y el papel de filtro. Marque una esquina de la membrana PVDF para identificar la orientación de carga correcta. Mantenga la membrana húmeda.
    NOTA: La membrana PVDF se puede secar al aire y almacenarse en un recipiente limpio y sellado. Rehidrate la membrana repitiendo los pasos 7.3.2.
  2. Coloque la membrana en 100 ml de solución de bloqueo (5% de leche, 1x TBS y 0,1% De 20). Bloquear la membrana balanceando suavemente a temperatura ambiente (18-20 oC) durante 1 h.
  3. Corte a través de la membrana por encima del marcador de proteína de 25 kDa. Colocar la parte superior de la membrana, que contiene bandas proteicas de más de 25 kDa, en solución de bloqueo que contenga B23 ratón monoclonal IgG1 (1:500 dilución). Bloquear durante la noche, balanceándose a 4oC.
  4. Coloque la parte inferior de la membrana, que contiene bandas proteicas de menos de 25 kDa, en solución de bloqueo que contenga M2 ratón monoclonal IgG1 (1:1,000 dilución, ver la Tabla de Materiales). Bloquear durante la noche, balanceándose a 4oC.
  5. Lavar la membrana 3x durante 10 min en 25 mL de solución de lavado occidental (1x TBS, 0.1% Tween 20) en una plataforma de balanceo.
  6. Incubar las membranas de la cabra-anti-ratón IgG1-HRP (1:5,000 dilución) diluido en solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Lavar la membrana 3x durante 10 min en 25 ml de solución de lavado occidental en una plataforma de balanceo.
  7. Preparar el sustrato de hincha occidental de quimioluminiscencia. Utilice una micropimeta p1000 para añadir el sustrato a la membrana.
  8. Desarrollar cada membrana en sustrato de hinchazón occidental quimioluminiscencia durante 5 min. Retire la membrana del sustrato. Absorber el exceso de sustrato utilizando un limpiaparabrisas de tarea delicada (ver la Tabla de Materiales).
  9. Coloque la membrana en un protector de lámina limpia pegado al interior de un cassette. Lleve el cassette a una habitación oscura y coloque una hoja de película en el cassette. Bloquee el cassette en su lugar e incubar durante 5-15 min. Retire la película del cassette y desarrollela.

9. Tinción de coomassie

  1. Desmontar el aparato de gel occidental. Cortar y desechar el gel de apilamiento, dejando el gel de resolución intacto. Transfiera suavemente el gel de resolución a una bandeja limpia llena de 25 ml de agua ultrapura.
  2. Incubar el gel sobre una plataforma de balanceo durante 15 minutos. Use un balanceo suave para evitar que el gel de resolución se rompa. Deseche el agua ultrapura y repita el paso de lavado 2 veces más.
    NOTA: Si las burbujas SDS permanecen después de los pasos de lavado, el gel se puede lavar en agua ultrapura durante la noche. La SDS residual puede causar una alta tinción de fondo del gel.
  3. Mezclar el reactivo de manchas Coomassie invirtiendo la botella (ver la Tabla de Materiales). Colocar 100 ml de reactivo de manchas Coomassie para cubrir el gel de resolución e incubar el gel sobre una plataforma de mecedor durante 1 h. Deseche el reactivo de manchas Coomassie y lave el gel en agua desionizada en una plataforma de balanceo durante 15 minutos.
  4. Deseche el agua desionizada. Repita el paso de lavado 2 veces más. Continúe lavando el gel hasta que se observe la resolución deseada de las bandas proteicas.

10. Tinción de plata

  1. Desmontar el aparato de gel occidental. Cortar y desechar el gel de apilamiento, dejando el gel de resolución intacto. Transfiera suavemente el gel de resolución a una bandeja limpia llena de 25 ml de agua ultrapura.
  2. Incubar el gel sobre una plataforma de balanceo durante 15 minutos. Use un balanceo suave para evitar que el gel de resolución se rompa. Deseche el agua ultrapura y repita el paso de lavado 2 veces más.
    NOTA: Si las burbujas SDS permanecen después de los pasos de lavado, el gel se puede lavar en agua ultrapura durante la noche. La SDS residual puede causar una alta tinción de fondo del gel.
  3. Fijar el gel en 30% etanol:10% solución de ácido acético (6:3:1 agua:etanol:ácido acético) durante la noche. Lavar el gel en una solución de etanol al 10% durante 5 minutos a temperatura ambiente. Reemplace la solución de etanol y lave durante otros 5 minutos.
  4. Prepare la solución de trabajo sensibilizante del kit de manchas de plata Pierce mezclando un sensitizador de manchas de plata de una parte con 500 partes de agua ultrapura (50 l de sensibilizador con 25 ml de agua ultrapura). Incubar el gel de resolución en la solución de trabajo del sensibilizador durante 1 min. Lavar el gel en agua ultrapura durante 1 min, reemplazar el agua y lavar el gel de nuevo durante 1 min.
  5. Preparar la solución de trabajo de manchas mezclando un potenciador de manchas de plata de una parte con 50 partes de manchas de plata (500 l de potenciador con 25 ml de mancha de plata). Incubar el gel en solución de trabajo con manchas durante 30 min.
  6. Prepare la solución de trabajo para desarrolladores mezclando 1 parte del potenciador de manchas de plata con el desarrollador de manchas de plata de 50 partes (500 l de potenciador con 25 ml de desarrollador). Preparar 5% solución de ácido acético como solución de parada. Lavar el gel con agua ultrapura durante 1 min, reemplazar el agua y lavar el gel durante 1 min adicional.
  7. Sustituya el agua por la solución de trabajo del desarrollador e incubar hasta que se resuelva la intensidad de la banda de proteína deseada (5 min). Reemplace la solución de trabajo para desarrolladores con solución de parada e incubar durante 10 minutos.

11. Reducción en gel, alquilación y digestión de bandas de gel teñidas con Coomassie

  1. Corta las bandas de gel del gel con una cuchilla de afeitar limpia. Corte cada banda de gel en cubos de aproximadamente 5 mm y colóquelos en un tubo de microcentrífuga limpio de 0,5 ml.
  2. Destain las piezas de gel cubriéndolas con bicarbonato de amonio de 100 mM en 1:1 acetonitrilo: agua a temperatura ambiente durante 15 min. Deseche el sobrenadante. Repita este paso.
  3. Seque las piezas de gel durante 5 minutos en una centrífuga al vacío. Reduzca las proteínas cubriendo las piezas de gel seco con 10 mM de dititothreitol en bicarbonato de amonio de 100 mM e incubando durante 1 h a 56 oC.
  4. Quita cualquier sobrenadante. Alquilar las proteínas cubriendo las piezas de gel con yodoacetamida de 100 mM en agua e incubando durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
  5. Pipetear el sobrenadante y encoger las piezas de gel cubriéndolas con acetonitrilo y sacudiéndolos suavemente a temperatura ambiente durante 15 minutos. suavemente a temperatura ambiente durante 15 min.
  6. Repita el paso 11.5. Seque las piezas de gel durante 5 minutos en una centrífuga al vacío.
  7. Cubra las piezas de gel con trippsina modificada de grado de secuenciación de 50 ng/L (ver la Tabla de Materiales)en bicarbonato de amonio de 100 mM. Deje que el gel se hinche durante 5 min; entonces, pipetear cualquier solución restante. Cubrir las piezas de gel con bicarbonato de amonio de 100 mM y permitir que se vuelvan completamente hinchados, añadiendo bicarbonato de amonio adicional de 100 mM para que las piezas de gel estén completamente cubiertas.
  8. Incubar las piezas de gel durante la noche a 37oC. Detenga la reacción añadiendo 1/10 del volumen de ácido fórmico al 10% en agua. Recoger el sobrenadante de cada tubo.
  9. Extrae las piezas de gel cubriéndolas con un 1% de ácido fórmico en 60% de acetonitrilo e incubando durante 15 min con un suave temblor.
  10. Reduzca el volumen de los sobrenatantes combinados a menos de 20 ml en una centrífuga al vacío, mientras se cuida de evitar secar completamente los sobrenatos. Añadir un 1% de ácido fórmico para devolver el volumen total a 20 ml.

12. Cromatografía líquida/espectrometría de masas

NOTA: Las muestras se analizaron utilizando un espectrómetro de masas equipado con ultra HPLC, una fuente de nanospray y una columna (véase la Tabla de Materiales). Los disolventes A y B son 0,1% ácido fórmico en agua y acetonitrilo, respectivamente.

  1. Cargue las proteínas digeridas en viales de automuestreador de polipropileno de alta recuperación. Cargue los viales en el gestor de muestras de un sistema UPLC.
  2. Inyectar 6 l de cada muestra. Cargue cada muestra en la columna de reventado del nanofilo durante 1,5 min a 8 l/min, utilizando un disolvente A/1% de disolvente B al 99%.
  3. Eluir los péptidos en el espectrómetro de masas con un gradiente lineal de 3% a 35% de disolvente B sobre 30 min, seguido de un gradiente de 35% a 50% del disolvente B sobre 4 min y 50% a 90% del disolvente B sobre 1 min. Mantener 90% acetonitrilo durante 3 min; a continuación, reducir el %B de nuevo a 3% durante 5 min.
  4. Adquiera datos de especificaciones de masa de perfil de iones positivos en modo de resolución (resolución 20.000). Adquiera datos de 100 a 2.000 Da a una velocidad de un escaneo cada 0,6 s. Adquiera datos en modo MSE alternando escaneos sin energía de colisión y escaneos con energía de colisión elevada.
  5. Para la energía de colisión elevada, rampa de la energía de colisión en la célula de trampa de 15 V a 40 V. Adquirir un escaneo de masa de bloqueo cada 30 s, utilizando el +2 ion de [Glu1]-Fibrinopéptido B como la masa de bloqueo. Adquiera un archivo de datos utilizando una inyección en blanco del disolvente A, utilizando el mismo método de adquisición entre cada par de muestras para controlar el arrastre.

13. Análisis de datos para espectrometría de masas

  1. Copiar los archivos de resultados de espectrometría de masas en el equipo que ejecuta una plataforma de investigación proteómica cuantitativa y cualitativa (por ejemplo, ProteinLynx Global Server). El análisis de datos es muy intensivo en CPU y debe realizarse en un equipo de análisis de datos independiente de alto rendimiento.
  2. Cree un nuevo proyecto para los datos. Cree una nueva placa de microtíter que represente la placa del muestreador automático. Asigne las muestras a la misma posición en la placa de microtíter que su posición en el muestreador automático.
  3. Asigne cada parámetro de procesamiento de muestras. Los parámetros a utilizar son el ancho de pico cromatográfico automático y la resolución MSTOF; umbral de baja energía, 100 recuentos; umbral de energía elevada, 5 recuentos; umbral de intensidad, 500 recuentos.
  4. Asigne cada parámetro de flujo de trabajo de ejemplo. Los parámetros a utilizar son la base de datos, SwissProt humano concatenado y VIH, con secuencias invertidas; tolerancia automática a péptidos y fragmentos; min fragmento ion matches por péptido, 3; min fragmento ion matches por proteína, 7; partidos mínimos de péptidos por proteína, 1; reactivo de digestión primaria, trippsina; escotes perdidos, 1; reactivos modificadores fijos, carbamidomethyl C; reactivos modificadores variables, oxidación M; falsa tasa de descubrimiento, 100.
  5. Seleccione los ejemplos y elija Procesar datos sin procesar más recientes. Cuando finalice la búsqueda, seleccione los ejemplos y elija Exportar datos a scaffolding (versión 3). Abra Scaffold, cree un nuevo archivo e importe cada archivo exportado desde la plataforma proteómica como una nueva biomuestra utilizando la cuantificación de iones precursores.
  6. Cuando se hayan importado todos los archivos, vaya a la pantalla Cargar y analizar datos. Seleccione la misma base de datos utilizada para los datos de búsqueda e importación mediante la puntuación LFDR y la agrupación de proteínas estándar para todo el experimento. Establezca las opciones de visualización en Probabilidad de identificaciónde proteínas , el umbral de proteína en 20%, el número mínimo de péptidos a 1 y el umbral de péptido a 0% durante el análisis.

Resultados

Las mutaciones de arginina de un solo punto y de punto múltiple Rev-NoLS, correspondientes a una variedad de patrones de localización subcelular, se examinaron en su capacidad de interactuar con los factores de host celular en comparación con WT Rev. WT Rev-3'flag y pcDNA-flag vector se expresaron en la cultura HLfB. Los complejos proteicos se procesaron a partir del lisado celular total y se teñiron con reactivo de manchas de plata. Rev-NoLS-3'flag es detectable (aproximadamente 18 kDa) en tres condiciones ...

Discusión

Se evaluaron análisis espectrométricos masivos que comparaban las mutaciones Rev-NoLS y WT Rev en presencia de VIH-1 para comprender los factores nucleolares involucrados en el ciclo de replicación viral. Esto identificaría los componentes nucleolares necesarios para la infectividad viral. Nucleolar B23 tiene una alta afinidad con Rev-NoLS y funciona en la localización nucleolar de Rev3 y transporte nucleocitotoplasmático de MRNAs 22 de VIH ligados a Rev. La afinidad ...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores reconocen a la Dra. Barbara K. Felber y al Dr. George N. Pavlakis por la cultura adherente hlfB proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Programa de Investigación y Reactivo de Referencia sobre el SIDA, División del SIDA, Instituto Nacional de Alergia según la Alergia y Infeccioso Enfermedades (NIAID), NIH. Los autores también reconocen las fuentes financieras proporcionadas por los NIH, las Subvenciones AI042552 y AI029329.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidFisher ChemicalA38S-212
AcetonitrileFisher ChemicalA955-500
Acrylamide:BisacrylamideBioRad1610158
Ammonium bicarbonateFisher ChemicalA643-500
Ammonium persulfateSigma-Aldrich7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gelSigma-AldrichA2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgGSigma-AldrichF3165
BioMax MS filmCarestream8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mLBio-Rad5000006
B23 mouse monoclonal IgGSanta Cruz Biotechnologiessc-47725
Bromophenol blueSigma-AldrichB0126
Carnation non-fat powdered milkNestleN/A
Cell scraperThermoFisher Scientific179693PK
C18IonKey nanoTile columnWaters186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishesFisher Scientific08-772-22
DithiothreitolThermo ScientificJ1539714
1 x DPBSCorning21-030-CVRS
ECL Estern blotting substratePierce32106
Ethanol, 200 proofFisher ChemicalA409-4
FBSGibco16000044
Formic AcidFisher ChemicalA117-50
GelCode blue stain reagentThermoFisher24590
GlycerolFisher Chemical56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologiessc-2005
IodoacetamideACROS Organics122270050
KimWipe delicate task wiperKimberly Clark Professional34120
L-glutamineGibco25030081
MethanolFisher Chemical67-56-1
NanoAcuity UPLCWatersN/A
Pierce Silver Stain KitThermo Scientific24600df
15-mL Polypropylene conical tubeFalcon352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDaThermo Scientific26616
Protease inhibitor cocktailRoche4693132001
Purified BSANew England BiolabsB9001
PVDF  Western blotting membraneRoche3010040001
Sodium PyruvateGibco11360070
10 x TBSFisher BioreagentsBP2471500
TEMEDBioRad1610880edu
Triton X-100 detergent solutionBioRad1610407
Trizaic sourceWatersN/A
trypsin-EDTACorning25-051-CIS
Tween 20BioRad1706531
Synapt G2 mass spectrometerWatersN/A
Whatman filter paperTisch Scientific10427813

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