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Resumo

Aqui nós descrevemos a imunoprecipitação do Rev na presença de replicação de HIV-1 para a espectrometria maciça. Os métodos descritos podem ser utilizados para a identificação de fatores nucleolares envolvidos no ciclo infeccioso HIV-1 e são aplicáveis a outros modelos de doenças para a caracterização de vias subestudadas.

Resumo

O ciclo infeccioso HIV-1 requer interações de proteínas virais com fatores hospedeiros para facilitar a replicação viral, embalagem e liberação. O ciclo infeccioso ainda requer a formação de complexos proteicos virais/hospedeiros com RNA HIV-1 para regular a emenda e possibilitar o transporte nucleocitoplasmático. A proteína HIV-1 Rev realiza a exportação nuclear de mRNAs HIV-1 através da multimerização com alvos intrônicos de ação cis-o Rev Response Element (rre). Um sinal de localização nucleolar (NoLS) existe dentro do COOH-Terminus do motivo rico em arginina Rev (ARM), permitindo o acúmulo de complexos de Rev/RRE no nucleolus. Fatores nucleolar são especulados para apoiar o ciclo infeccioso HIV-1 através de várias outras funções, além de mediar a exportação nuclear independente de mRNA e splicing. Nós descrevemos um método do selvagem-tipo (WT) Rev da imunoprecipitação em comparação às mutações nucleolar do Rev (deleção e mutações do único-ponto Rev-NoLS) na presença da replicação de HIV-1 para a espectrometria maciça. Fatores nucleolares implicados no transporte nucleocytoplasmático (nucleophosmin B23 e proteína C23), bem como fatores de emenda celular, perdem a interação com o Rev na presença de mutações do Rev-NOLS. Vários outros fatores nucleolares, como a caixa de snoRNA C/D 58, são identificados para perder a interação com mutações do Rev, mas sua função no ciclo de replicação do HIV-1 permanece desconhecida. Os resultados aqui apresentados demonstram o uso dessa abordagem para a identificação de fatores nucleolares virais/hospedeiros que mantêm o ciclo infeccioso HIV-1. Os conceitos utilizados nesta abordagem são aplicáveis a outros modelos virais e de doenças que exijam a caracterização de vias subestudadas.

Introdução

O nucléolo é postulado como a terra da interação de vários anfitrião celular e fatores virais exigidos para a replicação viral. O nucléolo é uma estrutura complexa subdividida em três compartimentos diferentes: o compartimento fibrilar, o compartimento fibrilar denso, e o compartimento granulado. A proteína HIV-1 Rev localiza-se especificamente dentro de compartimentos granulados; no entanto, a razão para este padrão de localização é desconhecida. Na presença de mutações de ponto único dentro da seqüência de NoLS (mutações do Rev 4, 5, e 6), o Rev mantem um teste padrão nucleolar e foi mostrado previamente para resgatar a replicação do HIV-1HXB2 , entretanto, com eficiência reduzida comparada ao peso rev1 . Todas as mutações de ponto único são incapazes de sustentar o ciclo infeccioso HIV-1NL4-3 . Na presença de múltiplas mutações de ponto único dentro da seqüência de NoLS (mutações do Rev-NoLS 2 e 9), o Rev tem sido observado para dispersar em todo o núcleo e citoplasma e não tem sido capaz de resgatar o HIV-1HXB2 Replication1. O objetivo deste estudo do proteômica é decifrar nucleolar assim como fatores celulares nonnucleolar envolvidos no caminho infeccioso HIV-1 mediado por Rev. As condições de imunoprecipitação do Rev são otimizadas através da interação com a fosfoproteína B23 nucleolar, que tem sido mostrada anteriormente para perder a interação com o Rev na presença de mutações nucleolar.

Os fatores celulares do Rev têm sido extensivamente estudados no passado; Entretanto, isto foi feito na ausência de patogénese viral. Uma proteína, em particular, que se caracteriza neste estudo através da interação Rev durante a replicação do HIV-1 é a fosfoproteína nucleolar B23-também chamada nucleophosmin (NPM), numatrina, ou NO38 em anfíbios2,3, 4. B23 é expressado como três isoformas (NPM1, NPM2, e NPM3)-todos os membros da família nuclear de nucleophosmin/nucleoplasmin acompanhante5,6. A Chaperona molecular NPM1 funciona na montagem adequada de nucleossomas, na formação de complexos de proteínas/ácidos nucleicos envolvidos em estruturas de ordem superior de cromatina7,8, e na prevenção de agregação e desdobramento de proteínas alvo através de um domínio de núcleo N-terminal (resíduos 1-120)9. A funcionalidade NPM1 estende-se à gênese Ribossome através do transporte de partículas preribosomal entre o núcleo e o citoplasma10,11, o processamento de RNA preribosomal na seqüência interna do espaçador transcrito 12,13, e prendendo a agregação nucleolar das proteínas durante a montagem ribossomal14,15. A NPM1 está implicada na inibição da apoptose16 e na estabilização dos supressores tumorais ARF17,18 e p5319, revelando seu duplo papel como fator oncogênico e supressor tumoral. NPM1 participa nas atividades celulares de estabilidade do genoma, replicação centrosome, e transcrição. NPM1 é encontrado nos nucléolos durante a interfase do ciclo de pilha, ao longo da periferia cromossomática durante a mitose, e em corpos prenucleolar (PNB) na conclusão do mitosis. NPM2 e NPM3 não são tão bem estudados quanto NPM1, o que sofre níveis de expressão alterados durante a malignidade20.

NPM1 é documentado no shuttling Mimivírus de várias proteínas nucleares/nucleolar através de um NES interno e de NLS9,21 e foi relatado previamente para conduzir a importação nuclear de HIV-1 tat e de proteínas do Rev. Na presença de proteínas de fusão B23-Binding-Domain-β-galactosidase, Tat mislocalizes dentro do citoplasma e perde a atividade de transativação; Isso demonstra uma forte afinidade de tat para B232. Outro estudo estabeleceu um complexo estável Rev/B23 na ausência de mRNAs contendo RRE. Na presença de RRE mRNA, o Rev dissocia-se de B23 e liga-se preferivelmente ao HIV RRE, conduzindo ao deslocamento de B2322. Não se sabe onde, no nível subnuclear, a transativação do tat e o processo de troca do Rev de B23 para o HIV mRNA acontecem. Ambas as proteínas são postuladas para entrar no nucléolo simultaneamente através da interação B23. O envolvimento de outras proteínas celulares hospedeiras na via nucleolar do HIV é esperado. Os métodos descritos nesta investigação do proteômica ajudarão a elucidar o interação do nucléolo com os fatores celulares do anfitrião envolvidos durante a patogénese de HIV-1.

A investigação proteômica foi iniciada através da expressão de mutações de ponto único do Rev NoLS (M4, M5 e M6) e múltiplas substituições de arginina (m2 e M9) para a produção de HIV-1HXB2 . Neste modelo, uma linha celular de HeLa que expressa estàvel a Rev-deficiente HIV-1HXB2 (hlfb) é transfected com as mutações NUCLEOLAR do peso Rev e do Rev que contêm uma etiqueta da bandeira na extremidade 3 '. A presença do WT Rev permitirá a replicação viral ocorrer na cultura do HLfB, em comparação com as mutações do Rev-NoLS que não resgatam a deficiência de Rev (m2 e M9), ou permitem que ocorra replicação viral, mas não tão eficientemente quanto o WT Rev (M4, M5 e M6)1. O lisado da pilha é coletado 48 h mais tarde após a proliferação viral na presença da expressão do Rev e ser submetido à imunoprecipitação com um tampão do lysis aperfeiçoado para a interação de Rev/B23. A otimização do tampão de Lise usando concentrações de sal variáveis é descrita, e os métodos da eluição da proteína para o Rev do HIV-1 são comparados e analisados em géis prata-manchados ou Coomassie-manchadas da SDS-página. A primeira abordagem proteômica envolve a análise direta de uma amostra eluída de WT Rev, m2, M6 e M9 expressos por espectrometria de massas em tandem. Uma segunda abordagem pela qual os eluatos do WT Rev, M4, M5 e M6 foram submetidos a um processo de extração de gel é comparado com a primeira abordagem. A afinidade peptídica para mutações do Rev-NoLS em comparação ao WT Rev é analisada e a probabilidade de identificação de proteínas é exibida. Essas abordagens revelam potenciais fatores (nucleolar e não nucleolar) que participam do transporte do mRNA do HIV-1 e da emenda com o Rev durante a replicação do HIV-1. Globalmente, as condições de lise celular, IP e eluição descritas são aplicáveis às proteínas virais de interesse para a compreensão dos fatores celulares hospedeiros que ativam e regulam as vias infecciosas. Isso também é aplicável ao estudo de fatores de acolhimento celular necessários para a persistência de vários modelos de doença. Neste modelo proteômica, o HIV-1 Rev IP é otimizado para a interação B23 para elucidar fatores nucleolares envolvidos na atividade de shuttling Mimivírus e na ligação do mRNA do HIV-1. Adicionalmente, linhas celulares que expressam estavelmente modelos de doenças infecciosas que são deficientes para proteínas-chave de interesse podem ser desenvolvidas, semelhante à linha celular HLfB, para estudar as vias infecciosas de interesse.

Protocolo

1. cultura celular

  1. Manter HLfB no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com o soro bovino fetal de 10% (FBS), o L-Glutamine de 2 milímetros, e o piruvato do sódio de 1 milímetro dentro de placas tecido-cultura-tratadas de 100 milímetros. Mantenha as culturas de células a 37 ° c em uma incubadora humidificada fornecida com 5% de CO2. Células confluentes de passagem para uma densidade celular de 1 x 106 células/ml.
  2. Descarte a mídia de cultura de célula. Enxague suavemente as células com 10 mL de soro fisiológico com tampão de fosfato 1x (PBS). Remova e descarte o 1X PBS sem interromper a camada celular.
  3. Adicione 2 mL de solução de 1x Trypsin-EDTA às células. Agitar o prato para revestir a monocamada e incubar a 37 ° c dentro de uma câmara humidificada durante 5 min.
  4. Bata firmemente o lado do prato com a palma da mão para separar as células. Resuspend as pilhas destacadas em 8 mL de meios de cultura frescos. Gire as células em 400 x g por 5 min.
  5. Descarte a mídia de cultura sem interromper o pellet da célula. Ressuscite a pelota da pilha em 10 mL de meios de cultura frescos. Subcultura 1 mL de células concentradas com 9 mL de meios de cultura frescos dentro de placas de 100 mm tratadas com cultura de tecidos.
    Nota: para cada mutação de Rev-NOLS, as placas da cultura do hlfb ou do Hela de 3x 100 milímetro renderá bastante lisado da proteína para a análise ocidental do Borrão e a espectrometria maciça. Adicione placas extras para um controle positivo de WT Rev e controle negativo. O volume da célula de subcultura exigirá otimização com o uso de diferentes tipos de células.

2. expressão das mutações do Rev-NoLS-3 ' Flag durante a replicação do VIH-1

  1. Cresça a cultura da pilha do HLfB a uma densidade da pilha de 2 x 106 Cells/ml. Prepare 4 mL de suspensão de fosfato de cálcio para cada placa de 100 mm da seguinte forma.
    1. Rotule 2 15 tubos de mL como 1 e 2. Adicionar 2 mL de 2x HBS (0, 5 M HEPES, 0,28 M NaCl e 1,5 mM na2HPO4 [pH 7,12]) para o tubo 1. Adicionar TE 79/10 (1 mM Tris-HCl e 0,1 mM EDTA [pH 7,9]) para o tubo 2. O volume de TE 79/10 é 1,760 mL-o volume de DNA.
    2. Adicionar 20 μg de plasmídeo contendo a mutação Rev-NoLs-3 ' Flag de interesse para o tubo 2 e misturar o seu conteúdo através de ressuspensão. Adicionar 240 μL de 2 M de CaCl2 a tubo 2 e misturar novamente através da ressuspensão.
    3. Transfira a mistura do tubo 2 para o tubo 1 Dropwise, misturando suavemente. Permita que a suspensão se sente à temperatura ambiente por 30 min. Vortex a precipitação.
  2. Adicione 1 ml do gota gota da suspensão a cada uma da cultura de 3 células, placas de 100 milímetros ao girar delicadamente os meios. Retorne as placas para a incubadora e deixe a mistura de transfecção por 6 h. Substitua a mistura de transfecção por 10 mL de meios de cultura frescos e incubar as células por 42 h.

3. coleção do lisado viral da proteína

  1. Descarte a mídia celular 48 h posttransfection. Coloc cada placa de 100 milímetros em uma cama do gelo. Rotule 15 mL de tubos para cada amostra de mutação Rev-NoLS e coloque os tubos no gelo.
  2. Enxague suavemente as células com 10 mL de 1X PBS pré-refrigerada sem interromper a camada celular. Descarte o 1X PBS. Adicionar 3 mL de tampão de lise (50 mM Tris-HCl [pH 8,0], 137 mM NaCl e 1% X-100 detergente [ver a tabela de materiais]), tratados com o cocktail inibidor da protease, para cada uma das placas de 100 mm.
  3. Use um raspador de células para interromper a camada da célula. Incline a placa e raspe suavemente e reúna as células em uma piscina. Colete o lisado de células usando uma micropipeta de 1.000 μL e misture os lisados de células de cada uma das placas de 3 100 mm no tubo de 15 mL pré-rotulado.
  4. Incubar o lisado da pilha no gelo por 15 minutos, vortexing cada 5 min. Centrifugue o lisado da pilha em 15.000 x g por 5 minutos.
  5. Colete o sobrenadante de proteínas sem interromper o pellet de detritos celulares e transferi-lo para outro tubo estéril de 15 mL. Obter a concentração de lisado de proteínas virais utilizando o método de Bradford (ver secção 4).
  6. Salvar uma alíquota da amostra de entrada (20 μg) para a análise de immunoblot ocidental. Adicionar 2x tampão de amostra (20% de glicerol, 0, 2% de bromofenol azul, 125 mM Tris-Cl [pH 6,8], 5% SDS e 10% 2-Mercaptoetanol) para o volume final. Ferva-o a 95 ° c durante 10 min e guarde a amostra de entrada a-20 ° c.

4. ensaio de Bradford

Nota: Prepare a albumina de soro bovina 10x (BSA) do estoque de 100x BSA antes de gerar curvas padrão da proteína.

  1. Aliquot água em tubos de microcentrífuga para o seguinte em branco e padrões: Blank = 800 μL; Padrão 1 = 2 mg/mL, 798 μL; Padrão 2 = 4 mg/mL, 796 μL; Padrão 3 = 6 mg/mL, 794 μL; Padrão 4 = 8 mg/mL, 792 μL; Padrão 5 = 10 mg/mL, 790 μL. alíquota 10x BSA nas seguintes normas designadas: padrão 1 = 2 μL; Padrão 2 = 4 μL; Padrão 3 = 6 μL; Padrão 4 = 8 μL; Padrão 5 = 10 μL.
  2. Prepare uma mistura de amostras de proteínas misturando 795 μL de água com 5 μL de amostras de proteínas. Adicionar 200 μL de reagente de corante de ensaio protéico (ver a tabela de materiais) a cada amostra em branco, padrão e proteína. Vórtice as amostras brevemente para uma mistura e incubar até à temperatura ambiente (18-20 ° c) durante 5 min.
  3. Transfira as amostras em branco, padrões e proteínas para as cubagens. Meça as concentrações da proteína em um OD de 595 nanômetro.

5. coimunoprecipitação de Rev-NoLS-3 ' Flag

  1. Enxague 25 μL de grânulos de gel de afinidade m2 (ver a tabela de materiais) com 500 μL de tampão de Lise, tratados com um cocktail inibidor da protease. Enxague mais contas de gel de afinidade para cada amostra de mutação e controles.
    Nota: Prepare grânulos de gel de afinidade m2 suficientes para dois géis (50 μL)-um para análise de imunoblot ocidental e outro para coloração de proteínas e espectrometria de massas.
  2. Girar a 820 x g por 2 min a 4 ° c. Retire o sobrenadante. Enxágüe 2x mais.
  3. Adicione o lisado viral da proteína (1 magnésio/ml em 5 ml do volume total) às contas de afinidade m2 prerinsed. Ajuste o volume total usando o tampão de Lise.
  4. Incubar a reacção durante 3 h, girando a 4 ° c. Centrifugue os grânulos de afinidade m2/proteína viral lisado em 820 x g por 1 min.
  5. Colete o sobrenadante e salve uma alíquota de amostra pós-IP (20 μg) para análise de immunoblot ocidental. Meça a concentração proteica do lisado pós-IP. Colete 20 μg para immunoblotting ocidental.
  6. Adicione o buffer de amostra 2x ao volume final. Ferva-o a 95 ° c por 10 min e armazene a amostra pós-IP a-20 ° c.
  7. Enxágüe as contas m2 com 750 μL de tampão de Lise e lave os grânulos em um rotador a 4 ° c por 5 min. Centrifugue as contas m2 a 820 x g e descarte o sobrenadante.
  8. Repita as etapas 5,7 para mais duas lavas em um rotador a 4 ° c por 5 min. Após a terceira lavagem, remova quaisquer vestígios de tampão de lise do complexo m2 Beads/Co-IP utilizando uma ponta longa de carregamento de gel.
    Nota: belisque a extremidade da ponta do gel-carregamento com as pinças lisas antes de remover todas as quantidades de traço do amortecedor do lysis. Isto impedirá a ruptura e a captação dos grânulos m2.
  9. Ressuspender as contas m2 em 55 μL de tampão de carga 2x. Ferva a amostra a 95 ° c por 10 min.
  10. Carregue 25 μL de eluato em dois géis de SDS-PAGE separados (um gel para o immunoblotting ocidental e o outro para a mancha de Coomassie).

6. preparação de géis SDS-PAGE

  1. Cast 2 15% SDS-acrylamide resolvendo géis misturando os seguintes reagentes em um tubo de 50 mL (em um volume final de 40 mL, suficiente para quatro géis): 4,16 mL de água ultrapura, 15 mL de 40% acrilamida: bisacrilamida (29:1), 10 mL de 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 400 μL de SDS 10%, 400 μL de persulfato de amônio a 10% e 40 μL de TEMED.
  2. Misture o gel de resolução invertendo o tubo de 50 mL várias vezes. Pipeta a mistura resolvendo do gel em um instrumento ocidental prelimpado do gel (quatro géis-três para o immunoblotting ocidental e um para o Coomassie/mancha de prata).
  3. Gentilmente pipeta água suficiente para cobrir a camada superior da mistura de gel. Permita que o gel de resolução polimerize.
  4. Despeje a camada de água do gel de resolução, usando um limpador de tarefas delicado (veja a tabela de materiais) para absorver qualquer excesso de água.
  5. Montar dois géis de 5% de empilhamento de SDS-acrilamida misturando os seguintes reagentes num tubo de 50 mL (num volume final de 20 mL, suficiente para quatro géis): 11,88 mL de água ultrapura, 2,5 mL de acrilamida 40%: bisacrilamida (29:1), 5,2 mL de 1,5 M de Tris-HCl (pH 8,8) , 200 μL de SDS 10%, 200 μL de persulfato de amônio a 10% e 20 μL de TEMED.
  6. Misture o gel de empilhamento invertendo o tubo de 50 mL várias vezes. Pipeta a mistura de gel de empilhamento acima do gel de resolução para o topo do aparelho.
  7. Coloc um pente da gaveta do gel que contem o número apropriado de pistas no gel de empilhamento. Absorva qualquer estouro da mistura de gel usando um limpador de tarefas delicado (veja a tabela de materiais). Permita que o gel de empilhamento polimerize completamente.
  8. Inundar o aparelho de gel ocidental com 1x buffer de corrida ocidental (5x concentração: 250 mM Tris-Cl [pH 8,3], 1,92 M glicina, 0,5% SDS, e 10 mM EDTA).
  9. Puxe delicadamente o pente da gaveta do gel do gel de empilhamento. Permita que o tampão running ocidental 1x encha os poços de carregamento. Lave cada poço com 1x tampão running ocidental usando uma seringa antes de carregar as amostras.
  10. Carregue as amostras de immunoblot ocidentais em cada gel correspondente (amostras da entrada, amostras coimmunoprecipitated, e amostras do borne-IP). Carregue os marcadores de proteínas de gel ocidentais.
  11. Coloque as amostras coimunoprecipitadas para a coloração Coomassie/prata em outro gel. Carregue os marcadores de proteínas de gel ocidentais.
  12. Conecte o aparelho de gel em funcionamento a uma fonte de alimentação e execute os géis a 100 V até que o corante de carga atinja o gel de resolução. Aumente a tensão para 140 V até que o corante de carga atinja o fundo do gel de resolução.

7. transferência ocidental do borrão

  1. Desmontar o aparelho de gel ocidental. Corte e descarte o gel de empilhamento, deixando o gel de resolução intacto.
  2. Transfira suavemente os géis de resolução para uma bandeja limpa preenchida com tampão de transferência ocidental (25 mM Tris, 194 mM glicina, 0, 5% SDS, 20% metanol) e mergulhe-os por 15 min.
  3. Montar o aparelho de transferência de gel como se segue.
    1. Corte três membranas de transferência de PVDF e seis partes de papel de filtro (veja a tabela de materiais) ao tamanho do gel de resolução.
    2. Mergulhe a membrana de PVDF em metanol por 5 min. hidrate-o em água por 5 min. Coloque a membrana de PVDF no tampão de transferência ocidental até estar pronto para usar.
    3. Coloc a gaveta do suporte do gel em uma bandeja de cozimento de vidro enchida parcialmente com o amortecedor de transferência ocidental, com o lado preto na parte inferior.
    4. Coloc uma almofada de espuma embebido com o amortecedor de transferência ocidental de encontro ao lado preto da gaveta do suporte do gel.
    5. Molhe um pedaço de papel de filtro no tampão de transferência ocidental e coloque-o em cima da almofada de espuma. Coloque o gel de resolução em cima do papel de filtro.
      Nota: Coloque o gel de resolução na orientação de carregamento correcta para ser transferido para a membrana PVDF.
    6. Coloc uma membrana de transferência de PVDF sobre o gel de resolução. Molhe um pedaço de papel de filtro com tampão de transferência ocidental e coloque-o em cima da membrana de transferência de PVDF.
    7. Coloque outra almofada de espuma embebido com tampão de transferência ocidental em cima do papel de filtro. Dobre cuidadosamente o lado branco da gaveta do suporte do gel em cima da almofada de espuma embebido. Bloqueie a gaveta firmemente.
    8. Coloc a gaveta do suporte do gel no conjunto do elétrodo do instrumento de transferência. Repita as etapas 7.3.4-7.3.8 para cada gel de resolução restante.
    9. Encha o tanque do instrumento de transferência com o amortecedor de transferência ocidental. Coloque uma haste de agitação no tanque do aparelho.
    10. Coloque o tanque do aparelho em cima de uma placa de agitação. Ajuste a configuração de agitação para 5-6, certificando-se de que a barra de agitação não está presa ou batendo as gavetas de suporte de gel.
    11. Ligue o aparelho de transferência de gel a uma fonte de alimentação e transfira o gel a 100 V durante 1 h a 4 ° c.

8. immunoblotting

  1. Remova a gaveta do suporte do gel e coloc o lado preto para baixo de encontro a uma bandeja de vidro limpa do cozimento. Abra a gaveta e elimine cuidadosamente a almofada de espuma e o papel de filtro. Marque um canto da membrana de PVDF para identificar a orientação correta do carregamento. Mantenha a membrana molhada.
    Nota: a membrana de PVDF pode ser ar-secada e armazenada em um recipiente limpo, selado. Rehidrate a membrana repetindo os passos 7.3.2.
  2. Coloque a membrana em 100 mL de solução de bloqueio (5% de leite, 1x TBS e 0,1% de Tween 20). Bloqueie a membrana por um balanço suave à temperatura ambiente (18-20 ° c) durante 1 h.
  3. Corte através da membrana acima do marcador da proteína de 25 kDa. Coloque a parte superior da membrana, contendo bandas proteicas maiores que 25 kDa, em solução de bloqueio contendo B23 anticorpo monoclonal IgG1 (1:500 diluição). Bloqueie durante a noite, balançando a 4 ° c.
  4. Coloque a porção inferior da membrana, contendo bandas proteicas menores que 25 kDa, em solução de bloqueio contendo m2 anticorpo monoclonal IgG1 (1:1000 diluição, ver a tabela de materiais). Bloqueie durante a noite, balançando a 4 ° c.
  5. Lave a membrana 3x por 10 min em 25 mL de solução de lavagem ocidental (1x TBS, 0,1% Tween 20) em uma plataforma de balanço.
  6. Incubar as membranas em cabra-anti-rato IgG1-HRP (1:5000 diluição) diluída na solução de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente. Lave a membrana 3x por 10 min em 25 mL de solução de lavagem ocidental em uma plataforma de balanço.
  7. Prepare a quimioluminescência western blotting substrato. Use uma micropipeta P1000 para adicionar o substrato à membrana.
  8. Desenvolva cada membrana no substrato de mancha ocidental de quimioluminescência por 5 min. Retire a membrana do substrato. Absorva o excesso de substrato usando um limpador de tarefas delicado (veja a tabela de materiais).
  9. Coloque a membrana em um protetor de folha limpa gravado no interior de uma gaveta. Leve a fita para uma sala escura e coloque uma folha de filme na gaveta. Trave a gaveta no lugar e incubar por 5 – 15 min. Retire o filme da gaveta e desenvolvê-lo.

9. coloração de Coomassie

  1. Desmontar o aparelho de gel ocidental. Corte e descarte o gel de empilhamento, deixando o gel de resolução intacto. Transfira suavemente o gel de resolução para uma bandeja limpa, preenchida com 25 mL de água ultrapura.
  2. Incubar o gel em uma plataforma de balanço por 15 min. Use o balanço delicado para impedir que o gel de resolução quebra. Descarte a água ultrapura e repita a etapa de lavagem 2x mais.
    Nota: se as bolhas SDS permanecem após as etapas de lavagem, o gel pode ser lavado em água ultrapura durante a noite. O SDS residual pode causar a mancha elevada do fundo do gel.
  3. Misture o reagente da mancha de Coomassie invertendo o frasco (veja a tabela dos materiais). Coloc 100 ml do reagente da mancha de Coomassie para cobrir o gel de resolução e incubar o gel em uma plataforma de balanço para 1 h. descarte o reagente da mancha de Coomassie e lave o gel na água deionizada em uma plataforma de balanço por 15 minutos.
  4. Descarte a água desionizada. Repita a etapa de lavagem 2x mais. Continue a lavar o gel até que a resolução desejada de bandas proteicas seja observada.

10. coloração de prata

  1. Desmontar o aparelho de gel ocidental. Corte e descarte o gel de empilhamento, deixando o gel de resolução intacto. Transfira suavemente o gel de resolução para uma bandeja limpa, preenchida com 25 mL de água ultrapura.
  2. Incubar o gel em uma plataforma de balanço por 15 min. Use o balanço delicado para impedir que o gel de resolução quebra. Descarte a água ultrapura e repita a etapa de lavagem 2x mais.
    Nota: se as bolhas SDS permanecem após as etapas de lavagem, o gel pode ser lavado em água ultrapura durante a noite. O SDS residual pode causar a mancha elevada do fundo do gel.
  3. Fixar o gel em 30% etanol: 10% solução de ácido acético (6:3:1 água: etanol: ácido acético) durante a noite à temperatura ambiente. Lave o gel em uma solução de etanol a 10% por 5 min à temperatura ambiente. Substitua a solução de etanol e lave por mais 5 min.
  4. Prepare a solução de trabalho do sensibilizador do jogo da mancha da prata de Pierce misturando o sensibilizador de mancha de prata de uma peça com 500 partes de água ultrapura (50 μl do sensibilizador com 25 ml da água ultrapura). Incubar o gel de resolução na solução de trabalho do sensibilizador durante 1 min. Lave o gel em água ultrapura durante 1 min, substitua a água e lave o gel novamente durante 1 min.
  5. Prepare a solução de trabalho da mancha misturando o potenciador de mancha de prata de uma peça com 50 partes de mancha de prata (500 μL do potenciador com 25 mL da mancha de prata). Incubar o gel na solução de trabalho da mancha por 30 minutos.
  6. Prepare a solução de trabalho do colaborador misturando o potenciador da mancha de prata de 1 parte com 50 partes o colaborador da mancha de prata (500 μL do potenciador com 25 mL do colaborador). Prepare a solução de ácido acético a 5% como solução de paragem. Lave o gel com água ultrapura por 1 min, substitua a água, e lave o gel por um adicional de 1 min.
  7. Substitua a água com a solução de trabalho do colaborador e incubar até que a intensidade desejada da faixa da proteína esteja resolvida (5 minutos). Substitua a solução de trabalho do colaborador com a solução do batente e incubar por 10 minutos.

11. redução em gel, alquilação e digestão de bandas de gel corados com Coomassie

  1. Corte as bandas de gel do gel usando uma lâmina de barbear limpa. Corte cada banda de gel em cubos de aproximadamente 5 mm e coloque-os num tubo de microcentrífuga 0,5 mL limpo.
  2. Destain as peças de gel, cobrindo-os com 100 mM de bicarbonato de amônio em 1:1 acetonitrila: água à temperatura ambiente por 15 min. descarte o sobrenadante. Repita este passo.
  3. Seque as peças de gel por 5 min em uma centrífuga a vácuo. Reduza as proteínas cobrindo as partes secas do gel com o ditiotreitol de 10 milímetros no bicarbonato do amónio de 100 milímetros e incubando os por 1 h em 56 ° c.
  4. Pipeta fora qualquer sobrenadante. Alkylate as proteínas cobrindo as partes do gel com o irradiados de 100 milímetros na água e incubando os por 1 h na temperatura ambiente na obscuridade.
  5. Pipetar o sobrenadante e encolher as peças de gel, cobrindo-os com acetonitrila e agitando-os suavemente à temperatura ambiente durante 15 min. pipeta fora do sobrenadante e reswell as peças de gel, cobrindo-os com 100 mM de bicarbonato de amônio e agitando-os suavemente à temperatura ambiente durante 15 min.
  6. Repita o passo 11,5. Seque as peças de gel por 5 min em uma centrífuga a vácuo.
  7. Cubra as peças de gel com 50 ng/μl seqüenciamento grau modificado tripsina (ver a tabela de materiais) em 100 mm bicarbonato de amônio. Deixe o gel inchar por 5 min; Então, pipeta fora de toda a solução restante. Cubra as peças de gel com bicarbonato de amônio de 100 mM e permita que elas ressoem completamente, acrescentando bicarbonato de amónio adicional de 100 mM para que as peças de gel estejam completamente cobertas.
  8. Incubar as peças de gel durante a noite a 37 ° c. Pare a reação adicionando 1/10 do volume do ácido fórmico de 10% na água. Colete o sobrenadante de cada tubo.
  9. Extraia as peças de gel, cobrindo-os com 1% de ácido fórmico em 60% acetonitrila e incubando-os por 15 min com agitação suave.
  10. Reduza o volume dos sobrenadantes combinados a menos de 20 μL em um centrifugador do vácuo, ao tomar o cuidado para evitar secar completamente os sobrenadantes. Adicione 1% de ácido fórmico para trazer o volume total de volta para 20 μL.

12. cromatografia líquida/espectrometria de massas

Nota: as amostras foram analisadas usando um espectrómetro de massa equipado com ultra HPLC, uma fonte de nanospray, e uma coluna (veja a tabela de materiais). Os solventes A e B são 0,1% de ácido fórmico em água e acetonitrila, respectivamente.

  1. Carregue as proteínas digeridas em frascos de mostruário automático de polipropileno de alta recuperação. Coloque os frascos no Gerenciador de amostras de um sistema UPLC.
  2. Injete 6 μL de cada amostra. Carregue cada amostra na coluna de trapping do nanoazulejo por 1,5 min a 8 μL/min, usando 99% solvente A/1% solvente B.
  3. Elute os peptídeos no Espectrómetro de massa com um gradiente linear de 3% a 35% de solvente B acima de 30 min, seguido por um gradiente de 35% para 50% de solvente B mais de 4 min e 50% para 90% de solvente B mais de 1 min. manter 90% acetonitrila por 3 min; em seguida, reduza o% B de volta para 3% sobre 5 min.
  4. Adquira dados de especificação de massa de perfil de íons positivos no modo resolução (20.000 resolução). Adquira dados de 100 a 2.000 da a uma taxa de uma varredura cada 0,6 s. adquira dados no modo MSe alternando varreduras sem energia de colisão e varreduras com energia de colisão elevada.
  5. Para a energia de colisão elevada, rampa a energia da colisão na pilha da armadilha de 15 V a 40 V. adquira uma varredura maciça do fechamento cada 30 s, usando o íon + 2 de [Glu1]-fibrinopeptide B como a massa do fechamento. Adquira um arquivo de dados usando uma injeção em branco de solvente A, usando o mesmo método de aquisição entre cada par de amostras para controlar a transição.

13. análise de dados para espectrometria de massas

  1. Copie os arquivos de resultados de espectrometria de massa para o computador que executa uma plataforma de pesquisa de proteômica quantitativa e qualitativa (por exemplo, ProteinLynx global Server). A análise de dados é altamente intensiva da CPU e deve ser realizada em um computador de análise de dados separado e de alto desempenho.
  2. Crie um novo projeto para os dados. Crie uma nova placa de microtitula representando a placa de amostrador automático. Atribua as amostras à mesma posição na placa de microtitula como sua posição no amostrador automático.
  3. Atribua cada parâmetro de processamento de amostra. Os parâmetros a usar são largura máxima cromatográfica automática e MSTDA definição; limiar de baixa energia, 100 contagens; limiar de energia elevada, 5 contagens; limiar de intensidade, 500 contagens.
  4. Atribua cada exemplo de parâmetros de fluxo de trabalho. Os parâmetros a usar são base de dados, o SwissProt humano concatenado e o HIV, com seqüências invertidas; peptídeo automático e tolerância a fragmentos; o íon do fragmento mínimo combina por o peptide, 3; o íon do fragmento mínimo combina por a proteína, 7; o peptídeo mínimo corresponde por proteína, 1; Reagente de digestão primária, tripsina; cleavages faltado, 1; reagentes modificadores fixos, carbamidometil C; reagentes modificadores variáveis, oxidação M; taxa de descoberta falsa, 100.
  5. Selecione os exemplos e escolha processar dados brutos mais recentes. Quando a pesquisa for concluída, selecione os exemplos e escolha exportar dados para Scaffold (versão 3). Abra o Scaffold, crie um novo arquivo e importe cada arquivo exportado da plataforma proteômica como uma nova biosampla usando a quantificação de íons precursor.
  6. Quando todos os arquivos tiverem sido importados, prossiga para a tela carregar e analisar dados . Selecione o mesmo banco de dados usado para pesquisar e importar dados usando a pontuação LFDR e o agrupamento de proteínas padrão em toda a experiência. Defina as opções de exibição para a probabilidade de identificação protéica, o limiar proteico para 20%, o número mínimo de peptídeos para 1 e o limiar peptídico para 0% durante a análise.

Resultados

As mutações de arginina de ponto único e múltiplo do Rev-NoLS, correspondendo a uma variedade de padrões de localização subcelular, foram examinadas em sua capacidade de interagir com fatores hospedeiros celulares em comparação com o WT Rev. WT Rev-3 ' Flag e pcDNA-Flag o vetor foi expressado na cultura do HLfB. Os complexos proteicos foram processados do lisado total da pilha e manchados com o reagente de mancha de prata. O Rev-NoLS-3 ' Flag é detectável (aproximadamente 18 kDa) em três diferentes c...

Discussão

Análises espectrométricas de massa comparando mutações de Rev-NoLS e WT Rev na presença de HIV-1 foram avaliadas para compreender os fatores nucleolares envolvidos no ciclo de replicação viral. Isto identificaria os componentes nucleolar exigidos para a infectividade viral. Nucleolar B23 tem uma alta afinidade com o Rev-NOLS e funções na localização nucleolar do rev3 e do transporte Mimivírus de mRNAs Rev-Bound do HIV22. A afinidade do B23 com as mutações do R...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o Dr. Barbara K. Felber e o Dr. George N. Pavlakis para a cultura aderente de HLfB fornecida pelo Instituto Nacional de saúde (NIH) programa de pesquisa e reagente de referência da AIDS, divisão de AIDS, National Institute of Allergy e Infectious Doenças (NIAID), NIH. Os autores também reconhecem as fontes financeiras fornecidas pela NIH, subsídios AI042552 e AI029329.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidFisher ChemicalA38S-212
AcetonitrileFisher ChemicalA955-500
Acrylamide:BisacrylamideBioRad1610158
Ammonium bicarbonateFisher ChemicalA643-500
Ammonium persulfateSigma-Aldrich7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gelSigma-AldrichA2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgGSigma-AldrichF3165
BioMax MS filmCarestream8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mLBio-Rad5000006
B23 mouse monoclonal IgGSanta Cruz Biotechnologiessc-47725
Bromophenol blueSigma-AldrichB0126
Carnation non-fat powdered milkNestleN/A
Cell scraperThermoFisher Scientific179693PK
C18IonKey nanoTile columnWaters186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishesFisher Scientific08-772-22
DithiothreitolThermo ScientificJ1539714
1 x DPBSCorning21-030-CVRS
ECL Estern blotting substratePierce32106
Ethanol, 200 proofFisher ChemicalA409-4
FBSGibco16000044
Formic AcidFisher ChemicalA117-50
GelCode blue stain reagentThermoFisher24590
GlycerolFisher Chemical56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologiessc-2005
IodoacetamideACROS Organics122270050
KimWipe delicate task wiperKimberly Clark Professional34120
L-glutamineGibco25030081
MethanolFisher Chemical67-56-1
NanoAcuity UPLCWatersN/A
Pierce Silver Stain KitThermo Scientific24600df
15-mL Polypropylene conical tubeFalcon352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDaThermo Scientific26616
Protease inhibitor cocktailRoche4693132001
Purified BSANew England BiolabsB9001
PVDF  Western blotting membraneRoche3010040001
Sodium PyruvateGibco11360070
10 x TBSFisher BioreagentsBP2471500
TEMEDBioRad1610880edu
Triton X-100 detergent solutionBioRad1610407
Trizaic sourceWatersN/A
trypsin-EDTACorning25-051-CIS
Tween 20BioRad1706531
Synapt G2 mass spectrometerWatersN/A
Whatman filter paperTisch Scientific10427813

Referências

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