АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем Rev иммунопрецитивность в присутствии ВИЧ-1 репликации для масс-спектрометрии. Описанные методы могут быть использованы для выявления нуклеолярных факторов, участвующих в инфекционном цикле ВИЧ-1, и применимы к другим моделям заболеваний для характеристики недостаточно изученных путей.

Аннотация

Инфекционный цикл ВИЧ-1 требует взаимодействия вирусного белка с принимающими факторами для облегчения репликации вируса, упаковки и высвобождения. Инфекционный цикл далее требует формирования вирусных/хостовых белковых комплексов с РНК ВИЧ-1 для регулирования сращивания и обеспечения нуклеоцитоплазмического переноса. Белок ВИЧ-1 Rev выполняет ядерный экспорт ВИЧ-1 мРНК за счет мультимеризации с интроническими целями cis- элементом rev response (RRE). Сигнал локализации ядра (NoLS) существует в пределах COOH-термина мотива Rev аргинина (ARM), что позволяет накапливать комплексы Rev/RRE в ядре. Нуклеолярные факторы предполагают, чтобы поддержать ВИЧ-1 инфекционный цикл через различные другие функции в дополнение к посредничеству мРНК-независимых ядерных экспорта и сплайсинга. Мы описываем метод иммунопреципиции дикого типа (WT) Rev по сравнению с ревнулопатическими мутациями (удаление и одноточечные мутации Rev-NoLS) при наличии репликации ВИЧ-1 для массовой спектрометрии. Нуклеолярные факторы, замешанные в нуклеотипласмичном переносе (нуклеофосмимин B23 и нуклеолин C23), а также клеточные факторы сплайсинга, теряют взаимодействие с Rev в присутствии мутаций Rev-NoLS. Различные другие нуклеолярные факторы, такие как snoRNA C/D box 58, идентифицируются, чтобы потерять взаимодействие с мутациями Rev, но их функция в цикле репликации ВИЧ-1 остается неизвестной. Представленные здесь результаты свидетельствуют об использовании этого подхода для выявления вирусных/хост-нуклеолярных факторов, поддерживающих инфекционный цикл ВИЧ-1. Концепции, используемые в этом подходе, применимы к другим вирусным моделям и моделям заболеваний, требующим характеристики недостаточно изученных путей.

Введение

Ядро постулируется как место взаимодействия различных клеточных хостов и вирусных факторов, необходимых для репликации вируса. Ядро представляет собой сложную структуру, разделенную на три различных отсека: фибриллярный отсек, плотный фибриллярный отсек и гранулированный отсек. Белок ВИЧ-1 Rev локализуется специально в гранулированных отсеках; однако причина такой схемы локализации неизвестна. При наличии одноточечных мутаций в последовательности NoLS (Rev мутации 4, 5 и 6), Rev поддерживает нуклеолярную модель и ранее было показано, чтобы спасти ВИЧ-1HXB2 репликации, однако, с пониженной эффективностью по сравнению с WT Rev1 . Все одноточечные мутации не в состоянии поддерживать инфекционный цикл ВИЧ-1NL4-3. При наличии нескольких одноточечных мутаций в последовательности NoLS (Rev-NoLS мутации 2 и 9), Rev наблюдается разойтись по всему ядру и цитоплазмы и не смог спасти ВИЧ-1HXB2 репликации1. Цель этого исследования протеомики заключается в расшифровке нуклеолярных, а также ненуклеолярных клеточных факторов, участвующих в инфекционном пути, опосредоваваемом ВИЧ-1. Условия иммунопреципатации оптимизированы при взаимодействии с нуклеолярным фосфопротеим B23, который ранее был показан, чтобы потерять взаимодействие с Rev в присутствии нуклеолярных мутаций.

Rev клеточных факторов были широко изучены в прошлом; однако это было сделано при отсутствии вирусного патогенеза. Один белок, в частности, что характеризуется в этом исследовании через Rev взаимодействия во время репликации ВИЧ-1 является нуклеолярный фосфопротеин B23 - также называемый нуклеофосмиин (NPM), numatrin, или NO38 в амфибий2,3, 4. B23 выражается как три изоформы (NPM1, NPM2, и NPM3) - все члены нуклеофосмина / нуклеоплазмина ядерного сопровождающего семейства5,6. Молекулярный сопровождающий NPM1 функционирует при надлежащей сборке нуклеосом, в формировании белково-нуклеиновых кислотных комплексов, участвующих в структурах высшего порядка хроматина7,8,и в профилактике агрегации и неправильное сворачивание целевых белков через n-терминальный ядерный домен (остатки 1-120)9. Функциональность NPM1 распространяется на рибосомный генезис через транспортировку прерибосомных частиц между ядром и цитоплазмой10,11, обработка прейбосомальной РНК во внутренней транскрибированной последовательности прокладки 12,13, и арест нуклеолярной агрегации белков во время рибосомной сборки14,15. NPM1 вовлечен в ингибирование апоптоза16 и в стабилизацию опухолевых супрессоров ARF17,18 и p5319,раскрывая свою двойную роль в качестве онкогенного фактора и супрессора опухоли. NPM1 участвует в клеточной деятельности стабильности генома, центросомного репликации и транскрипции. NPM1 содержится в нуклеоли во время межфазы клеточного цикла, вдоль хромосомной периферии во время митоза, и в пренуклеолярных телах (PNB) при заключении митоза. NPM2 и NPM3 не так хорошо изучены, как NPM1, который подвергается изменению уровня экспрессии при злокачественности20.

NPM1 документируется в нуклеоцитоплазматических челночных различных ядерных / нуклеолярных белков через внутренние РЭШ и NLS9,21 и ранее сообщалось, чтобы диск ядерного импорта ВИЧ-1 Тат и Rev белков. В присутствии B23-связывающего домена-я-галактосидазных термоядерных белков, Тат неправильно локализует в цитоплазме и теряет трансактивационную активность; это демонстрирует сильную близость Тат для B232. Другое исследование установило Rev/B23 стабильный комплекс в отсутствие RRE-содержащих мРНК. В присутствии RRE mRNA, Rev отделяется от B23 и связывает предпочтительно к ВИЧ RRE, что приводит к смещению B2322. Неизвестно, где на субядерном уровне происходит Таттрансактивация и процесс обмена В23 на ВИЧ-мРНК. Оба белка постулируются для ввода ядра одновременно через Взаимодействие B23. Ожидается вовлечение других клеточных белков хозяина в нуклеолярный путь ВИЧ. Методы, описанные в этом исследовании протеомики, помогут выяснить взаимодействие ядра с клеточными факторами хозяина, участвующими во время патогенеза ВИЧ-1.

Исследование протеомики было начато с помощью выражения одноточественных мутаций Rev NoLS (M4, M5 и M6) и нескольких замен аргинина (M2 и M9) для производства ВИЧ-1HXB2. В этой модели, HeLa клеточной линии устойчиво выражая Rev-дефицитНЫХ ВИЧ-1HXB2 (HLfB) трансфицируется WT Rev и Rev нуклеолярных мутаций, содержащих тег флага в 3'end. Присутствие WT Rev позволит вирусной репликации происходит в культуре HLfB, по сравнению с Rev-NoLS мутаций, которые не спасти Rev дефицита (M2 и M9), или позволяют вирусной репликации происходит, но не так эффективно, как WT Rev (M4, M5, и M6)1. Лизат клетки собран 48 h более поздно после вирусного пролиферации в присутствии выражения Rev и подвергся к immunoprecipitation с буфером lysis оптимизированным для взаимодействия Rev/B23. Описывается оптимизация буфера лизиса с использованием различных концентраций соли, а методы элюционизации белка для ВИЧ-1 Rev сравниваются и анализируются в окрашенных серебром или комасси-окрашенных гелях SDS-PAGE. Первый подход протеомики включает в себя прямой анализ элетативной выборки из выраженных WT Rev, M2, M6 и M9 тандемной масс-спектрометрией. Второй подход, при котором улеты WT Rev, M4, M5 и M6 прошли процесс извлечения геля, сравнивается с первым подходом. Пептид сродство к Rev-NoLS мутаций по сравнению с WT Rev анализируется и вероятность идентификации белка отображается. Эти подходы выявляют потенциальные факторы (нуклеолярные и ненуклеолярные), которые участвуют в транспортировке ВИЧ-1 мРНК и сращивания с Rev во время репликации ВИЧ-1. В целом, описанные условия клеточного лиза, ИС и элуции применимы к вирусным белкам, представляющим интерес для понимания клеточных факторов хозяина, которые активируют и регулируют инфекционные пути. Это также применимо к изучению клеточных факторов хозяина, необходимых для сохранения различных моделей заболеваний. В этой модели протеомики, ВИЧ-1 Rev IP оптимизирован для взаимодействия B23 для выяснения нуклеолярных факторов, участвующих в нуклеотипитопасмической челночной деятельности и связывания ВИЧ-1 мРНК. Кроме того, можно разработать клеточные линии, четко выражающие модели инфекционных заболеваний, которые не достаточны для ключевых белков, представляющих интерес, подобно линии клеток HLfB, для изучения инфекционных путей, представляющих интерес.

протокол

1. Культура клеток

  1. Поддерживать HLfB в модифицированной среде Орла Dulbecco (DMEM) дополнен10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 2 мМ L-глутамина, и 1 мМ натрия пируват в ткани культуры обработанных 100 мм пластин. Держите клеточные культуры на уровне 37 градусов по Цельсию в увлажненный инкубатор поставляется с 5% CO2. Проход ные клетки к плотности клеток 1 х 106 ячеек/мл.
  2. Откажитесь от носителей культуры клеток. Аккуратно промыть клетки 10 мл 1x фосфат-буфера сольников (PBS). Удалите и отбросьте 1x PBS, не нарушая клеточного слоя.
  3. Добавьте в клетки 2 мл раствора трипсин-ЭДТА. Рок блюдо, чтобы покрыть монослой и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в увлажненной камере в течение 5 минут.
  4. Твердо коснитесь стороны блюда ладонью, чтобы отсоединить клетки. Отстойные отдельные ячейки в 8 мл свежих культурных носителей. Спин клетки на 400 х г в течение 5 мин.
  5. Откажитесь от культурных носителей, не нарушая клеточные гранулы. Отрежь клеточные гранулы в 10 мл свежих носителей культуры. Субкультура 1 мл концентрированных клеток с 9 мл свежих культурных носителей в тканях-культуры обработанных 100 мм пластин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мутации Rev-NoLS, 3x 100 мм HLfB или HeLa культурные пластины даст достаточно белка lysate для западного анализа помок и масс-спектрометрии. Добавьте дополнительные пластины для положительного контроля WT Rev и отрицательного контроля. Объем клеток субкультуры потребует оптимизации с использованием различных типов клеток.

2. Выражение мутаций Rev-NoLS-3'flag во время репликации ВИЧ-1

  1. Выращивайте культуру клеток HLfB до плотности клеток 2 x 106 ячеек/мл. Приготовьте 4 мл суспензии фосфата-ДНК кальция для каждой 100-мм пластины следующим образом.
    1. Этикетка две 15 мл труб, как 1 и 2. Добавьте 2 мл 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl, и 1,5 мМ Na2HPO4 "pH 7,12") в трубку 1. Добавьте TE 79/10 (1 мМ Tris-HCl и 0,1 мМ EDTA (pH 7.9) в трубку 2. Объем TE 79/10 составляет 1,760 мл - объем ДНК.
    2. Добавьте 20 мкг плазмиды, содержащей мутацию Rev-NoLs-3'flag, интересную трубе 2, и смешайте ее содержимое через повторную подвеску. Добавьте 240 л 2 M CaCl2 в трубку 2 и снова перемешайте через повторную подвеску.
    3. Перенесите смесь трубки 2 в трубку 1 dropwise, аккуратно перемешивая. Разрешить подвески сидеть при комнатной температуре в течение 30 мин. Vortex осадков.
  2. Добавьте 1 мл подвески dropwise к каждому из 3-клеточной культуры, 100 мм пластин в то время как мягко закрученного средств массовой информации. Верните пластины в инкубатор и оставьте трансфекционную смесь на 6 ч. Замените трансфекционную смесь 10 мл свежих культурных носителей и инкубация клеток на 42 ч.

3. Сбор вирусного белка лизат

  1. Откажитесь от клеточного носителя 48 ч посттрансфекции. Поместите каждую 100-мм тарелку на ледяное ложе. Наклейте этикетку 15 мл труб окрева для каждого образца мутации Rev-NoLS и поместите трубки на лед.
  2. Аккуратно промыть клетки с 10 мл прехиллированных 1x PBS, не нарушая клеточного слоя. Откажитесь от 1x PBS. Добавьте 3 мл буфера лисиса (50 мм Tris-HCl (pH 8.0), 137 мМ NaCl, и 1% х-100 моющего средства (см. таблицуматериалов), обработанный коктейлем ингибитора протеазы, к каждой из 100 мм пластин.
  3. Используйте клеточный скребок, чтобы нарушить клеточный слой. Наклоните тарелку и аккуратно соскребите и соберите клетки в бассейн. Соберите клеточный лисат с помощью микропипетта мощностью 1000 л и смешайте клеточные лисаты с каждой из трех 100-мм пластин в предварительно маркированной трубке 15 мл.
  4. Инкубировать клеточный лисат на льду в течение 15 мин, вихрь каждые 5 мин. Центрифуге клетки lysate на 15000 х г в течение 5 мин.
  5. Соберите белок супернатант, не нарушая гранулы мусора клетки и перенесите его в другую стерильную трубку 15 мл. Получить концентрацию вирусного белка лизат с помощью метода Брэдфорд (см. раздел 4).
  6. Сохранить аликот входной образец (20 мкг) для западного иммуноблотного анализа. Добавьте 2x образец буфера (20% глицерола, 0,02% бромофенола синий, 125 мМ Tris-Cl "pH 6,8", 5% SDS, и 10% 2-меркаптоэтанол) в окончательный объем. Отварить его при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, и хранить входный образец при -20 градусов по Цельсию.

4. Брэдфорд асссе

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка 10x бычьего сыворотки альбумина (BSA) из 100x BSA фонда до создания белка стандартных кривых.

  1. Аликвотная вода в микроцентрифуговых трубках для следующих пустых и стандартов: Пустой 800 л; Стандартный 1 х 2 мг/мл, 798 л; Стандартный 2 х 4 мг/мл, 796 л; Стандартный 3 й 6 мг/мл, 794 л; Стандартный 4 х 8 мг/мл, 792 л; Стандартный 5 - 10 мг/мл, 790 л. Аликот 10x BSA в следующие установленные стандарты: Стандарт 1 и 2 Лл; Стандарт 2 и 4 л; Стандарт 3 и 6 л; Стандартный 4 х 8 л; Стандартный 5 и 10 л.
  2. Подготовьте смесь образцов белка, смешав 795 л воды с 5 л образцов белка. Добавьте 200 зл и материалы протеинового реагента (см. таблицуматериалов) к каждому пустому, стандартному и протеинового образца. Vortex образцы кратко для равномерной смеси и инкубировать при комнатной температуре (18-20 градусов по Цельсию) в течение 5 мин.
  3. Перенесите пустые, стандартные и белковые образцы в кюветы. Измерьте концентрацию белка при оД 595 нм.

5. Киммунопресция Rev-NoLS-3'flag

  1. Промыть 25 зл и л из серепроцита M2 (см. ТаблицуМатериалов) с 500 зл искремирующим буфером, обработанным коктейлем ингибитора протеазы. Промыть больше сродства гель бусы для каждого образца мутации и контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте достаточное количество шариков геля сродства M2 для двух гелей (50 л) - один для западного иммуноблотного анализа, а другой для окрашивания белка и масс-спектрометрии.
  2. Спин при 820 х г в течение 2 мин при 4 градусах По цельсию. Удалите супернатант. Промыть еще 2 x.
  3. Добавьте вирусный лизат белка (1 мг/мл в 5 мл общего объема) к предризатому бисеру сродства M2. Отрегулируйте общий объем с помощью буфера lysis.
  4. Инкубировать реакцию в течение 3 ч, вращаясь при 4 градусах Цельсия. Centrifuge M2 сродство бисер / вирусный белок лисат на 820 х г в течение 1 мин.
  5. Соберите супернатант и сохраните аликвот пост-IP-образец (20 мкг) для западного иммуноблотного анализа. Измерьте концентрацию белка после IP-лисата. Соберите 20 мкг для западного иммуноблоттинга.
  6. Добавьте буфер 2x образца к окончательному тому. Отварить его при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут, и хранить образец после IP при -20 градусах По цельсию.
  7. Промыть бисер M2 с 750 л люсиса буфера и мыть бисер на ротаторе при 4 кв КС в течение 5 мин. Центрифуге M2 шарики на 820 х г и отбросить супернатанта.
  8. Повторите шаги 5.7 для еще двух смок на ротаторе при 4 градусах по Цельсию в течение 5 мин. После третьей стирки удалите следы буфера лизиса из комплекса M2-бис/ко-IP с помощью длинного гелевого наконечника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Pinch конце гель-загрузки отзыв с плоскими пинцетом, прежде чем удалить любые следовые количества буфера лисиса. Это позволит предотвратить нарушение и поглощение m2 шариков.
  9. Отрежь бусы M2 в 55 л 2x погрузочного буфера. Отварить образец при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин.
  10. Нагрузка 25 злитый на два отдельных SDS-PAGE гели (один гель для западного иммуноблотинга, а другой для Coomassie окрашивания).

6. Приготовление гелей SDS-PAGE

  1. Бросьте два 15% SDS-акриламид решения гелей путем смешивания следующих реагентов в 50 мл трубки (при окончательном объеме 40 мл, достаточно для четырех гелей): 4,16 мл ультрачистой воды, 15 мл 40% акриламида: бисакриамид (29:1), 10 мл 1,5 М. , 400 л 10% SDS, 400 л из 10% аммония persulfate, и 40 зл TEMED.
  2. Смешайте разрешающий гель, несколько раз инвертируя трубку 50 мл. Pipette разрешающая смесь геля в precleaned западный прибор геля (четыре геля - 3 для западного immunoblotting и одного для Coomassie/серебряного окрашивания).
  3. Аккуратно пипетка достаточно воды, чтобы покрыть верхний слой геля смеси. Разрешить растворяющийся гель полимеризуется.
  4. Налейте слой воды из разрешителящего геля, используя тонкий стеклоочиститель задачи (см. таблицуматериалов) для того чтобы поглотить любое сверхнормальную воду.
  5. Бросьте два 5% SDS-акриламид укладки гелей путем смешивания следующих реагентов в 50 мл трубки (при окончательном объеме 20 мл, достаточно для четырех гелей): 11,88 мл ультрачистой воды, 2,5 мл 40% акриламида:bisacrylamide (29:1), 5,2 мл 1,5 Мл.HL (Три-HL , 200 л 10% SDS, 200 Л л из 10% аммония persulfate, и 20 Зл TEMED.
  6. Смешайте укладки гель, инвертируя 50 мл трубки несколько раз. Pipette укладки гель смесь выше решения гель в верхней части аппарата.
  7. Поместите гель кассеты гребень, содержащий соответствующее количество полос в укладке гель. Поглотить любой переполнение смеси геля с помощью деликатного стеклоочистителя задачи (см. Таблицу материалов). Разрешить укладки гель полимеризации полностью.
  8. Наводнение западного гелевого аппарата с 1x западный ходовой буфер (5x концентрация: 250 мм Tris-Cl (pH 8.3" , 1,92 М глицин, 0,5% SDS, и 10 мм EDTA).
  9. Аккуратно вытяните гель кассеты гребень из укладки гель. Разрешить 1x западный ходовой буфер для заполнения погрузочных скважин. Промыть каждый колодец с 1x западный беговой буфер с помощью шприца до загрузки образцов.
  10. Загрузите образцы западного иммуноблота в каждый соответствующий гель (входные образцы, коиммунопромипиированные образцы и образцы после ИС). Загрузите западные маркеры белка геля.
  11. Загрузите коиммунопромитатированные образцы для окрашивания Coomassie/серебра в другой гель. Загрузите западные маркеры белка геля.
  12. Подключите ходовой гель аппарат к источнику питания и запустите гели при 100 В до тех пор, пока погрузочный краситель не достигнет разрешителящего геля. Увеличьте напряжение до 140 В до тех пор, пока погрузочный краситель не достигнет дна разрешающиго геля.

7. Западная передача поблужей

  1. Разобрать западный гелевой аппарат. Нарежьте и отбросьте укладывая гель, оставляя разрешающий гель нетронутым.
  2. Аккуратно перенесите растворимые гели в чистый лоток, наполненный западным трансферным буфером (25 мм Трис, 194 мМ глицин, 0,005% SDS, 20% метанол) и замочите их в течение 15 минут.
  3. Соберите гель переносного аппарата следующим образом.
    1. Вырежьте три PVDF передачи мембран и шесть кусков фильтровальной бумаги (см. таблицу материалов) до размера разрешителяя геля.
    2. Замочите мембрану PVDF в метаноле в течение 5 мин. Гидрат его в воде в течение 5 мин. Поместите мембрану PVDF в западный буфер передачи до готовности к использованию.
    3. Поместите гель держатель кассеты в стеклянный противень выпечки заполнены частично с западным буфером передачи, с черной стороны в нижней части.
    4. Поместите пенную подушечку, пропитанную западным буфером передачи, против черной стороны кассеты держателя геля.
    5. Влажный кусок фильтровальной бумаги в западном буфере передачи и поместите его на верхней части пены площадку. Поместите разрешающий гель поверх фильтровальной бумаги.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите разрешающий гель в правильной ориентации нагрузки, чтобы быть переданы в мембрану PVDF.
    6. Поместите одну мембрану переноса PVDF поверх разрешителяя геля. Влажный кусок фильтровальной бумаги с западным буфером передачи и поместите его на верхней части мембраны передачи PVDF.
    7. Поместите еще одну пенную площадку, пропитанную западным буфером передачи, поверх фильтровальной бумаги. Аккуратно сложите белую сторону кассеты держателя геля поверх пропитанной пенной прокладки. Запереть кассету плотно.
    8. Поместите гель держатель кассеты в передаче аппарата электрода сборки. Повторите шаги 7.3.4-7.3.8 для каждого оставшегося разрешающого геля.
    9. Заполните бак переносного аппарата западным буфером передачи. Поместите перемешивающий стержень в аппаратный бак.
    10. Поместите аппарат бак на верхней части перемешать пластины. Отрегулируйте настройки перемешать до 5-6, убедившись, что перемешать бар не застрял или удара гель держатель кассеты.
    11. Подключите аппарат передачи геля к источнику питания и перенесите гель при 100 В на 1 ч при 4 градусах Цельсия.

8. Иммуноблтинг

  1. Удалите гель держатель кассеты и поместите черную сторону вниз против чистого стекла выпечки лоток. Откройте кассету и осторожно отбросьте пенную площадку и фильтровальную бумагу. Отметьте угол мембраны PVDF, чтобы определить правильную ориентацию нагрузки. Держите мембрану влажной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мембрана PVDF может быть высушена воздухом и храниться в чистом, герметичном контейнере. Регидратация мембраны, повторяя шаги 7.3.2.
  2. Поместите мембрану в 100 мл блокирующего раствора (5% молока, 1x TBS и 0,1% Tween 20). Блокируйте мембрану нежным раскачиванием при комнатной температуре (18-20 градусов по Цельсию) на 1 ч.
  3. Вырезать через мембрану над 25 kDa маркер белка. Поместите верхнюю часть мембраны, содержащую белковые полосы больше 25 кДа, в блокирующий раствор, содержащий моноклональный IgG1 (1:500 разбавления). Блок на ночь, качания на 4 градуса по Цельсию.
  4. Поместите нижнюю часть мембраны, содержащую белковые полосы меньше 25 кДа, в блокирующий раствор, содержащий моноклональный IG1 мыши M2 (1:1,000 разбавления, см. Таблицуматериалов). Блок на ночь, качания на 4 градуса по Цельсию.
  5. Вымойте мембрану 3x на 10 минут в 25 мл западного раствора для мытья (1x TBS, 0.1% Tween 20) на качалке платформы.
  6. Инкубировать мембраны в козьей антимышке IgG1-HRP (1:5,000 разбавления) разбавленной в блокирующем растворе на 1 ч при комнатной температуре. Вымойте мембрану 3x в течение 10 минут в 25 мл западного раствора для мытья на качалке платформы.
  7. Подготовка chemiluminescence западного промокать субстрат. Используйте p1000 micropipette, чтобы добавить субстрат в мембрану.
  8. Развивайте каждую мембрану в chemiluminescence западный промокающий субстрат в течение 5 мин. Удалите мембрану из субстрата. Поглотить избыток субстрата с помощью деликатного стеклоочистителя задачи (см. Таблицу материалов).
  9. Поместите мембрану в чистый протектор листа, приклеенный к внутренней части кассеты. Возьмите кассету в темную комнату и поместите один лист пленки в кассету. Заблокируйте кассету на месте и инкубируйте в течение 5-15 мин. Снимите пленку с кассеты и развите ее.

9. Coomassie окрашивания

  1. Разобрать западный гелевой аппарат. Нарежьте и отбросьте укладывая гель, оставляя разрешающий гель нетронутым. Аккуратно перенесите разрешающий гель в чистый лоток, наполненный 25 мл ультрачистой воды.
  2. Инкубировать гель на качалке платформы в течение 15 минут Используйте нежные качалки, чтобы предотвратить разрешительное гель от разрушения. Откажитесь от ультрачистой воды и повторите шаг стирки в 2 раз больше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если пузыри SDS остаются после стирки, гель можно мыть в ультрачистой воде на ночь. Остаточные SDS может вызвать высокий фон окрашивания геля.
  3. Смешайте Coomassie пятно реагента путем инвертирования бутылки (см. таблицу материалов). Поместите 100 мл реагента пятна Coomassie для покрытия разрешительных гель и инкубировать гель на качалке платформы в течение 1 ч. Отбросьте Coomassie пятно реагента и мыть гель в деионизированной воде на качалке платформы в течение 15 минут.
  4. Откажитесь от деионизированной воды. Повторите шаг стирки в 2 x больше. Продолжайте мыть гель до тех пор, пока не будет соблюдаться желаемое разрешение белковых полос.

10. Серебряное окрашивание

  1. Разобрать западный гелевой аппарат. Нарежьте и отбросьте укладывая гель, оставляя разрешающий гель нетронутым. Аккуратно перенесите разрешающий гель в чистый лоток, наполненный 25 мл ультрачистой воды.
  2. Инкубировать гель на качалке платформы в течение 15 минут Используйте нежные качалки, чтобы предотвратить разрешительное гель от разрушения. Откажитесь от ультрачистой воды и повторите шаг стирки в 2 раз больше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если пузыри SDS остаются после стирки, гель можно мыть в ультрачистой воде на ночь. Остаточные SDS может вызвать высокий фон окрашивания геля.
  3. Исправить гель в 30% этанола:10% уксусной кислоты раствор (6:3:1 воды: этанол: уксусная кислота) на ночь при комнатной температуре. Вымойте гель в 10% растворе этанола в течение 5 мин при комнатной температуре. Замените раствор этанола и промойте еще 5 мин.
  4. Подготовка сенсибилизатора рабочего решения из Пирс Серебряный пятно Kit путем смешивания одной части серебра пятно сенсибизатор с 500 частей ультрачистой воды (50 л сенсибилизатора с 25 мл ультрачистой воды). Инкубировать растворительный гель в сенсибилизаторе рабочий раствор в течение 1 мин. Вымойте гель в ультрачистой воде в течение 1 мин, замените воду и снова промойте гель в течение 1 мин.
  5. Подготовка пятно рабочий раствор путем смешивания одной части серебра пятно усилитель с 50 частей серебра пятно (500 л усилителя с 25 мл серебра пятно). Инкубировать гель в пятно рабочего раствора в течение 30 минут.
  6. Подготовьте рабочее решение разработчика, смешивая 1 часть серебряного пятноусилителя с 50 частями серебряного пятна разработчика (500 л усилителя с 25 мл разработчика). Приготовьте 5% раствор уксусной кислоты в качестве стоп-решения. Вымойте гель с ультрачистой водой в течение 1 мин, заменить воду, и мыть гель еще 1 мин.
  7. Замените воду рабочим раствором разработчика и инкубация до желаемой интенсивности полосы белка не будет решена (5 мин). Замените рабочее решение разработчика стоп-решением и инкубация на 10 мин.

11. В гель сокращения, алкилирование, и пищеварение Coomassie окрашенных гель полос

  1. Вырежьте гелевые полосы из геля с помощью чистого лезвия бритвы. Разрежьте каждую гель-группу примерно на 5 мм кубов и поместите их в чистую микроцентрифугную трубку 0,5 мл.
  2. Destain геля куски, покрывая их 100 мМ аммония бикарбонат в 1:1 ацетонитрил: вода при комнатной температуре в течение 15 мин. Отбросьте супернатант. Повторите этот шаг.
  3. Высушите кусочки геля в течение 5 мин в вакуумной центрифуге. Уменьшите белки, покрыв высушенные кусочки геля дитиотрейтолом 10 мМ в бикарбонат аммония 100 мм и инкубируя их в течение 1 ч при 56 градусах Цельсия.
  4. Пипетка от любого супернатанта. Алкилат белки, покрывая кусочки геля с 100 мм йодоацетамида в воде и инкубации их в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
  5. Pipette от supernatant и уменьшить кусочки геля, покрывая их ацетонитрилом и встряхивая их мягко при комнатной температуре в течение 15 минут. Пипетта от супернатанта и reswell гель штук, покрывая их 100 мм аммония бикарбонат и встряхивая их нежно при комнатной температуре в течение 15 мин.
  6. Повторите шаг 11.5. Высушите кусочки геля в течение 5 мин в вакуумной центрифуге.
  7. Обложка геля штук с 50 нг / Л секвенирования класса модифицированных трипсин (см. Таблица материалов) в 100 мм аммония бикарбонат. Разрешить гель набухают в течение 5 мин; затем, pipette от любого оставшегося решения. Обложка геля кусочки с 100 мм бикарбонат аммония и позволяют им reswell полностью, добавив дополнительные 100 мм аммония бикарбонат, чтобы части геля полностью покрыты.
  8. Инкубировать кусочки геля на ночь при 37 градусах Цельсия. Остановите реакцию, добавив 1/10 объема 10% для модной кислоты в воде. Соберите супернатант из каждой трубки.
  9. Извлеките кусочки геля, покрыв их 1% формовой кислотой в 60% ацетонитрила и инкубируя их в течение 15 минут с нежной тряской.
  10. Уменьшите объем комбинированных супернатантов до менее чем 20 л в вакуумной центрифуге, заботясь, чтобы избежать полной высыхания супернатантов. Добавьте 1% для мультядной кислоты, чтобы вернуть общий объем к 20 Л.

12. Ликвидная хроматография/масс-спектрометрия

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы были проанализированы с помощью масс-спектрометра, оснащенного ультра HPLC, источником наноспрей и колонкой (см. таблицуматериалов). Растворы A и B составляют 0,1% для модной кислоты в воде и ацетонитриле, соответственно.

  1. Загрузите переваренные белки в высоковосстановительные полипропиленовые аутоsampler флаконы. Загрузите флаконы в образец менеджера системы UPLC.
  2. Вводят по 6 л каждого образца. Загрузите каждый образец на улавливание колонки нанотиле в течение 1,5 мин при 8 л/мин, используя 99% растворителя A/1% растворителя B.
  3. Выделите пептиды в масс-спектрометр с линейным градиентом от 3% до 35% растворителя B в течение 30 мин, а затем градиент от 35% до 50% растворителя B в течение 4 мин и от 50% до 90% растворителя B более 1 мин. Поддерживать 90% ацетонитрила в течение 3 мин; затем уменьшить %B обратно до 3% в течение 5 мин.
  4. Приобрести положительные ионные данные профиля массы спецификации в режиме разрешения (20000 разрешение). Приобретайте данные от 100 до 2000 Da со скоростью одного сканирования каждые 0,6 с. Приобрести данные в режиме MSE путем чередования сканирования без энергии столкновения и сканирует с повышенной энергией столкновения.
  5. Для повышенной энергии столкновения, рампы столкновения энергии в клетке ловушки от 15 V до 40 V. Приобрестисканирование массы замка каждые 30 с, используя ион No 2 от "Glu 1"-Фибринопептид B в качестве замка массы. Приобретение файла данных с помощью пустой инъекции растворителя А, используя тот же метод приобретения между каждой парой образцов для управления переносом.

13. Анализ данных для масс-спектрометрии

  1. Копирование файлов результатов масс-спектрометрии на компьютер под управлением исследовательской платформы количественной и качественной протеомики (например, ProteinLynx Global Server). Анализ данных является высокоинтенсивным для процессора и должен выполняться на отдельном высокопроизводительном компьютере анализа данных.
  2. Создайте новый проект для данных. Создайте новую пластину микротитера, представляющую пластину автосэмпера. Назначайте образцы в том же положении в микротитерной пластине, что и их положение в автосэмпере.
  3. Назначайте параметры обработки каждого образца. Параметрами для использования являются автоматическая хроматографическая ширина пика и разрешение MSTOF; порог низкой энергии, 100 пунктов; повышенный порог энергии, 5 пунктов; порог интенсивности, 500 пунктов.
  4. Назначайте параметры каждого образца рабочего процесса. Параметры для использования базы данных, concatenated человека SwissProt и ВИЧ, с реверсными последовательностями; автоматический пептид и переносимости фрагментов; мин фрагмент ионных совпадений на пептид, 3; мин фрагмент ионных совпадений на белок, 7; мин пептид совпадает на белок, 1; первичный реагент дайджеста, трипсин; пропущенные расщепления, 1; реагенты фиксированного модификатора, карбамидоэтил С; реагенты переменного модификатора, окисление M; ложное открытие, 100.
  5. Выберите образцы и выберите процесс последних исходных данных. Когда поиск завершится, выберите образцы и выберите Экспортные данные в Scaffold (версия 3). Open Scaffold, создать новый файл, и импортировать каждый файл экспортируется с платформы протеомики в качестве нового биообразца с использованием прекурсора иона количественной оценки.
  6. При импорте всех файлов перейдите на экран нагрузки и анализируйте данные. Выберите ту же базу данных, которая используется для поиска и импорта данных, используя баллики LFDR и стандартную группу белков по всему эксперименту. Установите параметры отображения вероятности идентификации белка, порог белка до 20%, минимальное количество пептидов до 1, и пептидный порог до 0% во время анализа.

Результаты

Rev-NoLS одно- и многоточечные аргининмутации, соответствующие различным моделей субклеточной локализации, были рассмотрены в их способности взаимодействовать склеточными факторами хозяина по сравнению с WT Rev-3'flag и p cDNA-флагом вектор были выражены в культуре HLfB. Белковые комплексы пе...

Обсуждение

Масс-спектрометрические анализы, сравнивающие мутации Rev-NoLS и WT Rev в присутствии ВИЧ-1, были оценены для понимания нуклеолярных факторов, участвующих в цикле репликации вирусов. Это позволит определить нуклеолярные компоненты, необходимые для вирусной инфекции. Нуклеоляр B23 имеет высок?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы признают д-р Барбара К. Фелбер и д-р Джордж Н. Павлакис для HLfB приверженцев культуры, предоставляемые Национальными институтами здравоохранения (NIH) СПИД исследований и справочных реагентов программы, Отдел СПИДа, Национальный институт аллергии и инфекционных болезни (НИАИД), NIH. Авторы также признают финансовые источники, предоставленные NIH, Grants AI042552 и AI029329.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidFisher ChemicalA38S-212
AcetonitrileFisher ChemicalA955-500
Acrylamide:BisacrylamideBioRad1610158
Ammonium bicarbonateFisher ChemicalA643-500
Ammonium persulfateSigma-Aldrich7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gelSigma-AldrichA2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgGSigma-AldrichF3165
BioMax MS filmCarestream8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mLBio-Rad5000006
B23 mouse monoclonal IgGSanta Cruz Biotechnologiessc-47725
Bromophenol blueSigma-AldrichB0126
Carnation non-fat powdered milkNestleN/A
Cell scraperThermoFisher Scientific179693PK
C18IonKey nanoTile columnWaters186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishesFisher Scientific08-772-22
DithiothreitolThermo ScientificJ1539714
1 x DPBSCorning21-030-CVRS
ECL Estern blotting substratePierce32106
Ethanol, 200 proofFisher ChemicalA409-4
FBSGibco16000044
Formic AcidFisher ChemicalA117-50
GelCode blue stain reagentThermoFisher24590
GlycerolFisher Chemical56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRPSanta Cruz Biotechnologiessc-2005
IodoacetamideACROS Organics122270050
KimWipe delicate task wiperKimberly Clark Professional34120
L-glutamineGibco25030081
MethanolFisher Chemical67-56-1
NanoAcuity UPLCWatersN/A
Pierce Silver Stain KitThermo Scientific24600df
15-mL Polypropylene conical tubeFalcon352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDaThermo Scientific26616
Protease inhibitor cocktailRoche4693132001
Purified BSANew England BiolabsB9001
PVDF  Western blotting membraneRoche3010040001
Sodium PyruvateGibco11360070
10 x TBSFisher BioreagentsBP2471500
TEMEDBioRad1610880edu
Triton X-100 detergent solutionBioRad1610407
Trizaic sourceWatersN/A
trypsin-EDTACorning25-051-CIS
Tween 20BioRad1706531
Synapt G2 mass spectrometerWatersN/A
Whatman filter paperTisch Scientific10427813

Ссылки

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1481B23

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены