Estructuras interfaciales a nivel molecular de polímeros y biomacromoléculas reveladas a través de la espectroscopia vibratoria de generación de frecuencia de suma

Resumen

Al ser ampliamente utilizada, la espectroscopia vibratoria de la generación de frecuencia de suma (SFG) puede ayudar a revelar el orden de la conformación de la cadena y el cambio estructural secundario que ocurre en las interfaces de polímero y biomacromolécula.

Resumen

Como espectroscopia óptica no lineal de segundo orden, la espectroscopia vibratoria de generación de frecuencia de suma (SFG) se ha utilizado ampliamente en la investigación de varias superficies e interfaces. Esta técnica óptica no invasiva puede proporcionar la información de nivel molecular local con sensibilidad monocapa o submonocapa. Aquí estamos proporcionando metodología experimental sobre cómo detectar selectivamente la interfaz enterrada tanto para macromoléculas como para biomacromoléculas. Con esto en mente, se discuten las estructuras secundarias interfaciales de fibroína de seda y estructuras de agua alrededor del modelo de dúplex de oligonucleótido de cadena corta. El primero muestra una superposición de cadena o un efecto de confinamiento espacial y el segundo muestra una función de protección contra los iones Ca²⁺ resultantes de la superestructura quiral de la columna vertebral del agua.

Introducción

El desarrollo de la espectroscopia vibratoria de generación de frecuencia de suma (SFG) puede datarse del trabajo realizado por Shen et al. hace treinta años^1,2. La singularidad de la selectividad interfacial y la sensibilidad de la subcapa hace que la espectroscopia vibratoria SFG sea apreciada por un gran número de investigadores en los campos de la física, la química, la biología y la ciencia de los materiales, etc^{3,4 ,5}. Actualmente, se está investigando una amplia gama de cuestiones científicas relacionadas con superficies e interfaces utilizando SFG, especialmente para interfaces complejas con respecto a polímeros y biomacromoléculas, como las estructuras de la cadena y la relajación estructural en el estructuras de polímeros enterrados, las estructuras secundarias de proteínas, y las estructuras de agua interfacial^{es 9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26}.

Para superficies e interfaces de polímeros, las muestras de película delgada generalmente se preparan mediante recubrimiento de espín para obtener las superficies o interfaces deseadas. El problema surge debido a la interferencia de la señal de las dos interfaces de las películas preparadas, lo que conduce a inconvenientes para analizar los espectros SFG recogidos^27,28,29. En la mayoría de los casos, la señal vibratoria sólo desde una sola interfaz, ya sea película / sustrato o película / el otro medio, es deseable. En realidad, la solución a este problema es bastante fácil, a saber, maximizar experimentalmente los campos de luz en la interfaz deseable y minimizar los campos de luz en la otra interfaz. Por lo tanto, los coeficientes de Fresnel o los coeficientes de campo locales deben calcularse a través del modelo de película delgada y ser validados con respecto a los resultados experimentales^{3,9,10,11, 12,13,14,15,30}.

Con el antecedente anterior en mente, algunas interfaces poliméricas y biológicas podrían ser investigadas con el fin de entender la ciencia fundamental desde el nivel molecular. A continuación, tomando tres problemas interfaciales como ejemplos: sondeo de poli(2-hidroxietilo metacrilato) (PHEMA) superficie y enterrada interfaz con sustrato⁹, formación de estructuras secundarias de fibroína de seda (SF) en la superficie de poliestireno (PS) y estructuras de agua que rodean el modelo de oligonucleótido de cadena corta dúplex^16,21, mostraremos cómo la espectroscopia vibratoria SFG ayuda a revelar las estructuras interfaciales de nivel molecular en conexión con la ciencia subyacente.

Protocolo

1. SFG experimental

1. Utilice un sistema comercial de picosegundo SFG (Tablade materiales),que proporciona un haz fundamental de 1064 nm con un ancho de pulso de 20 ps y una frecuencia de 50 Hz, basado en un láser Nd:YAG.
2. Convierta el haz fundamental de 1064 nm en un haz de 532 nm y un haz de 355 nm utilizando módulos armónicos segundo y tercero. Guiar directamente el haz de 532 nm como un haz de luz de entrada y generar el otro haz de infrarrojo medio de entrada (IR) que cubre el rango de frecuencia de 1000 a 4000 cm^-1 a través de la generación paramétrica óptica (OPG) / amplificación paramétrica óptica (OPA)/ proceso de generación de frecuencia de diferencia (DFG).
3. Establezca los ángulos de incidencia de dos haces de entrada en 53o (IR) y 64o (visible), respectivamente, frente a la normal de la superficie.
4. Para detectar las estructuras interfaciales de polímero (interfaz de película/sustrato o película/la otra interfaz media), utilice ssp (haz de suma-frecuencia polarizado s, haz visible polarizado s y haz infrarrojo p-polarizado) y combinaciones de polarización ppp.
5. Para detectar las estructuras secundarias de proteínas interfaciales y las estructuras de agua que rodean el ADN, además de ssp y ppp, utilice combinaciones de polarización chiral spp y psp.
6. Para asegurarse de que las muestras no están dañadas, controle las energías infrarrojas y de pulso visibles a 70 y 30 mJ, respectivamente. En la Figura 1se muestra un esquema del proceso SFG con el diagrama de nivel de energía. La Figura 2 muestra el sistema SFG en nuestra sala limpia.

2. Coeficientes de Fresnel

1. Utilice prismas de ángulo recto como sustratos para todos los experimentos que se discuten aquí. Existen dos interfaces para una película de polímero en el sustrato sólido, es decir, la superficie del polímero en el aire y la interfaz de polímero/sustrato. Ambos pueden generar señales SFG puesto que la simetría de inversión se rompe en ambas interfaces. Por lo tanto, un espectro SFG recogido es uno interferido. Sin embargo, los coeficientes de campo locales o los coeficientes de Fresnel en las dos interfaces pueden ser ajustables variando los ángulos de incidencia o el espesor de la película uno a la vez o simultáneamente^31,32. Esto nos brinda la oportunidad de sondear la señal vibratoria SFG desde una sola interfaz. Aquí, la película PHEMA en el prisma CaF₂ fue tomada como ejemplo⁹.
2. Como se muestra en la Figura3, emplee la geometría del prisma del ángulo recto para detectar las señales SFG generadas a partir de la película PHEMA inferior. La intensidad de salida de SFG en el modo reflejado se expresa como
   (1)
   donde denota el tensor de susceptibilidad no lineal de segundo orden efectivo.
   consta de tres partes, a saber, la interfaz prisma/polímero, la interfaz de polímero/medio inferior (medio inferior incluye gas, líquido o sólido.) y el fondo no resonante, como se muestra en la siguiente ecuación.
   (2)
   Aquí el medio inferior podría ser aire, agua o algo más. F representa el coeficiente de Fresnel correspondiente responsable de la corrección de campo local.
3. Aplique un modelo de película delgada para calcular los coeficientes de Fresnel en este caso. Aquí sólo se presentan breves procedimientos de cálculo.
   1. Para la interfaz prisma/polímero, utilice
      (3)
      (4)
      (5)
      El significado de cada parámetro mostrado se presenta a continuación.
      1. denota la frecuencia del haz.
      2. t_p y t_s denotan los coeficientes globales de transmisión y pueden expresarse como
         (6)
         (7)
      3. t_p12 y t_s12 denotan los coeficientes de transmisión lineal del haz de luz en la interfaz prisma/polímero.
      4. r_p23 y r_s23 denotan los coeficientes de reflexión lineal del haz de luz en la interfaz polímero/medio.
      5. Representa la diferencia de fase entre un haz reflectante y su haz reflectante secundario después de que se propague a través de la película delgada del polímero y luego se refleje de nuevo, que se puede expresar como
         (8)
      6. El valor de la longitud de onda del haz de luz representa el espesor de la película de polímero.
      7. Los ángulos de incidente de los niveles 1 y ₂ representan los ángulos de incidencia en la interfaz de prisma/polímero y la interfaz polímero/medio, respectivamente.
      8. n₁ y n₂ representan los índices de refracción del prisma y la película polimérica respectivamente.
      9. n₁₂ representa los índices de refracción de las capas interfaciales de polímero para el prisma/polímero.
   2. Para la interfaz polímero/media, utilice
      (9)
      (10)
      (11)
      1. El valor de la fase de los campos eléctricos de luz en dos interfaces.
      2. Debido a que el ancho de pulso para nuestros haces de entrada es de 20 ps, se puede descuidar el error del retardo de tiempo asociado con el efecto de dispersión.
      3. La expresión de dicha diferencia de fase para el SFG de salida, la entrada visible y los haces infrarrojos de entrada se pueden escribir por separado como
         (12)
         (13)
         (14)
          
4. A partir de la discusión anterior, para el sistema de película de prisma-polímero (1-2-3), expresar los coeficientes de Fresnel totales para las interfaces de prisma/polímero y polímero/medio como las siguientes ecuaciones, para las combinaciones de polarización ssp y ppp . Por supuesto, ambas interfaces se consideran isotrópicas azimutaly.
   1. Para la interfaz prisma/polímero, las expresiones de los coeficientes de Fresnel totales para las combinaciones de polarización ssp y ppp se presentan de la siguiente manera.
      1. Para ssp, la ecuación es
         (15)
      2. Y para ppp, la ecuación es
         (16)
         (17)
         (18)
         (19)
          
      3. t₁₀ y t₀₁ denotan los coeficientes de transmisión lineal en las interfaces aire/prisma y prisma/aire respectivamente.
   2. Para la interfaz polímero/medio, las expresiones de los coeficientes de Fresnel totales para las combinaciones de polarización ssp y ppp se describen de la siguiente manera.
      1. Para ssp, la ecuación es
         (20)
      2. Para ppp, las ecuaciones son
         (21)
         (22)
         (23)
         (24)
            
          
5. Después de calcular los coeficientes de Fresnel utilizando el modelo emparedado, trazarlos como una función del espesor de la película, como se muestra en la Figura4.
   NOTA: En este caso, existe un rango de espesor para recoger la señal SFG de la interfaz caF₂ prisma/PHEMA con contribución descuidada de la otra interfaz, que es alrededor de 150 nm. Del mismo modo, se puede elegir un espesor adecuado para la detección de la interfaz del medio PHEMA/inferior con una contribución descuidada de la interfaz de prisma/PHEMA CaF 2.

3.Combinación de polarización C hiral SFG

1. Para la interfaz achiral normal, comúnmente, utilice la simetría de C_-v en términos de conjunto promedio^33,34. Con el funcionamiento de la simetría de inversión, se pueden deducir los componentes del tensor de susceptibilidad no lineal de segundo orden distinto, que son c_xxz, c_xzx, c_zxx, c_yyz, c_yzy, c_zyy y c_zzz (el los términos existentes se pueden reducir aún más si se asume una interfaz isotrópica, lo que significa que x e y son los mismos). Sin embargo, para la interfaz quiral, la situación será diferente. La interfaz quiral posee la simetría de C, solo se permite la operación de simetría de rotación. En este caso, además de los términos aquirales normales, más susceptibilidades no lineales de segundo orden serán distintos, lo que puede denominarse términos quirales, a saber, c_zyx,c_zxy y c_yzx bajo la consideración de no electrónicos Resonancia. Por lo tanto, mediante el uso de combinaciones de polarización psp, pps y spp, espectros quirales SFG se pueden recoger^33,34.

4. Preparación de muestras

1. Preparación de la película PHEMA
   1. Disolver el polvo PHEMA (ver Tabla de Materiales)en etanol anhidro para preparar la solución con 2 wt% y 4% wt% respectivamente.
   2. Antes de la deposición de las películas PHEMA, remoje primero los prismas de ángulo recto CaF₂ en el disolvente de tolueno y luego lávelos con etanol y agua ultrapura (18,2 m.cm).
   3. Después, exponga los sustratos (prismas de ángulo recto CaF 2) al plasma de oxígeno para eliminar posibles contaminantes orgánicos por limpiador de plasma (ver Tabla de Materiales).
      1. Primero encienda el limpiador de plasma y coloque los sustratos en él.
      2. A continuación, encienda la bomba de vacío para aspirar el limpiador. Introduzca el oxígeno en él.
      3. Finalmente ajuste 4 minutos para la limpieza. Después de eso, conservar los sustratos limpios para la preparación secuencial de la película PHEMA.
      4. A continuación, prepare las películas PHEMA en los prismas CaF₂ por un spin-coater (ver Tabla de Materiales). Ajuste los espesores de la película por la concentración de la solución y la velocidad de giro.
         1. Inmovilizar el prisma CaF₂ en el disco de succión de la pesión.
         2. Suelte una gota de la solución PHEMA preparada antes sobre los sustratos limpios a 1.500 rpm durante 1 min (espesor de película 2 wt% para 100 nm y 4 % wt para 200 nm).
      5. Anneal todas las películas PHEMA preparadas en un horno al vacío a 80oC durante la noche.
2. Preparación de fibroína de seda (SF)
   NOTA: Se adoptó el protocolo sugerido por Kaplan et al.^35.
   1. Colocar 7,5 g de capullos de seda de B. mori en el carbonato sódico hirviendo (Na₂CO₃, 0.02 M) solución acuosa (3 L) durante 30 min. Retire el SF fibroso a un recipiente limpio.
   2. Lavar el SF fibroso obtenido con agua desionizada durante tres veces bajo agitación con el fin de eliminar las moléculas de esericina y dejar sólo las moléculas de SF en la muestra fibrosa.
   3. Seque la muestra de SF fibroso en un horno al vacío a 60 oC durante la noche.
   4. Después, disolver la muestra de SF fibroso desengomada en una solución acuosa de bromuro de litio (LiBr, 9,3 M) (1 g de SF se resolvió en 4 ml de solución de LiBr)) e incubarla a 60 oC durante 2 h bajo agitación.
   5. Dializar la solución SF contra el agua desionizada (3.500 Bolsas de diálisis Da) durante 3 días para eliminar el LiBr disuelto. Cambie el agua nueva desionizada tres veces al día. Por último, almacene la solución SF procesada a 4 oC para experimentos Posteriores de SFG.
3. Preparación de dúplex de oligonucleótido de cadena corta
   1. Ordenar la muestra de oligonucleótido de una sola cadena con su 3'-end modificado por colesterol-trietilenglicol (Chol-TEG) (5'-GCTTCCGAAGGTCGA-3') de una corporación comercial (véase tabla de materiales)así como la complementaria. Para cada hebra, disolver 10 nmol del polvo de muestra en 0,5 ml de agua ultrapura. A continuación, mezclarlos para formar la solución de oligonucleótido dúplex (10 nmol/mL).
   2. Mezclar 2 mg de 1,2-Dipalmitoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC) y 2 mg de DPPC deuterated (d-DPPC) y disolverlos en 1 mL de cloroformo para preparar la solución lipídica.
   3. Preparación de DPPC y d-DPPC monocapa por una vaguada Langmuir-Blodgett (LB)
      1. Fije el prisma CaF₂ de ángulo recto a un soporte de muestra casero con una cara de prisma ligeramente sumergida en el ambiente acuoso de la vaguada LB.
      2. Después, inyectar la solución de lípidos mixta preparada antes sobre la superficie delagua hasta que la presión superficial alcance un cierto valor por debajo de 34 mN-m.1 .
      3. Después de los niveles de presión superficial apagados, utilice dos barreras de teflón para comprimir la monocapa de lípidos en una proporción de 5 mm/min hasta que se alcance una presión superficial de 34 mN-m.1.
      4. Levante el prisma con una monocapa lipídica fuera del agua a una velocidad de 1 mm/min verticalmente.
   4. Preparación de la otra monocapa lipídica
      1. Para facilitar el montaje del oligonucleótido dúplex y las moléculas lipídicas a través de la interacción hidrofóbica (colesterol y una cadena de alquilo lipídico), mezcle la solución de oligonucleótido dúplex con la solución lipídica en una proporción molar de 1:100 (oligonucleótido a lipídis).
      2. Inyectar la solución mixta de lípidos y oligonucleótidos dúplex en la superficie del agua en un recipiente de teflón casero hasta alcanzar una presión superficial de 34 mN-m^n.o 1.
   5. Finalmente, ponga la monocapa lipídica en la parte inferior del prisma en contacto con la monocapa lipídica con oligonucleótidos dúplex insertados en la superficie del agua para formar la muestra final para la medición de SFG.
4. Ecuación de Lorentz
   1. Utilice la ecuación de Lorentz para ajustar los espectros SFG para extraer la información vibratoria de un modo vibratorio específico.
      (25)
      donde representa la intensidad del modo vibratorio qth, representa la frecuencia resonante, denota la media anchura a la mitad máxima (HWHM) y representa la frecuencia de escaneo del haz IR incidente.

Resultados

En la parte del coeficiente Fresnel de la Sección de Protocolo, hemos demostrado que, teóricamente, es factible detectar selectivamente una sola interfaz a la vez. Aquí, experimentalmente, confirmamos que esta metodología es básicamente correcta, como se muestra en la Figura 5 y la Figura 6.

La Figura 5 muestra la estructura interfacial enterrada PHEMA después de la intrusión de agua con una pelíc...

Discusión

Para investigar la información estructural desde un nivel molecular, SFG tiene sus ventajas inherentes (es decir, sensibilidad monocapa o submonocapa e selectividad interfacial), que se pueden aplicar para estudiar diversas interfaces, como la sólida/sólida, sólida/ líquido, sólido/gas, líquido/gas, interfaces líquido/líquido. Aunque el mantenimiento del equipo y la alineación óptica siguen llevando mucho tiempo, el pago es significativo en el medida en que se puede obtener la información detallada a nivel mo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Inc.	850355P-1g
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092680	≥99.7%
CaF2 prism	Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Calcium chloride anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10005817	≥96.0%
deuterated DPPC (d-DPPC)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860345P-100mg
Electromagnetic oven	Zhejiang Supor Co., Ltd	C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) trough	KSV NIMA Co., Ltd.	KN 2003
Lithium bromide anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	20056926
Milli-Q synthesis system	Millipore		Ultrapure water
Plasma cleaner	Chengdu Mingheng Science&Technology Co., Ltd	PDC-MG	Oxygen plasma cleaning
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA)	Sigma-Aldrich Co., LLC.	192066 MSDS	Mw = 300 000
Polystyrene	Sigma-Aldrich Co., LLC.	330345 MSDS	Mw = 48 kDa and Mn = 47 kDa
Silk cocoons			From Bombyx mori
Single complementary strand of oligonucleotide	Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.	H03596	5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
Single strand of oligonucleotide	Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.	H04936	3¢-end modified by cholesterol-triethylene glycol(Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Sodium carbonate anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019260	≥99.8%
Spin-coater	Institute of Microelectronics of the Chinese Academy of Sciences	KW-4A	For the prepartion of ploymer films
Step profiler	Veeco	DEKTAK 150	For the measurement of film thickness
Sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy system	EKSPLA		A commercial picosecond SFG system