Grenzflächenphysikalische Strukturen von Polymeren und Biomakromolekülen, die über sum frequency generation Vibrational Spectroscopy aufgedeckt werden

Zusammenfassung

Die umfassende Nutzung der SUM-Frequenzerzeugung (SFG) kann dazu beitragen, die Kettenkonformationsreihenfolge und den sekundären Strukturwandel an Polymer- und Biomakromolekülschnittstellen aufzudecken.

Zusammenfassung

Als nichtlineare optische Spektroskopie zweiter Ordnung wurde die SUM-Frequenzerzeugung (SFG) in der Untersuchung verschiedener Oberflächen und Schnittstellen weit verbreitet eingesetzt. Diese nicht-invasive optische Technik kann die lokalen molekularen Informationen mit Monolayer- oder Submonolayer-Empfindlichkeit versorgen. Wir bieten hier experimentelle Methoden an, wie die vergrabene Schnittstelle sowohl für Makromoleküle als auch für Biomakromoleküle selektiv erkannt werden kann. Vor diesem Hintergrund werden grenzflächenförmige Sekundärstrukturen von Seidenfibroin und Wasserstrukturen um Modell-Kurzketten-Oligonukleotid-Duplex diskutiert. Erstere zeigt eine Kettenüberlappung oder räumliche Einschließungswirkung und letztere zeigt eine Schutzfunktion gegen die Ca 2+-Ionen, die sich aus dem chiralen Wirbelsäulenüberbau von Wasser ergeben.

Einleitung

Die Entwicklung der Summenfrequenzerzeugung (SFG) Schwingungsspektroskopie kann auf die Arbeit von Shen et al. vor dreißig Jahren^1,2zurückdatiert werden. Die Einzigartigkeit der Grenzflächenselektivität und Submonolayer-Empfindlichkeit macht die SFG-Schwingungsspektroskopie von einer großen Anzahl von Forschern aus den Bereichen Physik, Chemie, Biologie und Materialwissenschaft usw. geschätzt^{3,4 ,5}. Derzeit wird ein breites Spektrum wissenschaftlicher Fragen im Zusammenhang mit Oberflächen und Schnittstellen mit SFG untersucht, insbesondere für komplexe Schnittstellen in Bezug auf Polymere und Biomakromoleküle, wie z.B. die Kettenstrukturen und die strukturelle Entspannung an der vergrabene Polymerschnittstellen, die Proteinsekundärstrukturen und die Grenzflächenwasserstrukturen^{9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26}.

Für Polymeroberflächen und -schnittstellen werden Dünnschichtproben in der Regel durch Spin-Beschichtung hergestellt, um die gewünschten Oberflächen oder Schnittstellen zu erhalten. Das Problem ergibt sich aus der Signalstörung der beiden Schnittstellen der vorbereiteten Filme, was zu Unannehmlichkeiten bei der Analyse der gesammelten SFG-Spektren^27,28,29führt. In den meisten Fällen ist das Schwingungssignal nur von einer einzigen Schnittstelle, entweder Film/Substrat oder Film/das andere Medium, wünschenswert. Eigentlich ist die Lösung für dieses Problem ganz einfach, nämlich die Lichtfelder an der wünschenswerten Schnittstelle experimentell zu maximieren und die Lichtfelder an der anderen Schnittstelle zu minimieren. Daher müssen die Fresnel-Koeffizienten oder die lokalen Feldkoeffizienten über das Dünnschichtmodell berechnet und in Bezug auf die experimentellen Ergebnisse^{3,9,10,11, 12,13,14,15,30}.

Unter Berücksichtigung des obigen Hintergrunds könnten einige polymere und biologische Schnittstellen untersucht werden, um die Grundlagenforschung auf molekularer Ebene zu verstehen. Im Folgenden, unter Deriddrei grenzflächenfragen als Beispiele: Sondierung Poly(2-Hydroxyethylmethacrylat) (PHEMA) Oberfläche und vergrabene Schnittstelle mit Substrat⁹, Bildung von Seidenfibroin (SF) Sekundärstrukturen auf der Polystyrol (PS) Oberfläche und Wasserstrukturen, die das Modell Kurzketten-Oligonukleotid Duplex^16,21umgeben, zeigen wir, wie die SFG-Schwingungsspektroskopie hilft, die grenzflächenförmigen molekularen Strukturen im Zusammenhang mit der zugrunde liegenden Wissenschaft aufzudecken.

Protokoll

1. SFG experimentell

1. Verwenden Sie ein kommerzielles Picosecond SFG-System (Tabelle der Materialien), das einen grundlegenden 1064 nm Strahl mit einer Pulsbreite von 20 ps und einer Frequenz von 50 Hz, basierend auf einem Nd:YAG-Laser, bietet.
2. Konvertieren Sie den basisgebischen 1064 nm-Strahl in einen 532 nm-Strahl und einen 355 nm-Strahl mit Hilfe von zweiten und dritten harmonischen Modulen. Führen Sie den 532 nm-Strahl direkt als Eingangslichtstrahl und erzeugen Sie den anderen Eingangs-Mittelinfrarotstrahl (IR) über den Frequenzbereich von 1000 bis 4000 cm^-1 durch die optische parametrische Erzeugung (OPG)/optische parametrische Verstärkung (OPA)/ Differenzfrequenzgenerierung (DFG).
3. Legen Sie die Einfallswinkel von zwei Eingangsstrahlen auf 53° (IR) bzw. 64° (sichtbar) gegenüber der Oberflächennormale fest.
4. Um die Polymergrenzflächenstrukturen (entweder Film/Substrat-Schnittstelle oder Film/die andere mittlere Schnittstelle) zu erkennen, verwenden Sie ssp (s-polarisierte Summenfrequenzstrahl, s-polarisierter sichtbarer Strahl und p-polarisierter Infrarotstrahl) und ppp Polarisationskombinationen.
5. Um die Grenzflächenproteinsekundärstrukturen und Wasserstrukturen, die die DNA umgeben, zu erkennen, wurden neben ssp und ppp auch chirale Spp- und psp-Polarisationskombinationen verwendet.
6. Um sicherzustellen, dass die Proben nicht beschädigt wurden, steuern Sie die Infrarot- und sichtbaren Pulsenergien auf 70 bzw. 30 mJ. Ein Schaltplan des SFG-Prozesses mit dem Energiepegeldiagramm wurde in Abbildung 1dargestellt. Abbildung 2 zeigt das SFG-System in unserem Reinraum.

2. Fresnel-Koeffizienten

1. Verwenden Sie rechtwinklige Prismen als Substrate für alle hier diskutierten Experimente. Es gibt zwei Schnittstellen für einen Polymerfilm auf dem festen Substrat, d.h. Polymeroberfläche in Luft und Polymer/Substrat-Schnittstelle. Beide können SFG-Signale erzeugen, da die Inversionssymmetrie an beiden Schnittstellen unterbrochen ist. Daher ist ein gesammeltes SFG-Spektrum ein gestörtes. Die lokalen Feldkoeffizienten oder die Fresnel-Koeffizienten an den beiden Schnittstellen können jedoch durch Variation der Einfallswinkel oder der Filmdicke nacheinander oder gleichzeitig^31,32einstellbar werden. Dies bietet uns die Möglichkeit, das SFG-Schwingungssignal von nur einer Schnittstelle aus zu sondieren. Hier wurde der PHEMA-Film auf dem CaF₂ Prisma als Beispiel⁹genommen.
2. Wie in Abbildung 3gezeigt, verwenden Sie die rechtwinklige Prismengeometrie, um die SFG-Signale zu erkennen, die aus der unteren PHEMA-Folie erzeugt werden. Die SFG-Ausgangsintensität im reflektierten Modus wird als
   (1)
   wobei der effektive nichtlineare Anfälligkeitstensor zweiter Ordnung bezeichnet wird.
   besteht aus drei Teilen, nämlich der Prisma/Polymer-Schnittstelle, der Polymer-/Bodenmittelschnittstelle (unteres Medium enthält Gas, flüssigkeit oder fest.) und dem nicht resonanten Hintergrund, wie in der folgenden Gleichung dargestellt.
   (2)
   Hier könnte das untere Medium Luft, Wasser oder etwas anderes sein. F stellt den entsprechenden Fresnel-Koeffizienten dar, der für die lokale Feldkorrektur verantwortlich ist.
3. Wenden Sie in diesem Fall ein Dünnschichtmodell an, um die Fresnel-Koeffizienten zu berechnen. Hier werden nur kurze Berechnungsverfahren vorgestellt.
   1. Für die Prisma/Polymer-Schnittstelle
      (3)
      (4)
      (5)
      Die Bedeutung der einzelnen dargestellten Parameter wird unten dargestellt.
      1. I bezeichnet die Strahlfrequenz.
      2. t und t_s bezeichnen die Gesamttransmissionskoeffizienten und können als
         (6)
         (7)
      3. t_p12 und t_s12 bezeichnen die linearen Transmissionskoeffizienten des Lichtstrahls an der Prisma/Polymer-Schnittstelle.
      4. r_p23 und r_s23 bezeichnen die linearen Reflexionskoeffizienten des Lichtstrahls an der Polymer-/Mittelschnittstelle.
      5. • stellt die Phasendifferenz zwischen einem reflektierenden Strahl und seinem sekundären Reflexionsstrahl dar, nachdem er sich über den Polymer-Dünnfilm ausbreitet und dann zurück reflektiert, der als
         (8)
      6. stellt die Wellenlänge des Lichtstrahls dar und d ist die Polymerschichtdicke.
      7. Die Einfallswinkel an der Prisma-Polymer-Schnittstelle bzw. der Polymer-/Medium-Schnittstelle stellen die Einfallswinkel dar.
      8. n₁ und _n2 stellen die Brechungsindizes des Prismas bzw. der Polymerfolie dar.
      9. n₁₂ stellt die Brechungsindizes der Polymergrenzflächenschichten für das Prisma/Polymer dar.
   2. Für die Polymer/Medium-Schnittstelle
      (9)
      (10)
      (11)
      1. - stellt die Phasendifferenz der elektrischen Lichtfelder an zwei Schnittstellen dar.
      2. Da die Pulsbreite für unsere Eingangsstrahlen 20 ps beträgt, kann der Fehler aus der Zeitverzögerung, die mit dem Dispersionseffekt verbunden ist, vernachlässigt werden.
      3. Der Ausdruck einer solchen Phasendifferenz für den Ausgang SFG, den sichtbaren Eingang und die Eingangs-Infrarotstrahlen kann separat als
         (12)
         (13)
         (14)
          
4. Aus der obigen Diskussion, für das Prisma-Polymer-Film-Medium (1-2-3) System, drücken Sie die gesamten Fresnel-Koeffizienten für das Prisma/Polymer und Polymer/Medium-Schnittstellen als die folgenden Gleichungen, für ssp- und ppp-Polarisationskombinationen aus. . Natürlich gelten beide Schnittstellen als azimutal isotrop.
   1. Für die Prisma/Polymer-Schnittstelle werden die Ausdrücke der gesamten Fresnel-Koeffizienten für ssp- und ppp-Polarisationskombinationen wie folgt dargestellt.
      1. Für sspist die Gleichung
         (15)
      2. Und für pppist die Gleichung
         (16)
         (17)
         (18)
         (19)
          
      3. t₁₀ und t₀₁ bezeichnen die linearen Transmissionskoeffizienten an den Luft-Prisma- bzw. Prismen-/Luftschnittstellen.
   2. Für die Polymer/Medium-Schnittstelle werden die Ausdrücke der gesamten Fresnel-Koeffizienten für ssp- und ppp-Polarisationskombinationen wie folgt beschrieben.
      1. Für sspist die Gleichung
         (20)
      2. Für pppsind die Gleichungen
         (21)
         (22)
         (23)
         (24)
            
          
5. Nach der Berechnung der Fresnel-Koeffizienten unter Verwendung des Sandwichmodells zeichnen Sie sie in Abhängigkeit von der Filmdicke, wie in Abbildung 4dargestellt.
   HINWEIS: In diesem Fall gibt es einen Dickenbereich zum Sammeln des SFG-Signals von der CaF₂ Prisma/PHEMA-Schnittstelle mit vernachlässigbarem Beitrag von der anderen Schnittstelle, der etwa 150 nm beträgt. Ebenso kann eine geeignete Dicke für die Detektion der PHEMA/Bodenmittelschnittstelle mit vernachlässigbarem Beitrag aus der CaF₂ Prisma/PHEMA-Schnittstelle gewählt werden.

3. Chirale SFG Polarisationskombination

1. Für die normale achirale Schnittstelle verwenden Sie häufig die C-V-Symmetrie in Bezug auf den Ensembledurchschnitt^{33, 34}. Mit der Operation der Inversionssymmetrie können die nichtlinearen Anfälligkeits-Tensorkomponenten ungleich Null abgeleitet werden, die c_xxz, c_xzx, c_zxx, c_yyz, c_yzy, c_zyy und c_zzz (die bestehende Begriffe können weiter reduziert werden, wenn von einer isotropen Schnittstelle ausgegangen wird, d.h. x und y sind identisch). Bei der chiralen Schnittstelle wird die Situation jedoch anders sein. Die chirale Schnittstelle besitzt die C-Symmetrie, nur die Rotationssymmetrieoperation ist zulässig. In diesem Fall werden neben den normalen achiralen Begriffen mehr nichtlineare Anfälligkeiten zweiter Ordnung ungleich Null sein, was als chirale Begriffe bezeichnet werden kann, nämlich c_zyx, c_zxy und c_yzx unter Berücksichtigung nicht-elektronischer Begriffe. Resonanz. Daher können mit psp, pps und spp Polarisationskombinationen chirale SFG-Spektren gesammelt werden^33,34.

4. Probenvorbereitung

1. Vorbereitung von PHEMA-Folie
   1. PHEMA-Pulver (siehe Materialtabelle) in wasserfreiem Ethanol auflösen, um die Lösung mit 2 Gew. bzw. 4 Gew.-% herzustellen.
   2. Vor der Abscheidung der PHEMA-Folien die CaF₂ Rechtwinkelprismen zunächst in das Tolululuus-Lösungsmittel einweichen und dann mit Ethanol und Reinstwasser (18,2 cm) waschen.
   3. Anschließend setzen Sie die Substrate (CaF₂ Rechtwinkelprismen) Sauerstoffplasma aus, um mögliche organische Verunreinigungen durch Plasmareiniger zu entfernen (siehe Tabelle der Materialien).
      1. Schalten Sie zuerst den Plasmareiniger ein und legen Sie die Substrate hinein.
      2. Schalten Sie dann die Vakuumpumpe ein, um den Reiniger zu saugen. Geben Sie den Sauerstoff darin ein.
      3. Stellen Sie schließlich 4 Minuten für die Reinigung ein. Danach die sauberen Substrate für die sequenzielle PHEMA-Folienvorbereitung aufbewahren.
      4. Dann bereiten Sie die PHEMA-Filme auf den CaF₂ Prismen mit einem Spincoater vor (siehe Materialtabelle). Passen Sie die Folienstärken durch die Lösungskonzentration und Spingeschwindigkeit an.
         1. Immobilisieren Sie das CaF₂ Prisma auf der Saugscheibe des Spincoaters.
         2. Lassen Sie einen Tropfen der zuvor vorbereiteten PHEMA-Lösung bei 1.500 Rpm für 1 min auf die sauberen Substrate (Foliendicke 2 Gewand% für 100 nm und 4 Gew.-% für 200 nm).
      5. Alle vorbereiteten PHEMA-Folien im Vakuumofen bei 80 °C über Nacht anneal.
2. Herstellung von Seidenfibroin (SF)
   HINWEIS: Das von Kaplan et al.³⁵ vorgeschlagene Protokoll wurde angenommen.
   1. 7,5 g Seidenkokons von B. mori in das kochende Natriumcarbonat (Na₂CO₃, 0,02 M) wässrige Lösung (3 L) für 30 min. Entfernen Sie die faserige SF in einen sauberen Behälter.
   2. Waschen Sie die erhaltene faserige SF dreimal unter Rühren mit entionisiertem Wasser, um die Sericinmoleküle zu entfernen und nur die SF-Moleküle in der faserigen Probe zu lassen.
   3. Die faserige SF-Probe über Nacht bei 60 °C im Vakuumofen trocknen.
   4. Anschließend die degummed faserige SF-Probe in einer wässrigen Lithiumbromidlösung (LiBr, 9,3 m) auflösen (1 g SF wurde in 4 ml LiBr-Lösung gelöst) und bei 60 °C für 2 h unter Rühren inkubieren.
   5. Dialyze die SF-Lösung gegen entionisiertes Wasser (3.500 Da Dialysebeutel) für 3 Tage, um die gelöste LiBr zu entfernen. Wechseln Sie dreimal täglich neues entionisiertes Wasser. Schließlich die verarbeitete SF-Lösung bei 4 °C für spätere SFG-Experimente aufbewahren.
3. Herstellung von kurzkettigem Oligonukleotid-Duplex
   1. Bestellen Sie die einsträngige Oligonukleotidprobe mit ihrer 3'-End-modifizierten durch Cholesterin-Triethylenglykol (Chol-TEG) (5'-GCTTCCGAAGGTCGA-3') von einem Handelsunternehmen (siehe Materialtabelle) sowie der komplementären. Für jeden einzelnen Strang 10 nmol des Probenpulvers in 0,5 ml Reinstwasser auflösen. Mischen Sie sie dann zu der Duplex-Oligonukleotidlösung (10 nmol/mL).
   2. Mischen Sie 2 mg 1,2-Dipalmitoyl-Sn-Glycero-3-Phosphocholin (DPPC) und 2 mg deuterated DPPC (d-DPPC) und lösen Sie sie in 1 ml Chloroform auf, um die Lipidlösung vorzubereiten.
   3. Herstellung der DPPC & d-DPPC Monolayer durch einen Langmuir-Blodgett (LB) Trog
      1. Befestigen Sie das rechtwinklige CaF₂ Prisma an einem hausgemachten Probenhalter mit einer Prismenfläche, die senkrecht in die wässrige Umgebung des LB-Trogs getaucht ist.
      2. Anschließend die vorbereitete gemischte Lipidlösung auf die Wasseroberfläche injizieren, bis der Oberflächendruck einen bestimmten Wert unter 34 mN'm^erreichthat.
      3. Verwenden Sie nach dem Abschalten des Oberflächendrucks zwei Teflonbarrieren, um die Lipidmonoschicht im Verhältnis 5 mm/min zu komprimieren, bis ein Oberflächendruck von 34 mN'm^'1 erreicht ist.
      4. Heben Sie das Prisma mit einer Lipid-Monoschicht mit einer Geschwindigkeit von 1 mm/min vertikal aus dem Wasser.
   4. Zubereitung der anderen Lipidmonoschicht
      1. Um die Montage des Duplexoligonukleotids und der Lipidmoleküle über die hydrophobe Wechselwirkung (Cholesterin und eine Lipidalkylkette) zu erleichtern, mischen Sie die Duplex-Oligonukleotidlösung mit der Lipidlösung in einem Molverhältnis von 1:100 (Oligonukleotid Lipid).
      2. In jizieren Sie die gemischte Lipid- und Duplex-Oligonukleotid-Lösung in einen hausgemachten Teflonbehälter auf die Wasseroberfläche, bis ein Oberflächendruck von 34 mNm¹ erreicht ist.
   5. Schließlich setzen Sie die Lipid-Monoschicht an der Unterseite des Prismas in Kontakt mit der Lipid-Monoschicht mit eingelegten Duplex-Oligonukleotiden auf der Wasseroberfläche, um die letzte Probe für die SFG-Messung zu bilden.
4. Lorentz-Gleichung
   1. Verwenden Sie die Lorentz-Gleichung, um die SFG-Spektren anzupassen, um die Schwingungsinformationen für einen bestimmten Schwingungsmodus zu extrahieren.
      (25)
      wobei die Intensität des qth-Vibrationsmodus, die Resonanzfrequenz, die Halbbreite bei halbmaximaler (HWHM) und die Scanfrequenz des einfallenden IR-Strahls darstellt.

Ergebnisse

Im Fresnel-Koeffiziententeil des Protokollabschnitts haben wir gezeigt, dass es theoretisch möglich ist, selektiv nur eine einzige Schnittstelle gleichzeitig zu erkennen. Hier haben wir experimentell bestätigt, dass diese Methode grundsätzlich korrekt ist, wie in Abbildung 5 und Abbildung 6dargestellt.

Abbildung 5 zeigt die vergrabene Grenzflächen-PHEMA-Struktur nach Wassereinbruch mit einem PHEMA-Hyd...

Diskussion

Um die strukturellen Informationen von molekularer Ebene aus zu untersuchen, hat SFG seine inhärenten Vorteile (z.B. Monolayer- oder Submonolayer-Empfindlichkeit und Grenzflächenselektivität), die zur Untersuchung verschiedener Schnittstellen, wie z. B. der fest/fest Flüssigkeit, Feststoff/Gas, Flüssigkeit/Gas, Flüssigkeit/Flüssigkeitsschnittstellen. Obwohl die Wartung der Geräte und die optische Ausrichtung noch zeitaufwändig sind, ist der Gewinn insofern erheblich, als die detaillierten molekularen Information...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Inc.	850355P-1g
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092680	≥99.7%
CaF2 prism	Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Calcium chloride anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10005817	≥96.0%
deuterated DPPC (d-DPPC)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860345P-100mg
Electromagnetic oven	Zhejiang Supor Co., Ltd	C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) trough	KSV NIMA Co., Ltd.	KN 2003
Lithium bromide anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	20056926
Milli-Q synthesis system	Millipore		Ultrapure water
Plasma cleaner	Chengdu Mingheng Science&Technology Co., Ltd	PDC-MG	Oxygen plasma cleaning
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA)	Sigma-Aldrich Co., LLC.	192066 MSDS	Mw = 300 000
Polystyrene	Sigma-Aldrich Co., LLC.	330345 MSDS	Mw = 48 kDa and Mn = 47 kDa
Silk cocoons			From Bombyx mori
Single complementary strand of oligonucleotide	Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.	H03596	5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
Single strand of oligonucleotide	Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.	H04936	3¢-end modified by cholesterol-triethylene glycol(Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Sodium carbonate anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019260	≥99.8%
Spin-coater	Institute of Microelectronics of the Chinese Academy of Sciences	KW-4A	For the prepartion of ploymer films
Step profiler	Veeco	DEKTAK 150	For the measurement of film thickness
Sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy system	EKSPLA		A commercial picosecond SFG system