Strutture a livello molecolare interfacciale di polimeri e biomacromolecole rivelate tramite spettroscopia vibrazionale di generazione della frequenza di somma

Riepilogo

Essendo ampiamente utilizzata, la spettroscopia vibrazionale della generazione di frequenza della somma (SFG) può aiutare a rivelare l'ordine conformazionale della catena e il cambiamento strutturale secondario che avviene nelle interfacce polimeriche e biomacromolecolari.

Abstract

Come spettroscopia ottica non lineare di secondo ordine, la spettroscopia vibrazionale di generazione della frequenza della somma (SFG) è stata ampiamente utilizzata nello studio di varie superfici e interfacce. Questa tecnica ottica non invasiva può fornire le informazioni locali a livello molecolare con sensibilità monostrato o submonostrato. Qui stiamo fornendo una metodologia sperimentale su come rilevare selettivamente l'interfaccia sepolta sia per le macromolecole che per le biomacromolecole. Con questo in mente, vengono discusse le strutture secondarie interfacciali della fibroina di seta e delle strutture idriche intorno al modello short-chain oligonucleotide duplex. Il primo mostra una sovrapposizione a catena o un effetto di confinamento spaziale e il secondo mostra una funzione di protezione contro gli ioni Ca 2 o^più risultanti dalla sovrastruttura del colonna vertebrale chirale dell'acqua.

Introduzione

Lo sviluppo della spettroscopia vibrazionale di generazione della frequenza di somma (SFG) può essere datato al lavoro svolto da Shen et al. trent'anni fa^1,2. L'unicità della selettività interfacciale e della sensibilità sub-monostrato rende la spettroscopia vibrazionale SFG apprezzata da un gran numero di ricercatori nei campi della fisica, della chimica, della biologia e della scienza dei materiali, ecc.^{3,4 ,5}. Attualmente, un'ampia gamma di questioni scientifiche relative alle superfici e alle interfacce è in fase di studio utilizzando SFG, in particolare per interfacce complesse rispetto ai polimeri e alle biomacromolecole, come le strutture a catena e il rilassamento strutturale interfacce polimeriche sepolte, le strutture secondarie delle proteine e le strutture dell'acqua interfacciale^{9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26}.

Per le superfici e le interfacce polimeriche, i campioni di pellicola sottile sono generalmente preparati mediante rivestimento a spin per ottenere le superfici o le interfacce desiderate. Il problema sorge a causa dell'interferenza del segnale dalle due interfacce dei film così preparati, che porta a disagi per l'analisi degli spettri SFG raccolti^27,28,29. Nella maggior parte dei casi, il segnale vibrazionale solo da una singola interfaccia, sia pellicola / substrato o pellicola / l'altro mezzo, è auspicabile. In realtà, la soluzione a questo problema è abbastanza facile, vale a dire, per massimizzare sperimentalmente i campi di luce presso l'interfaccia desiderabile e ridurre al minimo i campi di luce presso l'altra interfaccia. Pertanto, i coefficienti di Fresnel o i coefficienti di campo locali devono essere calcolati tramite il modello a pellicola sottile e devono essere convalidati rispetto ai risultati sperimentali^{3,9,10,11, 12,13,14,15,30}.

Con il background di cui sopra in mente, alcune interfacce polimeriche e biologiche potrebbero essere studiate al fine di comprendere la scienza fondamentale a livello molecolare. Di seguito, prendendo come esempi tre problemi interfacciali: sondare la superficie poli(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) e l'interfaccia sepolta con il substrato⁹, formazione di fibrosi seta (SF) strutture secondarie sulla superficie del polistirolo (PS) e strutture idriche che circondano modello a catena corta oligonucleotide duplex^16,21, mostreremo come la spettroscopia vibrazionale SFG aiuta a rivelare le strutture a livello molecolare interfacciale in connessione con la scienza sottostante.

Protocollo

1. SFG sperimentale

1. Utilizzare un sistema SFG picosecondo commerciale (Table of Materials), che fornisce un fascio fondamentale di 1064 nm con una larghezza dell'impulso di 20 ps e una frequenza di 50 Hz, basata su un laser Nd:YAG.
2. Convertire il fascio fondamentale da 1064 nm in un fascio da 532 nm e in un fascio di 355 nm utilizzando il secondo e il terzo modulo armonico. Guidare direttamente il fascio di 532 nm come un fascio di luce di ingresso e generare l'altro fascio a infrarossi (IR) di ingresso che copre l'intervallo di frequenza da 1000 a 4000 cm^-1 attraverso la generazione parametrica ottica (OPG)/amplificazione parametrica ottica (OPA)/ processo di generazione della frequenza di differenza (DFG).
3. Impostare gli angoli di incidente di due travi di ingresso in modo che siano rispettivamente di 53 gradi (IR) e di 64 gradi (visibili), rispetto alla normale alla superficie.
4. Per rilevare le strutture interfacciali interfacciali polimeriche (interfaccia pellicola/substrato o pellicola/altra interfaccia media), utilizzare ssp (fascio di frequenza a somma polarizzata s-polarizzato , fascio visibile polarizzato s e fascio infrarosso p-polarizzato) e combinazioni di polarizzazione ppp.
5. Per rilevare le strutture secondarie delle proteine interfacciali e le strutture idriche che circondano il DNA, oltre a ssp e ppp, sono state utilizzate combinazioni di spp chirale e psp polarizzazione.
6. Per garantire che i campioni non fossero danneggiati, controllare le energie dell'impulso infrarosso e visibile in modo che siano rispettivamente di 70 e 30 mJ. Uno schema del processo SFG con il diagramma del livello di energia è stato mostrato nella Figura 1. Figura 2 Mostra il sistema SFG nella nostra camera pulita.

2. Coefficienti Fresnel

1. Utilizzare prismi ad angolo retto come substrati per tutti gli esperimenti discussi qui. Esistono due interfacce per una pellicola polimerica sul substrato solido, cioè la superficie polimerica nell'aria e l'interfaccia polimerica/substrato. Entrambi possono generare segnali SFG poiché la simmetria di inversione è interrotta in entrambe le interfacce. Pertanto, uno spettro SFG raccolto è interferito. Tuttavia, i coefficienti di campo locale o i coefficienti Fresnel alle due interfacce possono essere regolabili variando gli angoli dell'incidente o lo spessore della pellicola uno alla volta o contemporaneamente^31,32. Questo ci offre l'opportunità di sondare il segnale vibrazionale SFG da una sola interfaccia. Qui, il film PHEMA sul prisma CaF₂ è stato preso come esempio⁹.
2. Come mostrato nella Figura 3, impiegare la geometria del prisma ad angolo retto per rilevare i segnali SFG generati dalla pellicola PHEMA inferiore. L'intensità di uscita SFG nella modalità riflessa è espressa come
   (1)
   dove indica l'efficace tensore di suscettibilità non lineare di secondo ordine.
   è costituito da tre parti, vale a dire l'interfaccia prism/polimero, l'interfaccia media polimero/inferiore (il mezzo inferiore comprende gas, liquido o solido.) e lo sfondo non risonante, come mostrato nell'equazione seguente.
   (2)
   Qui il mezzo inferiore potrebbe essere aria, acqua o qualcos'altro. F rappresenta il coefficiente Fresnel corrispondente responsabile della correzione del campo locale.
3. In questo caso, applicare un modello a pellicola sottile per calcolare i coefficienti di Fresnel. Qui vengono presentate solo brevi procedure di calcolo.
   1. Per l'interfaccia prism/polymer, utilizzare
      (3)
      (4)
      (5)
      Il significato di ogni parametro mostrato è presentato di seguito.
      1. _i indica la frequenza del fascio.
      2. t_p e t_s denotano i coefficienti di trasmissione complessivi e possono essere espressi come
         (6)
         (7)
      3. t_p12 e t_s12 denotano i coefficienti di trasmissione lineare del fascio di luce all'interfaccia prisma/polimero.
      4. r_p23 e r_s23 denotano i coefficienti di riflessione lineare del fascio di luce nell'interfaccia polimerica/media.
      5. rappresenta la differenza di fase tra un fascio riflettente e il suo fascio riflettente secondario dopo che si propaga attraverso la pellicola sottile polimerica e poi riflette indietro, che può essere espressa come
         (8)
      6. rappresenta la lunghezza d'onda del fascio di luce e d è lo spessore della pellicola polimerica.
      7. Gli n. 1 e i n. ₂ rappresentano gli angoli degli incidenti rispettivamente nell'interfaccia prism/polimero e nell'interfaccia polimero/medio.
      8. n₁ e n₂ rappresentano rispettivamente gli indici di rifrazione della pellicola prisma e polimerica.
      9. n₁₂ rappresenta gli indici refrattivi degli strati interfacciali polimerici per il prisma/polimero.
   2. Per l'interfaccia polimerica/media, utilizzare
      (9)
      (10)
      (11)
      1. La differenza di fase dei campi elettrici leggeri in due interfacce.
      2. Poiché la larghezza dell'impulso per le nostre travi di input è di 20 ps, l'errore del ritardo temporale associato all'effetto di dispersione può essere trascurato.
      3. L'espressione di tale differenza di fase per l'uscita SFG, l'ingresso visibile e le travi a infrarossi di ingresso possono essere scritte separatamente come
         (12)
         (13)
         (14)
          
4. Dalla discussione precedente, per il sistema prism-poliomer film-medium (1-2-3), esprimere i coefficienti Fresnel totali per le interfacce prism/polimero e polimero/medio come le seguenti equazioni, per le seguenti equazioni, per le combinazioni di polarizzazione ssp e ppp . Naturalmente, entrambe le interfacce sono considerate azimuthally isotropico.
   1. Per l'interfaccia prism/polimero, le espressioni dei coefficienti totali di Fresnel per entrambe le combinazioni di polarizzazione ssp e ppp sono presentate come segue.
      1. Per ssp, l'equazione è
         (15)
      2. E per ppp, l'equazione è
         (16)
         (17)
         (18)
         (19)
          
      3. t₁₀ e t₀₁ denotano i coefficienti di trasmissione lineare rispettivamente alle interfacce aria/prisma e prisma/aria.
   2. Per l'interfaccia polimero/medio, le espressioni dei coefficienti totali di Fresnel per entrambe le combinazioni di polarizzazione ssp e ppp sono descritte di seguito.
      1. Per ssp, l'equazione è
         (20)
      2. Per ppp, le equazioni sono
         (21)
         (22)
         (23)
         (24)
            
          
5. Dopo aver calcolato i coefficienti di Fresnel utilizzando il modello sandwich, tracciarli in funzione dello spessore della pellicola, come illustrato nella Figura 4.
   NOTA: In questo caso, esiste una gamma di spessore per la raccolta del segnale SFG dall'interfaccia CaF₂ prism/PHEMA con contributo trascurabile dall'altra interfaccia, che è di circa 150 nm. Allo stesso modo, uno spessore adatto può essere scelto per il rilevamento dell'interfaccia media PHEMA/inferiore con contributo trascurabile dall'interfaccia CaF₂ prism/PHEMA.

3. Ccombinazione di polarizzazione SFG

1. Per l'interfaccia achirale normale, in genere, utilizzare la simmetria di C_{. v} in termini di media dell'insieme^33,34. Con il funzionamento della simmetria di inversione, è possibile dedurre i componenti del tensore non lineare non lineare non-lineare non zero, che sono c_xxz, c_xzx, c_zxx, c_yyz, c_yzy, c_zyy e c_zzz (il termini esistenti possono essere ulteriormente ridotti se si assume un'interfaccia isotropica, il che significa che x e y sono uguali). Tuttavia, per l'interfaccia chirale, la situazione sarà diversa. L'interfaccia chirale possiede la simmetria di C, è consentita solo l'operazione di simmetria di rotazione. In questo caso, oltre ai normali termini achirali, più suscettibilità non lineari di secondo ordine sarà diverso da zero, che può essere definito come i termini chirali, vale a dire, c_zyx, c_zxy e c_yzx sotto la considerazione di non elettronici Risonanza. Pertanto, utilizzando psp, pps e combinazioni di polarizzazione spp, gli spettri SFG chirali possono essere raccolti^33,34.

4. Preparazione del campione

1. Preparazione del film PHEMA
   1. Sciogliere la polvere di PHEMA (vedi Tabella deimateriali) in etanolo anidrio soro per preparare la soluzione rispettivamente con 2 wt% e 4 wt%.
   2. Prima della deposizione dei film PHEMA, immergere le prismi dell'angolo retto CaF₂ nel solvente toluene prima di tutto e poi lavate con etanolo e acqua ultrapura (18,2 M .
   3. Successivamente, esporre i substrati (prismi ad angolo retto CaF 2) al plasma di ossigeno per rimuovere eventuali contaminanti organici dal pulitore di plasma (vedere Tabella dei materiali).
      1. Per prima cosa accendi il detersiva al plasma e mettici dentro i substrati.
      2. Quindi accendere la pompa del vuoto per aspirare il pulitore. Inserire l'ossigeno in esso.
      3. Infine impostare 4 minuti per la pulizia. Dopo di che, conservare i substrati puliti per la preparazione sequenziale della pellicola PHEMA.
      4. Quindi preparare le pellicole PHEMA sul CaF₂ prismi da uno spin-coater (vedi Tabella dei materiali). Regolare gli spessori della pellicola in base alla concentrazione della soluzione e alla velocità di rotazione.
         1. Immobilizzare il prisma CaF₂ sul disco da suzione di spin-coater.
         2. Eliminare una goccia della soluzione PHEMA preparata prima sui substrati puliti a 1.500 giri/mm per 1 min (spessore della pellicola 2 wt% per 100 nm e 4 wt% per 200 nm).
      5. Anneal tutte le pellicole PHEMA preparate in un forno a vuoto a 80 gradi durante la notte.
2. Preparazione della fibroina di seta (SF)
   NOTA: È stato adottato il protocollo suggerito da Kaplan et al.^35.
   1. Mettere 7,5 g di bozzoli di seta di B. mori nel carbonato di sodio bollente (Na₂CO₃, 0,02 M) soluzione aqueous (3 L) per 30 m. Rimuovere il fibroso SF in un contenitore pulito.
   2. Lavare la SF fibrosa ottenuta con acqua deionizzata per tre volte sotto agitazione al fine di rimuovere le molecole di sericina e lasciare solo le molecole SF nel campione fibroso.
   3. Asciugare il campione fibroso di SF in un forno sottovuoto a 60 gradi centigradi durante la notte.
   4. Successivamente, sciogliere il campione fibroso degummed SF in un bromo di litio (LiBr, 9,3 M) soluzione aquesa (1 g di SF è stato risolto in 4 mL di soluzione LiBr.) e incubarlo a 60 gradi centigradi per 2 h sotto mescolando.
   5. Diallyze la soluzione SF contro l'acqua deionizzata (3.500 sacchetti di dialisi Da) per 3 giorni per rimuovere il disciolto LiBr. Cambiare nuova acqua deionizzata tre volte al giorno. Infine, conservare la soluzione SF elaborata a 4 gradi centigradi per i successivi esperimenti SFG.
3. Preparazione di oligonucleotide duplex a catena corta
   1. Ordina il campione di oligonucleotide a filamento singolo con il suo glicole a 3'fine modificato da colesterolo-trietilene (Chol-TEG) (5'-GCTTCCGAAGGTCGA-3') da una società commerciale (vedi Tabella dei materiali) e da quella complementare. Per ogni singolo filamento, sciogliere 10 nmol della polvere campione in acqua ultrapura da 0,5 ml. Quindi mescolare insieme per formare la soluzione oligonucleotide duplex (10 nmol/mL).
   2. Mescolare 2 mg di 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) e 2 mg di DPPC detererated (d-DPPC) e scioglierli in 1 mL di cloroformio per preparare la soluzione lipidica.
   3. Preparazione del mostrato DPPC e d-DPPC da parte di un trogolo Langmuir-Blodgett (LB)
      1. Fissare il prisma CaF₂ ad angolo retto a un supporto campione fatto in casa con una faccia di prisma perpendicolarmente immersa nell'ambiente acquoso della depressione LB.
      2. Successivamente, iniettare la soluzione di lipidi mista preparata prima sulla superficie dell'acqua fino a quando la pressione superficiale ha raggiunto un certo valore al di sotto di 34 mN-m^.
      3. Dopo che la pressione superficiale si sta spegnendo, usate due barriere di Teflon per comprimere il monostrato lipidico con un rapporto di 5 mm/min fino a raggiungere una pressione superficiale di 34 mn.m.
      4. Sollevare il prisma con un monostrato lipidico fuori dall'acqua ad una velocità di 1 mm / min verticalmente.
   4. Preparazione dell'altro strato di lipidi
      1. Per facilitare l'assemblaggio dell'oligonucleotide duplex e delle molecole lipidiche attraverso l'interazione idrofobica (colesterolo e una catena alchile lipidica), mescolare la soluzione oligonucleotide duplex con la soluzione lipidica in un rapporto molare di 1:100 (olinucleotide a lipidi).
      2. Iniettare la soluzione oligonucleotide mista lipidica e duplex sulla superficie dell'acqua in un contenitore di Teflon fatto in casa fino a raggiungere una pressione superficiale di 34 mN-m 1.
   5. Infine, mettere il mostrato lipidico nella parte inferiore del prisma a contatto con il monotema lipidico con oligonucleotidi duplex inseriti sulla superficie dell'acqua per formare il campione finale per la misurazione SFG.
4. Equazione di Lorentz
   1. Utilizzare l'equazione Lorentz per adattarsi agli spettri SFG per estrarre le informazioni vibrazionali per una specifica modalità vibrazionale.
      (25)
      dove rappresenta l'intensità della modalità qth vibrazionale, rappresenta la frequenza di risonanza, indica la metà della larghezza a metà massima (HWHM) e rappresenta la frequenza di scansione del fascio IR incidente.

Risultati

Nella parte del coefficiente Fresnel della Sezione Protocollo, abbiamo dimostrato che, teoricamente, è possibile rilevare selettivamente una sola interfaccia alla volta. Qui, sperimentalmente, abbiamo confermato che questa metodologia è fondamentalmente corretta, come illustrato nella Figura 5 e Figura 6.

Figura 5 Mostra la struttura PHEMA interfacciale sepolta dopo l'intrusione dell'acqua con una pelli...

Discussione

Per studiare le informazioni strutturali a livello molecolare, SFG ha i suoi vantaggi intrinseci (ad esempio, sensibilità monostrato o sub-monostrato e selettività interfacciale), che possono essere applicati per studiare varie interfacce, come il solido/solido, solido/ interfacce liquide, solide/gas, liquide/gas, liquide/liquide. Anche se la manutenzione dell'apparecchiatura e l'allineamento ottico richiedono ancora molto tempo, il payoff è significativo in quanto è possibile ottenere le informazioni dettagliate a l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Inc.	850355P-1g
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	100092680	≥99.7%
CaF2 prism	Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Calcium chloride anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10005817	≥96.0%
deuterated DPPC (d-DPPC)	Avanti Polar Lipids, Inc.	860345P-100mg
Electromagnetic oven	Zhejiang Supor Co., Ltd	C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) trough	KSV NIMA Co., Ltd.	KN 2003
Lithium bromide anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	20056926
Milli-Q synthesis system	Millipore		Ultrapure water
Plasma cleaner	Chengdu Mingheng Science&Technology Co., Ltd	PDC-MG	Oxygen plasma cleaning
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA)	Sigma-Aldrich Co., LLC.	192066 MSDS	Mw = 300 000
Polystyrene	Sigma-Aldrich Co., LLC.	330345 MSDS	Mw = 48 kDa and Mn = 47 kDa
Silk cocoons			From Bombyx mori
Single complementary strand of oligonucleotide	Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.	H03596	5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
Single strand of oligonucleotide	Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd.	H04936	3¢-end modified by cholesterol-triethylene glycol(Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Sodium carbonate anhydrous	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019260	≥99.8%
Spin-coater	Institute of Microelectronics of the Chinese Academy of Sciences	KW-4A	For the prepartion of ploymer films
Step profiler	Veeco	DEKTAK 150	For the measurement of film thickness
Sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy system	EKSPLA		A commercial picosecond SFG system