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Resumen

Grupo de proteínas de receptor germinant en 'germinosomes' en la membrana interna de las esporas de Bacillus subtilis . Se describe un protocolo utilizando proteínas de super resolución microscopia y fluorescente reportera para visualizar germinosomes. El protocolo también identifica dominios de membrana interna de la espora que preferentemente se tiñen con el colorante de membrana FM4-64.

Resumen

El pequeño tamaño de las esporas y la relativamente baja abundancia de proteínas de la germinación, causar dificultades en sus análisis microscópicos mediante microscopía de epifluorescencia. Microscopía de iluminación estructurada tridimensional súper resolución (3D-SIM) es una herramienta prometedora para superar este obstáculo y revelar los detalles moleculares del proceso de germinación de las esporas de Bacillus subtilis (B. subtilis). Aquí, describimos el uso de un SIMcheck modificado (ImageJ)-proceso de proyección de imagen 3D asistente y reportero fluorescente proteínas para microscopía SIM de germinosomes de esporas B. subtilis , clusters de las proteínas de la germinación. También presentamos un procedimiento de proyección de imagen 3D-SIM (estándar) para FM4-64 tinción de membranas de esporas B. subtilis . Mediante el uso de estos procedimientos, obtuvo una resolución para la localización de germinosome y demostrar que > 80% de B. subtilis KGB80 esporas latentes obtenidas después de la esporulación en el medio mínimo definido de MOPS tienen uno o dos GerD-GFP y GerKB-mCherry focos. Focos brillantes fueron también observados en FM4-64 manchados imágenes de 3D-SIM de esporas sugiriendo que existen dominios de lípidos de membrana interna probablemente diferentes fluidez. Otros estudios que utilizan doble etiquetado procedimientos con tintes de membrana y germinosome proteínas de reportero para evaluar la localización y así obtener un panorama óptimo de la organización de proteínas de bacilo germinación en la membrana interna de la espora son posible.

Introducción

Esporas de orden Bacillales y Clostridiales son metabólicamente inactivos y extraordinariamente resistente a los regímenes de descontaminación áspero, pero a menos que germinan, no pueden causar efectos nocivos en los seres humanos1. En la germinación activada germinant nutrientes de esporas de Bacillus subtilis (B. subtilis), el evento de iniciación es germinant Unión a los receptores germinant (GRs) situado en la membrana interna de la espora (IM). Posteriormente, el GRs transducen señales a la proteína de canal de SpoVA en el IM. Esto se traduce en el inicio del intercambio de esporas núcleo piridina-2, 6-dicarboxílico (ácido dipicolinic; DPA; comprende el 20% del peso seco de la base de espora) de agua a través del canal de SpoVA. Posteriormente, el lanzamiento DPA desencadena la activación de la hidrólisis del peptidoglicano de la corteza, y absorción de agua sigue2,3,4. Estos eventos conducen a esfuerzos mecánicos en las capas de la capa, su posterior ruptura, la aparición de la consecuencia y, finalmente, crecimiento vegetativo. Sin embargo, todavía lejos de se resuelven los detalles moleculares exactos del proceso de germinación.

Una cuestión importante sobre la germinación de esporas refiere a las propiedades biofísicas de los lípidos que rodean las proteínas de germinación IM así como las proteínas de canal de IM SpoVA. Esta bicapa de lipídica en gran parte inmóvil de IM es la barrera principal de la permeabilidad de muchas moléculas pequeñas, incluyendo conservantes químicos tóxicos, algunas de las cuales ejercen su acción en el núcleo de la espora o célula vegetativa citoplasma5,6. La bicapa lipídica IM es probable que en un estado de gel, aunque existe una fracción significativa de lípidos móviles en IM5. IM de la espora también tiene el potencial para una expansión significativa5. Así, aumenta la superficie de la IM 1.6-fold sobre germinación sin síntesis de membrana adicional y se acompaña de la pérdida de la membrana característica baja permeabilidad y lípidos inmovilidad5,6.

Mientras que los detalles moleculares de la activación de las proteínas de la germinación y organización de los lípidos de la IM en las esporas son atractivos temas de estudio, el pequeño tamaño de las esporas B. subtilis y la relativamente baja abundancia de proteínas de la germinación, plantean un desafío análisis microscópico. Griffiths et al. convincente evidencia de microscopio de epifluorescencia, utilizando reporteros fluorescentes fusionados a proteínas de la germinación, sugiere que en las esporas B. subtilis la proteína GerD organiza tres subunidades GR (A, B y C) de GerA, B y K GRs, en un cluster de7. Acuñó el término 'germinosome' para este grupo de proteínas de germinación y describe las estructuras como ~ 300 nm gran IM proteína focos8. Sobre la iniciación de la germinación de la espora, germinosome fluorescente focos en última instancia, cambian en mayor dispersar patrones fluorescentes, con > 75% de la población de esporas viendo este patrón en las esporas germinadas durante 1 h con L-valina8. Tenga en cuenta que el documento mencionado anteriormente usado promedio imágenes de docenas de imágenes fluorescentes consecutivos, para ganar potencia estadística y superar el obstáculo de baja señales fluorescentes observadas durante la proyección de imagen. Esta visualización de estas estructuras en esporas bacterianas estaba en el borde de lo que es técnicamente factible con herramientas microscópicas clásicas y ni una evaluación de la cantidad de focos en una sola espora ni su localización subcelular más detallada fue posible con este enfoque.

Aquí, demostramos que el uso de microscopía de iluminación estructurada (SIM) para obtener una visualización detallada y cuantificación de la germinosome(s) de las esporas de B. subtilis, así como de sus IM lípidos dominios9. El protocolo también contiene instrucciones para la esporulación, preparación de los portaobjetos y análisis de imagen por SIMcheck (v1.0, un plugin de imageJ) así como ImageJ10,11,12.

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Protocolo

1. esporulación de B. subtillis (tiempo: 7 días antes de la observación microscópica)

  1. Día 1
    1. Raya un cultivo bacteriano en caldo de Luria-Bertani (LB) agar placa (1% triptona, extracto de levadura 0.5%, 1% NaCl, agar al 1%)13 e incubar durante una noche a 37 ° C para obtener las colonias individuales. Utilizar la cepa B. subtilis KGB80 (PS4150 Edwin gerKC gerKB mCherry gato, gerD-gfp kan) y su cepa parental de fondo PS4150 B. subtilis (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) como se describe previamente7.
      Nota: El uso de esporas con el fondo de ΔcotEΔgerE es esencial en la visualización de la germinosome, con el fin de reducir al mínimo la autofluorescencia de la espora capa capas7.
    2. Esterilizar todos los medios, tubos, pipetas y otros materiales de la cultura para ser utilizados con los métodos adecuados.
  2. Día 2
    1. Inocular una colonia solo en 5 mL de medio LB temprano en la mañana e incubar el cultivo en agitación continua en un tubo de tapón de rosca en 200 rpm/min y 37 ° C hasta que el OD600 llegue a 0.3-0.4 (aproximadamente 7 h).
    2. Tomar 500 mL de medio de MOPS (pH 7,5) que contiene 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1,32 mM K2HPO4, 0,4 mM MgCl2·6H2O, 0,276 mM K2por4, 0.01 m m FeSO4·7H2O, 0,14 mM CaCl2·2H2O, 80 mM MOPS, Tricina, 0,1 mM MnCl2·2H2O, 10 mM D-glucosa-monohidrato de 4 mM y 10 mM de NH4Cl.
    3. Preparar en el tapón de rosca tubos 10-1- 10-7 diluciones seriadas de la cultura LB en 5 mL medio de MOPS cada e incubar los cultivos durante la noche bajo agitación constante a 200 rpm/min y 37 ° C.
      Nota: Las diluciones seriadas preparadas aquí pretenden obtener una dilución en la fase exponencial temprana en la mañana siguiente. Este paso y el siguiente paso están necesarios para permitir que las células a adaptarse al medio de crecimiento tampón MOPS.
  3. Día 3
    1. Seleccione una de las diluciones de MOPS con un OD600 de 0.3-0.4. Inocular 0,2 mL del cultivo a precalentado (37 ° C) 20 mL de medio de MOPS en un matraz cónico de 250 mL e incubar en agitación continua hasta que el OD600 llegue a 0.3-0.4 (~ 7 h).
    2. Inocular el medio de esporulación en base de MOPS (250 mL) con 1% (v/v) la cultura del paso 1.3.1 e incubar durante 3 días a 37 ° C en un matraz de litro cónico bajo agitación continua. Para FM4-64 tinción de esporas de PS4150, añadir 2 μg/mL FM4-64 la punta de prueba (véase Tabla de materiales) para la esporulación medio 1 o 2 h después de alcanzar el máximo valor de600 OD de crecimiento vegetativo (generalmente aproximadamente 2) y la cultura a posteriormente esporular mientras protege de la luz5.
  4. Día 7: Recolección de esporas
    1. Determinar el rendimiento de la esporulación (células vegetativas de esporas vs) utilizando microscopía de contraste de fase con 100 aumentos para distinguir las esporas brillante fase de células oscuras de fase y posiblemente no maduran las esporas. Se espera un rendimiento de 90% fase espora brillante.
    2. De la pelotilla de las esporas a 4.270 x g durante 15 min a 4 ° C en tubos de centrífuga fondo redondo. Lavar el precipitado de esporas 2 - 3 veces con 40 mL de agua ultra puro estéril del tipo 1 desmineralizada en tubos de centrífuga cónico de 50 mL (véase Tabla de materiales). La desaceleración en cada colada a 4.270 x g durante 15 min (4 ° C).
  5. Día 7: Purificación de esporas
    1. Purificación de la espora: suspender el sedimento de la espora en 750 μl del gradiente medio de 20% densidad no iónicos (véase tabla de materiales) y cargar en 800 μl de 50% no iónicos de densidad gradiente medio en tubos estériles de microcentrífuga. Centrifugar durante 60 min a 21.500 x g. El precipitado obtenido contiene las esporas libres. Suspender el sedimento de la espora en 200 μL de gradiente medio de 20% densidad no iónico y cargar en 1 mL de medio gradiente de densidad no iónicos de 50% en un tubo de microcentrífuga y centrifugar 15 min a 21.500 x g.
    2. Lavar la preparación final de la espora y el almacenamiento: el precipitado obtenido contiene las esporas latentes purificadas. Lavar el pellet de esporas 2 - 3 veces con 1,5 mL de estéril ultra pura tipo 1 de agua (véase Tabla de materiales) y la desaceleración entre a 9.560 x g durante 15 min a 4 ° C. Por último, suspender el sedimento en agua ultra pura estéril del tipo 1 a una final de OD600 de aproximadamente 30. Alícuotas de las esporas se pueden almacenar a-80 ° C durante 8 semanas14.

2. decapado

  1. Tratar PS4150 esporas con 0,1 M NaCl/0.1 M NaOH/1% sodio dodecil sulfato (SDS) / 0.1 M dithiothreitol (DTT) a 70 ° C por 1 h. lavar las esporas 10 veces con esterilizada ultra pura tipo 1 agua15,16. Al hacerlo, cualquier había adsorbido prueba FM4-64 en la membrana externa de la espora y se quitarán las capas externas.

3. cubreobjetos y preparación de los portaobjetos11 (tiempo: 1 H antes de observación)

  1. Cubreobjetos de la limpia de alta precisión (véase tabla de materiales) con 1 M de HCl por 30 min en un baño suavemente. Lavar los cubreobjetos dos veces en agua ultra pura tipo 1 y almacenarlas en un 100% (vol/vol) EtOH. Dejarlos secar y verificar su claridad antes del uso. Limpieza previa de las diapositivas de cristal en el 70% EtOH. Dejarlos secar y verificar su claridad antes del uso.

4. muestreo microesferas fluorescentes o esporas en el marco Gene diapositiva10 (tiempo 15 Min)

  1. Caliente previamente las dos 70% EtOH limpia portaobjetos secos (véase tabla de materiales) al aire durante varios segundos en un bloque de calefacción de 70 ° C, gota 65 μL de esterilizado agarosa 2% en 70 ° C sobre un portaobjeto y coloque el otro portaobjetos de cristal en la parte superior a la b de agarosa ntre las diapositivas. El parche de agarosa se seque en aproximadamente 5 minutos.
  2. Corte el parche de agarosa en una sección de 1 x 1cm después de quitar uno de los portaobjetos de vidrio, agregar 0,4 μL de muestra (microesferas fluorescentes o esporas de ~ 108/ml) y transferir el remiendo sobre el cubreobjetos de alta precisión al colocar el cubreobjetos sobre el parche y deslizar.
  3. Fijar un Gene Frame (1,5 x 1,6 cm2, 65 μL) en la diapositiva seca, sobre la cual se coloca el cubreobjetos cerrando todas las esquinas del marco, completando así la diapositiva para el uso en microscopía.

5. proyección de imagen de11,17(tiempo: 1 H)

  1. Capturar las imágenes de transmisión y de la fluorescencia de las esporas, así como una mezcla de rojo y amarillo-verde modificado carboxylate microesferas fluorescentes en un microscopio de iluminación estructurada (véase tabla de materiales) equipado con un 100 x (objetivo) aceite Apertura numérica = 1.49), un software de análisis de imagen y cámara de CCD (véase tabla de materiales). Generar todas las imágenes a temperatura ambiente sin la perturbación de la luz ambiente. Asegúrese de limpiar siempre el 100 x objetivo y el portaobjetos con el etanol del 75% antes de la proyección de imagen.
  2. Centran en microesferas fluorescentes de 100 nm (diámetro) y optimizar la función de extensión del punto (psf) ajustando el anillo de corrección en el objetivo de 100 x hasta una psf simétrico, minimizando así el desenfoque de la imagen. El psf es la respuesta del impulso o la respuesta de un sistema de proyección de imagen a un objeto de punto o punto de origen.
  3. Seleccione un campo de visión con microesferas fluorescentes ronda aproximadamente 10. Aplicar una rejilla foco ajuste para ambos 561 nm y longitudes de onda de excitación de nm 488 como la guía para el software de análisis de imagen.
  4. Se centran las esporas con la luz de la transmisión y captura de una imagen de luz de transmisión en el modo media 16 × con exposiciones de 200 ms para cada imagen.
  5. Captura de imágenes 3D-SIM fluorescente de las esporas con el modo de iluminación "3D-SIM", la configuración de la cámara a modo de lectura aumento de electrones multiplicando (EM) 10MHz a 14 bits y la ganancia de la EM en 175. Excitar la punta de prueba FM4-64 en esporas de PS4150 con luz de láser de 561 nm en el 20% energía del laser y un tiempo de iluminación de 400 ms.
  6. Excitar el mCherry GerKB y GerD-GFP en KGB80 esporas con, respectivamente, 561 nm de luz láser en energía del laser de 30% para 1 s y 488 nm láser luz 60% potencia del láser para valores de Z-Stack s. 3 son en la parte superior a inferior modo, 0.2 μm / paso, 7 pasos y 20 pasos para germinosome y Análisis de la IM, respectivamente.
    Nota: Estos parámetros de láser se aplicaron con el fin de asegurar un valor de brillo máximo de la ventana de histograma de alrededor 4.000.

6. reconstruir imágenes 3D-SIM de FM4-64 tinción de esporas de PS4150

  1. Realizar la reconstrucción del segmento N-SIM para el FM4-64 manchado datos crudos de las esporas de la PS4150. Haga clic en el botón Param para Reconstruir la hoja de ficha de pad N-SIM para abrir la ventana de reconstrucción de corte de SIM N.
  2. Configure los parámetros de reconstrucción en la ventana de Reconstrucción de Slice N-SIM . Para obtener imágenes perfectas reconstruidos, seguir la sugerencia de las instrucciones de SIM N y haga clic en los controles apropiados en la ventana de Reconstrucción de corte SIM N para establecer la Iluminación modulación de contraste (IMC) en Auto, alto Supresión de ruido de resolución (HRNS) a 1.00 y De supresión de desenfoque de enfoque (OFBS) a 0.05 como puntos de partida.
  3. Haga clic en el botón Reconstruir rebanada en la ventana N SIM Slice reconstrucción para reconstruir la imagen. Evaluar la calidad de las imágenes reconstruidas por las imágenes de la transformada rápida de Fourier (FFT) y puntuación de la reconstrucción, que después de reconstrucción12.
  4. Ajustar los HRNS de 0.10 a 5.00 y OFBS de 0,01 a 0,50 haciendo clic en los controles apropiados en la ventana de Reconstrucción de corte SIM N hasta obtener la mejor configuración de los parámetros es.
  5. Haga clic en el botón aplicar en la ventana N SIM Slice Reconstuction aplicar parámetros cambiantes. Haga clic en el botón cerrar para cerrar la ventana.
  6. Hacer un FM4-64 manchado PS4150 esporas imagen activa y haga clic en el botón Reconstruir rebanada en la hoja de ficha N SIM Pad para ejecutar la Reconstrucción de la rebanada. Guarda la imagen reconstruida.

7. Análisis de la imagen

  1. Convertir imágenes Pseudo-campo amplio de la germinosome de KGB80
    1. Convertir imágenes raw 3D-SIM de KGB80 Pseudo-Widefield imágenes mediante la activación con un clic izquierdo el plugin de ImageJ SIMcheck utilidad SI de datos Raw a Pseudo-Widefield12. Pseudo-campo amplio promedio de imágenes de datos SIM y monta, en comparación, una imagen equivalente a widefield convencional iluminación12. Para ImageJ se vea https://imagej.net/Welcome. Seleccione al azar ~ 25 esporas en cada imagen invertida de la transmisión para su posterior análisis de germinosome en las imágenes de campo amplio de Pseudo fluorescentes.
    2. Seleccione de las esporas de KGB80 total aproximadamente 350 (en este ejemplo, 346) en 14 campos de vista de dos diapositivas. El número de focos fluorescentes GerD-GFP y GerKB-mCherry en las esporas de KGB80 debe ser contado independientemente por dos investigadores. El investigador puede devolver a las imágenes raw 3D-SIM cuando en duda de la presencia de focos de germinosome fluorescente separada de las esporas.
    3. Evaluar las intensidades máximas de cada foco de GerD-GFP y GerKB-mCherry y la intensidad integrada de imagen 3D de cada espora KGB80 con ImageJ.
  2. Analizar imágenes Pseudo-campo amplio de la germinosome de KGB80
    1. Utilizar el valor de media intensidad integrada de 7 pilas como la intensidad de señal integrado de la espora KGB80. Determinar las intensidades de fondo por la tensión de fondo PS4150 con idéntica configuración de imagen. Consideran puntos fluorescentes en esporas de KGB80 individuales germinosome focos cuando son claramente distinguibles del fondo.
    2. Aplicar pruebas de ANOVA unidireccionales para determinación de significancia con el software de origen 9.0. teniendo en cuenta los valores de P < 0.05 como estadísticamente significativo. Uso de coeficiente de correlación de Spearman18 para evaluar la correlación de GerD-GFP y mCherry GerKB número de focos y las mediciones de la intensidad de señal integrado.

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Resultados

El protocolo actual presenta un procedimiento proyección de imagen del microscopio de la SIM para esporas bacterianas. Los procedimientos de preparación de esporulación y diapositiva se llevaron a cabo como se muestra en la figura 1 antes de la proyección de imagen. Más tarde, se aplicaron los procedimientos de análisis y proyección de imagen de ambos para dim (proteína fluorescente etiquetada proteínas de germinación) y brillante espora (sonda lipo...

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Discusión

El protocolo presentado contiene un procedimiento estándar 3D-SIM para el análisis de FM4-64 tinción de esporas B. subtilis que incluye esporulación, preparación de los portaobjetos y procesos de la proyección de imagen. Además, el protocolo describe un SIMcheck modificado (ImageJ)-asistido 3D imaging proceso para microscopía SIM de germinosomes de esporas B. subtilis con reporteros fluorescentes. El último procedimiento nos ha permitido observar esta estructura tenue con contraste. Por acoplam...

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Divulgaciones

No hay conflicto de interés declarado.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Christiaan Zeelenberg por su ayuda durante la proyección de imagen de la SIM. JW reconoce al Consejo de becas de China para una beca predoctoral y gracias Irene Stellingwerf por su ayuda durante la etapa primaria de la proyección de imagen.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Air dried glass slidesMenzel Gläser630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 LSigma-AldrichZ567868
Erlenmeyer flasks 250 mLSigma-AldrichZ723088
FluoSpheres carboxylate-modified microspheresInvitrogen, 0.1 μmF8803
FM4-64Thermo Fisher ScientificF34653
Histodenz nonionic density gradient mediumSigma-AldrichD2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD cameraAndor Technologyhttps://imagej.net/Welcome
LB AgarSigma-AldrichL2897
Microfuge tubes 1.5 mLThermo Fisher Scientific3451PK
Microscope imaging softwareNikon, JapanNIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed WaterMilliporeMilli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscope
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mLThermo Fisher Scientific75003800
Precision CoverslipsPaul Marienfeld117650
Round Bottom tubes 15 mLThermo Fisher ScientificNunc TM
Screw cap tubes 50 mLThermo Fisher ScientificNunc TM

Referencias

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