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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Cluster di proteine recettoriali germinant in 'germinosomes' nella membrana interna di spore di Bacillus subtilis . Descriviamo un protocollo utilizzando super risoluzione di microscopia e fluorescenti di proteine reporter per visualizzare germinosomes. Il protocollo identifica anche domini di membrana interna di spore che sono preferenzialmente colorate con il colorante di membrana FM4-64.

Abstract

Le piccole dimensioni delle spore e la relativamente bassa abbondanza di proteine di germinazione, causare difficoltà nelle loro analisi microscopiche mediante epifluorescenza. Microscopia di Super-risoluzione tridimensionale strutturato illuminazione (3D-SIM) è uno strumento promettente per superare questo ostacolo e rivelare i dettagli molecolari del processo di germinazione delle spore di Bacillus subtilis (Bacillus subtilis). Qui, descriviamo l'uso di un SIMcheck modificato (ImageJ)-processo di imaging 3D assistente e proteine reporter fluorescenti per microscopia SIM di germinosomes di b. subtilis spore, interumana delle proteine di germinazione. Presentiamo anche una procedura di imaging 3D-SIM (standard) per la colorazione delle membrane di spore di Bacillus subtilis FM4-64. Utilizzando queste procedure, abbiamo ottenuto la risoluzione insuperabile per la localizzazione di germinosome e mostrano che > 80% dei KGB80 di b. subtilis spore dormienti ottenute dopo la sporulazione su medium MOPS minimo definito hanno uno o due GerD-GFP e GerKB-mCherry fuochi. I fuochi luminosi erano anche osservato in FM4-64 macchiati immagini 3D-SIM spore suggerendo che domini lipidici della membrana interna di differenti fluidità probabile che esistano. Ulteriori studi che utilizzano la doppia etichettatura procedure con membrana coloranti e germinosome proteine reporter per valutare co-localizzazione e quindi ottenere una panoramica ottimale dell'organizzazione delle proteine di germinazione del bacillo nella membrana interna spora sono possibile.

Introduzione

Spore degli ordini Bacillales e Clostridiales sono metabolicamente dormienti e straordinariamente resistente ai regimi di decontaminazione duro, ma a meno che non germinano, non possono causare effetti deleteri in esseri umani1. In nutrienti germinant innescata germinazione di spore di Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), l'evento di iniziazione è germinant legame ai recettori germinant (GRs) situato nella membrana interna di spore (IM). Successivamente, il GRs trasdurre segnali alla proteina canale SpoVA anche situato nel IM. Questo provoca l'inizio dello scambio di spora core piridina-2,6-dicarbossilico (acido dipicolinico; DPA; composto da 20% di spora core asciutto wt) per l'acqua tramite il canale di SpoVA. Successivamente, il rilascio DPA innesca l'attivazione di idrolisi di peptidoglicano di corteccia, e l'assorbimento di acqua supplementare segue2,3,4. Questi eventi conducono allo sforzo meccanico degli strati di cappotto, sua rottura successiva, l'insorgenza di conseguenza e, infine, lo sviluppo vegetativo. Tuttavia, lungi dal vengono risolti i dettagli molecolari del processo di germinazione.

Una domanda importante sulla germinazione delle spore riguarda le proprietà biofisiche dei lipidi che circonda le proteine di germinazione di IM come pure le proteine canale IM SpoVA. Questo doppio strato lipidico in gran parte immobile IM è la barriera di permeabilità principale per molte piccole molecole, tra cui conservanti chimici tossici, alcuni dei quali esercitano la loro azione nel nucleo di spora o cellula vegetativa citoplasma5,6. Il doppio strato lipidico IM è probabilmente in uno stato di gel, anche se c'è una frazione significativa dei lipidi mobile in IM5. IM della spora ha anche il potenziale per un'espansione significativa5. Quindi, l'area della superficie dell'IM aumenta 1.6-fold su germinazione senza sintesi ulteriori della membrana ed è accompagnata dalla perdita di questa membrana caratteristica bassa permeabilità e lipidica immobilità5,6.

Mentre i dettagli molecolari dell'organizzazione dei lipidi IM in spore e l'attivazione delle proteine di germinazione sono argomenti interessanti per lo studio, la piccola dimensione delle spore di Bacillus subtilis e l'abbondanza relativamente basso di proteine di germinazione, rappresentano una sfida per analisi al microscopio. Griffiths et al epifluorescenza microscopio prova coercitiva, utilizzando reporter fluorescenti fuso a proteine di germinazione, suggerisce che nel b. subtilis spore la proteina dell'impalcatura GerD organizza tre subunità GR (A, B e C) di GerA, B e K GRs, in un cluster7. Hanno coniato il termine 'germinosome' per questo cluster di proteine di germinazione e descritto le strutture come ~ 300 nm grande IM proteina fuochi8. All'inizio della germinazione delle spore, fluorescente germinosome i fuochi alla fine trasformarsi in grandi disperdere modelli fluorescente, con > 75% delle popolazioni di spora visualizzano questo modello in spore germinati per 1 h con L-valina8. Si noti che il libro citato sopra usate media immagini da decine di immagini consecutive fluorescente, per guadagnare potere statistico e superare l'ostacolo dei segnali fluorescenti Bassi osservato durante la formazione immagine. Questa visualizzazione di queste strutture in spore batteriche era ai margini di ciò che è tecnicamente fattibile con strumenti microscopici classici e né una valutazione della quantità di fuochi in una singola spora né era loro localizzazione subcellulare più dettagliate possibile con questo approccio.

Qui, dimostriamo che l'uso della microscopia di illuminazione strutturata (SIM) per ottenere una visualizzazione dettagliata e quantificazione di germinosome(s) le spore di Bacillus subtilis, nonché dei loro domini lipidici IM9. Il protocollo contiene anche le istruzioni per la sporulazione, la preparazione del vetrino e l'analisi di immagine di SIMcheck (v 1.0, un plugin di imageJ) così come ImageJ10,11,12.

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Protocollo

1. b. subtillis sporulazione (Timing: 7 giorni prima dell'osservazione microscopica)

  1. 1 ° giorno
    1. Inoculare una coltura batterica su una piastra (tryptone di 1%, 0,5% di Estratto di lievito, 1% NaCl, 1% agar) agar di brodo di Luria-Bertani (LB)13 ed incubare per una notte a 37 ° C per ottenere singole colonie. Utilizzare il ceppo di Bacillus subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry gatto, gerD-gfp kan) e ceppo parentale sfondo PS4150 di b. subtilis (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) come descritto in precedenza7.
      Nota: L'uso di spore con lo sfondo di ΔcotEΔgerE è essenziale nella visualizzazione germinosome, al fine di ridurre al minimo l'autofluorescenza della spora cappotto strati7.
    2. Sterilizzare tutti i media, provette, pipette e altri materiali di cultura per essere utilizzato con metodi appropriati.
  2. 2 ° giorno
    1. Inoculare una colonia singola in 5 mL di terreno LB al mattino presto e incubare la cultura sotto agitazione continua in una provetta con tappo a vite a 200 giri/min e 37 ° C fino a quando raggiunge il OD600 0.3-0.4 (circa 7 h).
    2. Fare 500 mL di terreno di MOPS (pH 7,5) contenente 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1,32 mM K2HPO4, 0,4 mM MgCl2·6H2O, 0,276 mM K2così4, 0,01 mM FeSO4·7H2O, O a 0,14 mM CaCl2·2H2, 80mm MOP, 4mm Tricine, 0,1 mM MnCl2·2H2O, 10 mM D-glucosio-monoidrato e 10mm NH4Cl.
    3. Preparare nel tappo a vite tubi 10-1- 10-7 diluizioni seriali della cultura LB in 5ml MOPS supporto ogni e incubare le colture durante la notte sotto agitazione continua a 200 giri/min e 37 ° C.
      Nota: Le diluizioni seriali preparate qui lo scopo di ottenere una diluizione in fase esponenziale in anticipo la mattina successiva. Questo passaggio e quello successivo sono necessari per consentire alle cellule di adattarsi al mezzo di crescita tampone MOPS.
  3. 3 ° giorno
    1. Selezionare una delle diluizioni MOPS con un OD600 di 0.3-0.4. Inoculare 0,2 mL della cultura al pre-riscaldato (37 ° C) 20 mL di terreno di MOPS in un pallone da 250 mL conica e incubare sotto agitazione continua fino a quando raggiunge il OD600 0.3-0.4 (~ 7 h).
    2. Inoculare il mezzo di base sporulazione MOPS (250 mL) con 1% (v/v) pre-cultura dal passaggio 1.3.1 e incubare per 3 giorni a 37 ° C in un matraccio conico litro sotto agitazione continua. Per FM4-64 la colorazione delle spore PS4150, aggiungere 2 µ g/mL FM4-64 sonda (Vedi Tabella materiali) per la sporulazione medio 1 o 2 h dopo aver raggiunto il picco valore600 OD di crescita vegetativa (generalmente circa 2) e consentire la cultura di successivamente sporulare proteggendo da luce5.
  4. Giorno 7: Raccolta di spore
    1. Determinare il rendimento di sporulazione (cellule vegetative di vs di spore) usando microscopia di contrasto di fase a 100 ingrandimenti per distinguere le spore brillante fase da cellule scure fase e possibilmente non maturo spore. Una resa brillante spora 90% fase è previsto.
    2. A pellet le spore a 4.270 x g per 15 min a 4 ° C in provette per centrifuga fondo tondo. Lavare la pallina di spora 2 - 3 volte con 40 mL di acqua di tipo 1 demineralizzata ultrapura sterile in provette centrifuga a fondo conico da 50 mL (Vedi Tabella materiali). Rallentamento a ogni lavaggio a 4.270 x g per 15 min (4 ° C).
  5. Giorno 7: Purificazione di spore
    1. Purificazione di spore: sospendere il pellet di spora in 750 µ l del 20% non ionici densità gradiente medio (Vedi tabella dei materiali) e caricare su 800 µ l di terreno gradienti di densità non ionici di 50% in microcentrifuga sterilizzato. Centrifuga per 60 min a 21.500 x g. Il pellet ottenuto contiene le spore gratis. Sospendere il pellet di spora in 200 µ l di 20% medio gradiente di densità non ionici e caricare su 1 mL di 50% non ionici densità gradiente medio in un tubo del microcentrifuge e centrifugare per 15 min a 21.500 x g.
    2. La spora finale preparazione e deposito di lavaggio: il pellet ottenuto contiene le spore dormienti purificate. Lavare il pellet di spora 2 - 3 volte con 1,5 mL di sterile ultrapura Type 1 acqua (Vedi Tabella materiali) e spin-down in mezzo a 9.560 x g per 15 min a 4 ° C. Infine, sospendere il pellet in acqua ultrapura sterile di tipo 1 a un finale OD600 di circa 30. Aliquote delle spore possono essere conservate a-80 ° C per 8 settimane14.

2. decoating

  1. Spore di PS4150 di trattare con 0,1 M NaCl 0,1 M NaOH/1% sodio dodecil solfato (SDS) / 0,1 M ditiotreitolo (DTT) a 70 ° C per 1 h. lavare le spore 10 volte con sterilizzato ultra-puro tipo 1 acqua15,16. In questo modo, qualsiasi adsorbito FM4-64 sonda nella membrana esterna di spora e strati esterni verranno rimossi.

3. vetrino coprioggetto e preparazione del vetrino11 (Timing: 1 H prima dell'osservazione)

  1. Vetrini coprioggetto pre-pulito ad alta precisione (Vedi tabella materiali) con 1M HCl per 30 min in un bagno d'acqua agitando delicatamente. Lavare i vetrini coprioggetti due volte in acqua ultra-pura di tipo 1 e memorizzarli in 100% EtOH (vol/vol). Lasciate asciugare e verificare la loro chiarezza prima dell'uso. Pre-pulire il vetro scorre in 70% EtOH. Lasciate asciugare e verificare la loro chiarezza prima dell'uso.

4. il campionamento microsfere fluorescenti o spore nel Frame Gene Slide10 (tempo 15 Min)

  1. Pre-riscaldare due 70% EtOH pulita e aria secca vetrini (Vedi tabella materiali) per alcuni secondi su un blocco di riscaldamento 70 ° C, goccia 65 μL di agarosio al 2% sterilizzata tenuto a 70 ° C sulla cima di un vetrino e adagiarvi l'altro vetrino per diffondere la b di agarosio tra le diapositive. La patch di agarosio asciugherà in circa 5 min.
  2. Tagliare la patch di agarosio in una sezione di 1 x 1cm dopo la rimozione di una delle lastre di vetro, aggiungere 0,4 μL di campione (microsfere fluorescenti o spore di ~ 108/ml) e trasferire la patch sul coprioggetto di alta precisione posizionando il coprioggetto sul patch e facendolo scorrere.
  3. Fissare un Gene Frame (1,5 x 1.6 cm2, 65 µ l) della diapositiva secca, sul quale il coprioggetto è inserito tutti gli angoli del telaio, completando così il vetrino per uso in microscopia di chiusura.

5. imaging11,17(Timing: 1 H)

  1. Catturare le immagini di fluorescenza e di trasmissione delle spore nonché una combinazione di rosso e giallo-verde per volta carbossilato microsfere fluorescenti su un microscopio illuminazione strutturata (Vedi tabella materiali) dotato di un 100 x (obiettivo di olio Apertura numerica = 1.49), un software di analisi di immagine e telecamera CCD (Vedi tabella dei materiali). Generare tutte le immagini a temperatura ambiente senza il disturbo della luce ambientale. Assicurarsi di pulire sempre il 100x obiettivo e lo scivolo con etanolo 75% prima di formazione immagine.
  2. Concentrarsi sulle microsfere fluorescenti di 100 nm (diametro) e ottimizzare la funzione di diffusione del punto (psf) regolando l'anello di correzione sull'obiettivo 100x fino ad ottenuta un psf simmetrico, riducendo così al minimo sfocatura dell'immagine. Il psf è la risposta di impulso o la risposta di un sistema di imaging a sorgente puntiforme o punto all'oggetto.
  3. Selezionare un campo di vista con circa 10 microsfere fluorescenti rotonde. Applicare una grata concentrarsi regolazione per entrambi 561 nm e 488 lunghezze d'onda di eccitazione di nm come la guida per il software di analisi di immagine.
  4. Concentrarsi le spore con la luce di trasmissione e catturare un'immagine di luce di trasmissione in modalità media 16 × con esposizioni di 200 ms per ogni immagine.
  5. Catturare immagini fluorescenti raw 3D-SIM delle spore con la modalità di illuminazione "3D-SIM", le impostazioni della fotocamera per modalità di indicazione elettrone moltiplicando (EM) guadagno 10MHz a 14-bit e guadagno di EM a 175. Eccitare la sonda FM4-64 in spore di PS4150 con la luce di laser 561 nm al 20% di potenza laser e un tempo di illuminazione di 400 ms.
  6. Eccitare la GerKB-mCherry e GerD-GFP in KGB80 spore con, rispettivamente, 561 nm luce laser al potere del laser di 30% per 1 s e 488 nm laser al 60% potenza del laser per 3 s. impostazioni di Z-Stack sono in cima al fondo modalità, 0,2 µm / step, 7 punti e 20 passi per germinosome e Analisi IM, rispettivamente.
    Nota: Questi parametri del laser sono stati applicati al fine di assicurare un valore massimo di luminosità della finestra istogramma di circa 4.000 persone.

6. ricostruire immagini Raw 3D-SIM di FM4-64 macchiato PS4150 spore

  1. Eseguire la ricostruzione di fetta di N-SIM per FM4-64 macchiato dati grezzi PS4150 spore. Fare clic sul pulsante Param per Ricostruire fetta sulla scheda pad N-SIM per aprire la finestra di N-SIM fetta ricostruzione.
  2. Impostare i parametri di ricostruzione nella finestra N-SIM fetta ricostruzione . Per ottenere immagini ricostruite perfetti, seguire il suggerimento delle istruzioni N-SIM e fare clic su controlli appropriati nella finestra N-SIM fetta ricostruzione per impostare il Contrasto di modulazione (IMC) di illuminazione per Auto, alta Soppressione di rumore ad alta risoluzione (HRNS) 1.00 e Fuori Focus Blur soppressione (OFBS) a 0,05 come punti di partenza.
  3. Fare clic sul pulsante Fetta di ricostruire nella finestra Ricostruzione fetta N-SIM per ricostruire l'immagine. Valutare la qualità delle immagini ricostruite dalle immagini trasformato FFT (Fast Fourier) e Punteggio di ricostruzione, che visualizza dopo ricostruzione12.
  4. Regolare il HRNS da 0,10 a 5,00 e OFBS da 0,01 a 0,50 cliccando sui controlli appropriati nella finestra N-SIM fetta ricostruzione fino a quando non si ottengono le migliori impostazioni di parametro.
  5. Fare clic sul pulsante applica nella finestra N-SIM fetta emolienti per applicare i parametri modificati. Fare clic sul pulsante Chiudi per chiudere la finestra.
  6. Rendere un FM4-64 macchiato immagine raw di spore di PS4150 attivo e fare clic sul pulsante di Ricostruire fetta sulla scheda SIM N Pad per eseguire la Ricostruzione di fetta. Salvare l'immagine ricostruita.

7. image Analysis

  1. Convertire le immagini di Pseudo-Widefield della germinosome di KGB80
    1. Convertire immagini in formato raw 3D-SIM di KGB80 in Pseudo-Widefield immagini attivando con un click sinistro il plugin di ImageJ SIMcheck utilità Raw Data SI a Pseudo-Widefield12. Pseudo-Widefield medie immagini dai dati grezzi di SIM e assembla, per confronto, un'immagine equivalente al convenzionale widefield illuminazione12. Per ImageJ stesso vedere https://imagej.net/Welcome. Selezionare casualmente ~ 25 spore in ogni immagine di trasmissione invertito per un'analisi successiva di germinosome nelle immagini Pseudo-Widefield fluorescente.
    2. Selezionare in totale circa 350 (in questo esempio, 346) KGB80 spore in 14 campi di vista da due diapositive. I numeri di fuochi fluorescente GerD-GFP e GerKB-mCherry in selezionati KGB80 spore dovrebbero essere contati in modo indipendente da due ricercatori. Il ricercatore può fare riferimento per le immagini raw di 3D-SIM in caso di dubbio la presenza di fuochi separati germinosome fluorescente in spore.
    3. Valutare le intensità massime di ogni focus GerD-GFP e GerKB-mCherry e l'intensità integrata dell'immagine 3D di ogni spora KGB80 con ImageJ.
  2. Analizzare le immagini di Pseudo-Widefield della germinosome di KGB80
    1. Utilizzare il valore di intensità media integrato di 7 stack come l'intensità di segnale integrato della spora KGB80. Determinare intensità di sfondo da imaging il ceppo di sfondo PS4150 utilizzando impostazioni identiche. Riguardo macchie fluorescenti in singoli KGB80 spore come i fuochi di germinosome quando sono chiaramente distinguibili dallo sfondo.
    2. Applicare il One-way ANOVA-test per la determinazione del significato con software origine 9.0. considerando i valori di P < 0,05 come statisticamente significativo. Utilizzare di rango coefficiente di correlazione di Spearman18 per valutare la correlazione di GerD-GFP e GerKB-mCherry numero di focolai e le misure dell'intensità del segnale integrato.

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Risultati

Il protocollo attuale presenta una procedura di imaging microscopio SIM per le spore batteriche. Le procedure di preparazione di sporulazione e diapositiva sono state effettuate come mostrato nella Figura 1 prima di formazione immagine. Più tardi, sono state applicate le procedure di imaging e l'analisi sia per dim (proteina fluorescente etichettata proteine germinazione) e brillante spora (sonda lipofilica macchiato IM) campioni come indicato nel testo segu...

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Discussione

Il protocollo presentato contiene una procedura di 3D-SIM standard per l'analisi di FM4-64 macchiato di spore di Bacillus subtilis che include la sporulazione, preparazione del vetrino e processi di imaging. Inoltre, il protocollo descrive un SIMcheck modificato (ImageJ)-assistita processo per microscopia SIM di germinosomes di spore di Bacillus subtilis etichettati con reporter fluorescenti di imaging 3D. La procedura di quest'ultima ci ha permesso di osservare questa sottostruttura dim con maggiore co...

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Divulgazioni

Conflitti di interesse non dichiarati.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano Christiaan Zeelenberg per la sua assistenza durante l'imaging di SIM. JW riconosce il Consiglio di borsa di studio di Cina per una borsa di dottorato e grazie Irene Stellingwerf per il suo aiuto durante la fase primaria di imaging.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Air dried glass slidesMenzel Gläser630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 LSigma-AldrichZ567868
Erlenmeyer flasks 250 mLSigma-AldrichZ723088
FluoSpheres carboxylate-modified microspheresInvitrogen, 0.1 μmF8803
FM4-64Thermo Fisher ScientificF34653
Histodenz nonionic density gradient mediumSigma-AldrichD2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD cameraAndor Technologyhttps://imagej.net/Welcome
LB AgarSigma-AldrichL2897
Microfuge tubes 1.5 mLThermo Fisher Scientific3451PK
Microscope imaging softwareNikon, JapanNIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed WaterMilliporeMilli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscope
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mLThermo Fisher Scientific75003800
Precision CoverslipsPaul Marienfeld117650
Round Bottom tubes 15 mLThermo Fisher ScientificNunc TM
Screw cap tubes 50 mLThermo Fisher ScientificNunc TM

Riferimenti

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