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Resumo

Cluster de proteínas do receptor germinant em 'germinosomes' na membrana interna dos esporos de Bacillus subtilis . Descreveremos um protocolo usando proteínas de repórter de microscopia e fluorescente super resolução para visualizar germinosomes. O protocolo também identifica domínios de membrana interna de esporo que preferencialmente são corados com o corante de membrana FM4-64.

Resumo

O pequeno tamanho dos esporos e a relativamente baixa abundância de proteínas de germinação, causar dificuldades em suas análises microscópicas usando microscopia de epifluorescência. Super-resolução tridimensional estruturada iluminação microscopia (3D-SIM) é uma ferramenta promissora para superar este obstáculo e revelar os detalhes moleculares do processo de germinação de esporos de Bacillus subtilis (b. subtilis). Aqui, descrevemos o uso de um SIMcheck modificado (ImageJ)-processo de imagem 3D assistente e proteínas fluorescentes repórter para microscopia SIM de germinosomes dos esporos de b. subtilis , clusters de proteínas de germinação. Apresentamos também um procedimento de imagem 3D-SIM (padrão) para FM4-64 coloração das membranas de esporos de b. subtilis . Usando estes procedimentos, obteve resolução insuperável para a localização de germinosome e mostrar que > 80% de b. subtilis KGB80 esporos dormentes obtidos após esporulação no meio de MOPS mínimo definido têm um ou dois GerD-GFP e GerKB-mCherry focos. Focos luminosos também foram observados em FM4-64 manchado imagens de 3D-SIM dos esporos sugerindo que domínios de lipídios de membrana interna de fluidez diferente provável existirem. Mais estudos que usam dupla rotulagem procedimentos com corantes de membrana e germinosome proteínas repórter para avaliar localização co e, assim, obter uma óptima visão geral da organização das proteínas de germinação de Bacillus na membrana interna dos esporos são possível.

Introdução

Esporos das ordens Bacillales e Clostridiales são metabolicamente inativo e extraordinariamente resistente aos regimes de descontaminação dura, mas a menos que germinam, não podem causar efeitos deletérios em seres humanos1. Em nutriente germinant desencadeada germinação dos esporos de Bacillus subtilis (b. subtilis), o evento de iniciação é germinant ligação a receptores germinant (GRs), localizado na membrana interna do spore (IM). Posteriormente, as GRs transduce sinais à proteína de canal SpoVA também localizado no IM. Isso resulta no início da troca de esporo núcleo piridina-2,6-de ácido dicarboxílico (ácido dipicolínico; DPA; composto por 20% dos esporos núcleo seco wt) para a água através do canal SpoVA. Posteriormente, o lançamento DPA desencadeia a ativação da hidrólise de peptidoglicano do córtex, e absorção de água adicionais segue2,3,4. Esses eventos levam ao estresse mecânico sobre as camadas de revestimento, sua ruptura subsequente, o aparecimento de consequência e, finalmente, crescimento vegetativo. No entanto, os detalhes exatos moleculares do processo de germinação são ainda longe de resolvida.

Uma grande questão sobre a germinação dos esporos diz respeito as propriedades biofísicas dos lipídeos em torno das proteínas de germinação de IM, bem como as proteínas de canal SpoVA IM. Este imóvel em grande parte lipídica IM é a barreira de permeabilidade principal para muitas moléculas pequenas, incluindo preservativos químicos tóxicos, alguns dos quais exercem sua ação no núcleo do esporo ou no citoplasma de células vegetativas5,6. A bicapa lipídica IM é provável que em um estado de gel, embora haja uma fração significativa de lipídios móveis no IM5. IM do esporo também tem o potencial de expansão significativa5. Assim, aumenta a área de superfície do IM 1.6-fold sobre a germinação sem síntese de membrana adicional e é acompanhada pela perda de característico baixa permeabilidade e lipídios imobilidade5,6 de uma membrana.

Enquanto os detalhes moleculares da ativação de proteínas germinação e organização dos lipídios IM em esporos são temas atraentes para estudo, o tamanho pequeno de esporos de b. subtilis e a relativamente baixa abundância de proteínas de germinação, representam um desafio para análises microscópicas. Griffiths et al. evidências de microscópio de epifluorescência convincentes, usando fluorescentes repórteres fundidos às proteínas de germinação, sugere que em esporos de b. subtilis a proteína de andaime GerD organiza três subunidades GR (A, B e C) de GerA, B e K GRs, em um cluster7. Eles cunhou o termo 'germinosome' para este cluster de proteínas germinação e descreveu as estruturas como ~ 300 nm grande IM proteína focos8. Ao iniciar a germinação dos esporos, germinosome fluorescente focos, finalmente, transformar em maior dispersar padrões fluorescentes, com > 75% das populações esporo exibindo este padrão em esporos germinados para 1 h com L-valina8. Observe que o livro mencionado acima usado em média imagens de dezenas de fotos fluorescentes consecutivas, para ganhar poder estatístico e superar o obstáculo da baixos sinais fluorescentes observados durante a imagem latente. Esta visualização destas estruturas em esporos bacterianos foi no limite do que é tecnicamente viável com ferramentas microscópicas clássicas e nem uma avaliação da quantidade de focos em um único esporo nem foi sua localização subcellular mais detalhada possível com esta abordagem.

Aqui, vamos demonstrar o uso de estruturada iluminação microscopia (SIM) para obter uma visualização detalhada e quantificação do germinosome(s) em esporos de b. subtilis, bem como de seus IM lipídico domínios9. O protocolo também contém instruções para a esporulação, slide preparação e análise de imagens por SIMcheck (v 1.0, um plugin do imageJ) bem como ImageJ10,11,12.

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Protocolo

1. b. subtillis esporulação (tempo: 7 dias antes da observação microscópica)

  1. Dia 1
    1. Marcam uma cultura bacteriana em um caldo de Luria-Bertani (LB) ágar placa (triptona 1%, extrato de levedura 0,5%, 1% de NaCl, 1% de ágar)13 e incubar durante uma noite a 37 ° C para obter colônias única. Use o KGB80 de b. subtilis (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry gato, kan de gerD-gfp) tensão e sua estirpe de fundo PS4150 de b. subtilis (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) conforme descrito anteriormente,7.
      Nota: O uso de esporos com o fundo de ΔcotEΔgerE é essencial na visualização de germinosome, a fim de minimizar a autofluorescência do esporo casaco camadas7.
    2. Esterilize todos os meios, tubos, pipetas e outros materiais de cultura a ser usado com métodos apropriados.
  2. Dia 2
    1. Inocular uma colônia única em 5 mL de meio LB de manhã cedo e incubar a cultura sob agitação contínua em um tubo de tampa de rosca a 200 rpm/min e 37 ° C até que o OD600 atinge 0.3-0.4 (aproximadamente 7 h).
    2. Fazer 500 mL do meio de MOPS (pH 7,5) contendo 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0,4 μM H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1,32 mM K2HPO4, 0,4 mM MgCl2·6H2O, 0,276 mM K2então4, Filipa de 0,01 mM4·7H2O, 0,14 mM CaCl2·2H2O, 80mm MOPS, 4mm Tricine, O de22·2H MnCl 0,1 mM, 10 mM D-glicose-mono-hidratado e 10 mM NH4Cl.
    3. Prepare o MOPS médio cada na tampa de rosca tubos 10-1- 10-7 diluições em série da cultura LB em 5 mL e incubar as culturas durante a noite, sob agitação contínua em 200 rpm/min e 37 ° C.
      Nota: As diluições de série preparadas aqui visam obter uma diluição na fase exponencial cedo na manhã seguinte. Esta etapa e o próximo passo são necessárias para permitir que as células para se adaptar ao meio de crescimento no buffer de MOPS.
  3. Dia 3
    1. Selecione uma das diluições MOPS com uma OD600 de 0,3 a 0,4. Inocular 0,2 mL da cultura previamente aquecido (37 ° c) 20 mL de meio de MOPS num balão de Erlenmeyer de 250 mL e incubá-los sob agitação contínua até que o OD600 atinge 0.3-0.4 (~ 7 h).
    2. Inocular o meio de esporulação com base de MOPS (250 mL) com 1% (v/v) pré-cultura da etapa 1.3.1 e incubar durante 3 dias a 37 ° C num balão cónico litro sob agitação contínua. Para FM4-64 coloração de esporos PS4150, adicionar 2 µ g/mL FM4-64 ponta de prova (ver Tabela de materiais) a esporulação média 1 ou 2 h após atingir o pico, o valor de600 OD do crescimento vegetativo (geralmente aproximadamente 2) e permitir que a cultura de posteriormente esporular enquanto protegendo-o de luz5.
  4. Dia 7: Colheita de esporos
    1. Determine o rendimento de esporulação (esporos vs as células vegetativas) usando o microscópio de contraste de fase em ampliação de 100 X para distinguir os esporos brilhante fase de células em fase escura e esporos possivelmente não-maduras. Espera-se um rendimento de esporo brilhante fase de 90%.
    2. Granule os esporos a 4.270 x g durante 15 min a 4 ° C em tubos de centrífuga fundo redondo. Lave o pellet de esporo 2 - 3 vezes com 40 mL de água estéril de tipo 1 desmineralizada ultrapura em tubos de centrifuga conico de 50 mL (ver Tabela de materiais). Desativação da rotação em cada lavagem a 4.270 x g durante 15 min (4 ° C).
  5. Dia 7: Purificação de Spore
    1. Purificação de esporos: suspender o sedimento de esporos em 750 µ l de meio gradiente de densidade não iônico de 20% (ver tabela de materiais) e carregar até 800 µ l de 50% médio gradiente de densidade não iónico em tubos microcentrifuga esterilizado. Centrífuga para 60 min a 21.500 x g. O pellet obtido contém os esporos livre. Suspender o sedimento de esporos em 200 µ l de 20% médio gradiente de densidade não iônico e carregar em 1 mL de 50% médio gradiente de densidade não iónico em um tubo de microcentrifugadora e centrifugar por 15 min a 21.500 x g.
    2. Lavagem final esporo preparação e armazenamento: A pelota obtida contém os esporos dormentes purificados. Lave o pellet de esporo 2 - 3 vezes com 1,5 mL de ultra-pura estéril tipo 1 água (ver Tabela de materiais) e desativação da rotação entre a 9.560 x g durante 15 min a 4 ° C. Finalmente, suspenda o sedimento em água ultra-pura estéril do tipo 1 a um final OD600 de aproximadamente 30. Alíquotas dos esporos podem ser armazenadas a-80 ° C durante 8 semanas14.

2. remoção de camadas

  1. Tratar PS4150 esporos com 0,1 M NaCl/0.1 M NaOH/1% de sódio Dodecil sulfato (SDS) / 0.1 M ditiotreitol (DTT) a 70 ° C, durante 1 h. lavagem os esporos 10 vezes com esterilizado ultra-pura tipo 1 água15,16. Ao fazê-lo, qualquer adsorvido FM4-64 sonda na membrana exterior do spore e camadas externas serão removidas.

3. lamela e preparação de Slide11 (tempo: 1 H antes de observação)

  1. Lamelas previamente limpo de alta precisão (ver tabela de materiais) com 1 M HCl por 30 min em um banho de água agitando suavemente. Lavar as lamínulas duas vezes em água ultra pura do tipo 1 e armazená-los em 100% (vol/vol) EtOH. Deixe-os secar e verifique se a sua clareza antes do uso. Pre-limpar as lâminas de vidro em 70% EtOH. Deixe-os secar e verifique se a sua clareza antes do uso.

4. amostragem microesferas fluorescentes ou esporos no quadro Gene Slide10 (tempo de 15 Min)

  1. Pré-aquecer dois 70% EtOH limpos e corrediças de vidro seco (veja a tabela de materiais) do ar por alguns segundos em um bloco de aquecimento de 70 ° C, soltar 65 μL de esterilizado agarose 2%, mantido a 70 ° C, em cima de um vidro slide e colocar a outra lâmina de vidro em cima para espalhar a agarose b ntre os slides. O patch de agarose vai secar em cerca de 5 min.
  2. Corte o patch de agarose em uma seção de 1 x 1cm depois de remover um das lâminas de vidro, adicionar 0,4 μL da amostra (microesferas fluorescentes ou esporos de ~ 108/mL) e transferir o patch no sentido do lamela de alta precisão, colocando a lamela sobre o patch e deslizando-a fora.
  3. Corrigi um Gene Frame (1.5 x 1.6 cm2, 65 µ l) para o slide secado, no qual a lamela é colocada fechando todos os cantos da moldura, completando assim o slide para uso em microscopia.

5. imagem11,17(tempo: 1 H)

  1. Capturar as imagens de transmissão e fluorescência de esporos, bem como uma mistura de vermelho e verde-amarelo carboxilato-modificado microesferas fluorescentes em um microscópio de iluminação estruturada (ver tabela de materiais) equipado com um 100x (objetiva de óleo Abertura numérica = 1,49), um software de análise de imagem e câmera CCD (veja a tabela de materiais). Gere todas as imagens na temperatura de quarto sem a perturbação da luz ambiente. Certifique-se de limpar sempre a 100 x objetivo e o slide com 75% de etanol antes de imagem.
  2. Focar 100 nm (diâmetro) de microesferas fluorescentes e otimizar a função de ponto de espalhar (psf), ajustando o anel de correção no objectivo 100 x até à obtenção de um psf simétrico, minimizando assim o embaçamento da imagem. O psf é a resposta de impulso ou a resposta de um sistema de imageamento para um objeto de ponto ou ponto de origem.
  3. Selecione um campo de visão, com aproximadamente 10 rodadas microesferas fluorescentes. Aplicar uma grade foco ajuste para ambos 561 nm e 488 comprimentos de onda de excitação de nm como o guia para o software de análise de imagem.
  4. Concentrar os esporos com a luz de transmissão e capturar uma imagem de luz de transmissão no modo médio de 16 × com exposições de 200 ms para cada imagem.
  5. Capture imagens fluorescentes cru de 3D-SIM dos esporos com o modo de iluminação "3D-SIM", as configurações da câmera para o modo de leitura multiplicação de elétron (EM) ganho 10MHz em 14 bits e EM ganho no 175. Excite a sonda FM4-64 PS4150 esporos com 561 nm laser luz em 20% da potência do laser e um tempo de iluminação de 400 ms.
  6. Excitar o GerKB-mCherry e GerD-GFP em KGB80 esporos com, respectivamente, 561 nm laser luz no poder do laser de 30% para 1 s e 488 nm luz laser em 60% poder do laser para s. 3 Z-pilha configurações estão na parte superior para baixo modo, 0,2 µm / etapa, 7 passos e 20 passos para germinosome e Análise IM, respectivamente.
    Nota: Estes parâmetros foram aplicados a fim de garantir um valor de brilho máximo da janela de histograma de cerca de 4.000.

6. reconstruir imagens Raw 3D-SIM de FM4-64 manchado PS4150 esporos

  1. Realize a reconstrução de fatia N-SIM para o FM4-64 manchado dados brutos dos esporos PS4150. Clique no botão Param para Reconstruir a fatia na folha guia N-SIM almofada para abrir a janela de reconstrução de fatia N-SIM.
  2. Defina os parâmetros de reconstrução na janela de Reconstrução de fatia N-SIM . Para obter imagens reconstruídas perfeitas, siga a sugestão das instruções N-SIM e clique sobre os controles apropriados na janela de Reconstrução de fatia N-SIM para definir o Contraste de modulação de iluminação (IMC) para Auto, alta Supressão de ruído de resolução (HRNS) 1.00 e Fora de foco Blur supressão (OFBS) -0,05 como pontos de partida.
  3. Clique no botão Reconstruir fatia na janela de Reconstrução de fatia N-SIM para reconstruir a imagem. Avalie a qualidade das imagens reconstruídas pelas imagens de Fast Fourier transforma (FFT) e escore de reconstrução, que exibem após reconstrução12.
  4. Ajustar o HRNS de 0,10 a 5,00 e OFBS de 0,01 para 0,50 clicando sobre os controles apropriados na janela de Reconstrução de fatia N-SIM , até as melhores configurações de parâmetro são obtidas.
  5. Clique no botão aplicar na janela N-SIM fatia Reconstuction aplicar parâmetros alterados. Clique em fechar para fechar a janela.
  6. Fazer um FM4-64 manchada imagem crua de esporos de PS4150 ativa e clique no botão Reconstruir fatia na folha guia N-SIM Pad para executar a Reconstrução de fatia. Salve a imagem reconstruída.

7. análise de imagens

  1. Converter imagens de Pseudo-Widefield de germinosome a KGB80
    1. Converta imagens raw 3D-SIM de KGB80 em imagens de Pseudo-Widefield ativando com um clique esquerdo o ImageJ plugin SIMcheck utilitário SI de dados Raw para Pseudo-Widefield12. Pseudo-Widefield médias imagens a partir de dados brutos de SIM e monta, para comparação, uma imagem equivalente a widefield convencional iluminação12. Para ImageJ propriamente dito, consulte https://imagej.net/Welcome. Selecione aleatoriamente ~ 25 esporos em cada imagem invertida de transmissão para análise posterior de germinosome nas imagens de Pseudo-Widefield fluorescentes.
    2. Selecione em esporos de KGB80 total de aproximadamente 350 (no exemplo, 346) em 14 campos de visão de dois slides. Os números de focos fluorescentes GerD-GFP e GerKB-mCherry em esporos de KGB80 selecionados devem ser contados independentemente por dois pesquisadores. O pesquisador pode referir-se volta para as imagens raw de 3D-SIM, sempre que em dúvida da presença de focos de germinosome fluorescentes separadas em esporos.
    3. Avalie as intensidades máximas de cada foco de GerD-GFP e GerKB-mCherry e a intensidade integrada de imagem 3D de cada KGB80 do spore com ImageJ.
  2. Analisar imagens de Pseudo-Widefield de germinosome a KGB80
    1. Use o valor de média intensidade integrada de 7 pilhas como a intensidade de sinal integrado do spore da KGB80. Determine intensidades de plano de fundo da imagem latente da estirpe de fundo PS4150 usando configurações idênticas. Consideram pontos fluorescentes individuais KGB80 esporos de focos germinosome quando eles são claramente distinguíveis do fundo.
    2. Aplique One-Way ANOVA-testes para determinação de significância com software 9.0 de origem. Considerando valores P < 0,05 como estatisticamente significativo. Use o coeficiente de correlação de Spearman, o18 para avaliar a correlação do número de focos de GerD-GFP e GerKB-mCherry e as medições da intensidade de sinal integrado.

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Resultados

O protocolo atual apresenta um procedimento de imagem de microscópio SIM por esporos bacterianos. Os procedimentos de preparação de esporulação e slide foram realizados conforme mostrado na Figura 1 antes de imagem. Mais tarde, os procedimentos de imagem e análise foram aplicados tanto para dim (proteína fluorescente etiquetada proteínas germinação) e brilhante esporo (sonda lipofílicos manchado IM) amostras conforme mostrado no texto a seguir.

...

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Discussão

O protocolo apresentado contém um procedimento padrão do 3D-SIM para análise de FM4-64 manchadas de esporos de b. subtilis que inclui esporulação, preparação de slide e processos de imagem. Além disso, o protocolo descreve um SIMcheck modificado (ImageJ)-assistida de processo para microscopia SIM de b. subtilis esporo germinosomes rotulado com fluorescentes repórteres de imagem 3D. O último procedimento nos permitiu observar esta subestrutura ofuscante com contraste aprimorado. Pelo acoplament...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

Os autores agradecer Christiaan Zeelenberg por sua assistência durante a imagem SIM. JW reconhece Conselho de bolsa da China para uma bolsa de doutorado e obrigado Irene Stellingwerf por sua ajuda durante a fase primária da imagem.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Air dried glass slidesMenzel Gläser630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 LSigma-AldrichZ567868
Erlenmeyer flasks 250 mLSigma-AldrichZ723088
FluoSpheres carboxylate-modified microspheresInvitrogen, 0.1 μmF8803
FM4-64Thermo Fisher ScientificF34653
Histodenz nonionic density gradient mediumSigma-AldrichD2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD cameraAndor Technologyhttps://imagej.net/Welcome
LB AgarSigma-AldrichL2897
Microfuge tubes 1.5 mLThermo Fisher Scientific3451PK
Microscope imaging softwareNikon, JapanNIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed WaterMilliporeMilli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscope
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mLThermo Fisher Scientific75003800
Precision CoverslipsPaul Marienfeld117650
Round Bottom tubes 15 mLThermo Fisher ScientificNunc TM
Screw cap tubes 50 mLThermo Fisher ScientificNunc TM

Referências

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