Germinosomes과 새 균의 subtilis 포자에 내부 막의 시각화

요약

'Germinosomes' 새 균의 subtilis 포자의 내부 막에서에 germinant 수용 체 단백질 클러스터. 우리는 슈퍼 해상도 현미경 및 형광 기자 단백질 germinosomes 시각화를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 또한 우선적으로 막 염료 FM4-64와 스테인드 포자 내부 막 도메인을 식별 합니다.

초록

포자의 작은 크기와 발 아 단백질의 상대적으로 낮은 풍부한 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 그들의 미세한 분석에 어려움이 발생할. 슈퍼 해상도 3 차원 구조화 조명 현미경 (3D-SIM)이이 장애물을 극복 하 고 새 균의 subtilis (B. subtilis) 포자의 발 아 과정의 분자 세부 정보를 공개 하는 유망한 도구입니다. 여기, 우리는 수정 된 SIMcheck (ImageJ)를 사용 하 여 설명-보조 3D 이미징 프로세스 및 형광 기자 단백질 B. subtilis 포자 germinosomes, 발 아 단백질의 클러스터의 시뮬레이션입니다. 우리는 또한 FM4-64 B. subtilis 포자 막의 얼룩에 대 한 (표준) 3D 시뮬레이션 이미징 절차를 제시. 이 절차를 사용 하 여 우리는 germinosome 지역화에 대 한 탁월한 해상도 얻을 하 고 표시 > B. subtilis KGB80 정의 된 최소 MOPS 매체에 포자 형성 후 얻은 휴면 포자의 80%는 하나 또는 두 개의 식도 GFP와 GerKB-mCherry 포커스입니다. 밝은 foci에서 관찰된 FM4-64 스테인드 포자 3D 시뮬레이션 이미지 내부 막 지질 도메인 가능성이 다른 유동성의 존재를 제안 했다. 공동 지역화를 평가 하 고 따라서 내부 포자 막에서 균 발 아 단백질의 조직에 대 한 최적의 개요를 얻을을 더블 라벨 막 염료와 germinosome 프로시저 기자 단백질을 사용 하는 연구는 더 가능.

서문

Bacillales 및 Clostridiales의 포자 metabolically 휴면 하 고 가혹한 오염 정권에 매우 저항력이 있지만 그들은 발 아 하지 않는 인간¹해로운 효과 일으킬 수 없습니다. 새 균의 subtilis (B. subtilis) 포자의 영양소 germinant 트리거 발 아, 개시 이벤트는 germinant 수용 체 (GRs) 포자의 내부 막 (IM)에 위치한 germinant 바인딩입니다. 그 후,는 GRs transduce 메신저에 있는 또한 SpoVA 채널 단백질에 신호. 이 포자 코어 피리 딘-2, 6-dicarboxylic 산 (dipicolinic 산; 교류의 결과 DPA; 포자 코어 건조 중량의 20% 함유) SpoVA 채널을 통해 물에 대 한. 그 후, DPA 릴리스 트리거 피 peptidoglycan 가수분해의 활성화 고 추가 물 통풍 관^2,,34. 이러한 이벤트 코트 레이어, 그것의 연속적인 파열, 파생물의 발병에 기계적 스트레스를 리드 하 고, 마지막으로, 식물 성장. 그러나, 발 아 과정의 정확한 분자 세부 정보는 여전히 멀리에서 해결 되었습니다.

포자 발 아에 대 한 주요 질문 임 발 아 단백질 IM SpoVA 채널 단백질 주변의 지질 생물 속성을 염려 한다. 이 크게 움직이지 IM 지질 bilayer 일부는 포자 코어 또는 식물 세포 세포질^5,6에 그들의 활동을 발휘 하는 독성 화학 방부 제, 포함 하는 많은 작은 분자에 대 한 주요 침투성 방 벽 이다. 메신저⁵모바일 지질의 중요 한 일부분 이지만 메신저 지질 bilayer 젤 상태에서 가능성이 높습니다. 포자의 메신저는 또한 중요 한 확장⁵에 대 한 잠재력이 있다. 따라서, 메신저의 표면적 증가 하면 추가 막 합성 없이 발 아 시이 막의 특성 낮은 침투성 및 지질 부동^5,6의 손실에 의해 동반입니다.

B. subtilis 포자의 작은 크기와 발 아 단백질의 상대적으로 낮은 풍부한 도전을 제기 발 아 단백질의 활성화 및 포자에 IM 지질 조직 분자 세부 연구를 위한 매력적인 주제는, 에 현미경 분석입니다. 그리피스 그 외 여러분 epifluorescence 현미경 증거 돋보이는, B. subtilis 포자에 비 계 단백질 식도 3 GR 소 단위 (A, B 및 C) 게 라, B 및 K GRs 구성 제안 형광 기자 발 아 단백질, 융합을 사용 하 여 클러스터⁷에서. 그들은 발 아 단백질의이 클러스터에 대 한 'germinosome' 라는 용어를 만들어낸 고 ~ 300 nm 큰 메신저 단백질 foci⁸구조 설명. 포자 발 아의 시작, 시와 형광 패턴, 분산 foci 궁극적으로 변화에 더 큰 형광 germinosome > 포자에이 패턴을 표시 하는 포자 인구의 75% L valine⁸1 h에 대 한 출 아 했다. Note 사용 위에서 언급 한 종이 이미지 사진의 연속 형광, 통계 전원 낮은 형광 신호 이미징 동안 관찰의 장애물을 극복 하기를 수십에서 평균. 세균성 포자에 이러한 구조의이 시각화 했다 이란 기술적으로 가능한 클래식 미세한 도구와 단일 포자에서 foci의 금액의 두 평가의 가장자리에도 그들의 더 상세한 subcellular 지 방화 했다 이 방법으로 가능 합니다.

여기, 우리 상세한 시각화를 구조화 조명 현미경 (SIM)의 사용 및 B. subtilis, 뿐만 아니라 그들의 IM 지질 도메인⁹의 포자에서 germinosome(s)의 정량화를 보여 줍니다. 프로토콜은 또한 ImageJ^10,,1112뿐만 아니라 포자 형성, 슬라이드 준비와 SIMcheck (v1.0, imageJ 플러그인) 이미지 분석에 대 한 지침을 포함합니다.

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프로토콜

1. B. subtillis 포자 형성 (타이밍: 현미경 관찰 하기 전에 7 일)

1. 주 1
   1. Luria Bertani 국물 (파운드) 한 천 격판덮개 (1 %tryptone, 0.5% 효 모 추출 물, 1 %NaCl, 1 %agar)¹³ 에 세균성 문화를 행진 하 고 단일 식민지를 37 ° C에서 밤새 품 어. B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry 고양이, 게르트 gfp 칸) 긴장을 사용 하 여 그 부모 배경 스트레인 B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) 앞에서 설명한⁷.
      참고: ΔcotEΔgerE 배경으로 포자를 사용 하 여 최소화 포자 외 투 레이어⁷의 autofluorescence germinosome 시각화에 필수적 이다.
   2. 모든 미디어, 튜브, pipets 및 다른 문화 자료 적절 한 방법으로 사용할 수를 소독.
2. 주 2
   1. 이른 아침에에서 단일 식민지 파운드 매체의 5 mL에 접종 하 고 OD₆₀₀ 0.3-0.4 (약 7 h)를 도달할 때까지 200 rpm/min와 37 ° C에서 스크류 캡 튜브에 지속적인 동요에서 문화를 품 어.
   2. MOPS 매체 (pH 7.5)의 500 mL를 만들기 포함 3 nM (NH₄)₆개월₇O₂₄·4H₂O, 0.4 μ M H₃보₃, 30 nM CoCl₂·6H₂O, 10 nM CuSO₄·5H₂O, 10 nM ZnSO₄·7H₂O, 1.32 m K m₂HPO₄, 0.4 m m MgCl₂·6H₂O, 0.276 m K m₂이렇게₄, 0.01 m m FeSO₄·7H₂O, O₂0.14 m m CaCl₂·2H 80 m m MOPS 변경, 4 m m Tricine, 0.1 m m MnCl₂·2H₂O 10 m m D-포도 당-토스, 그리고 10 mM NH₄Cl
   3. 스크류 캡 튜브 10^-1-5 mL에 파운드 문화의 10^-7 직렬 희석에에서 MOPS 매체를 준비 하 고 하룻밤 200 rpm/min와 37 ° C에서 연속 교 아래 문화를 품 어
      참고: 여기 준비 직렬 희석 다음 날 아침에 일찍 지 수 단계에 희석을 목표로 합니다. 이 단계와 다음 단계는 MOPS 버퍼링 된 성장 매체에 맞게 셀 수 있도록 필요.
3. 3 일
   1. 0.3-0.4의 OD₆₀₀ 와 MOPS 희석 중 하나를 선택 합니다. 미리 데워 진 (37 ° c) MOPS 매체의 20 mL 원뿔 250 mL 플라스 크에 문화의 0.2 mL를 접종 하 고 OD₆₀₀ 0.3-0.4 (~ 7 h)를 도달할 때까지 지속적인 동요에서 품 어.
   2. 1% (v/v) 사전 문화 단계의 1.3.1 MOPS 기반으로 포자 형성 매체 (250 mL)을 inoculate 하 고 지속적인 동요에서 원뿔 리터 플라스 크에서 37 ° C에서 3 일 동안 품 어. FM4-64 PS4150 포자의 얼룩, 2 µ g/mL FM4-64 프로브 ( 재료의 표참조) 포자 형성 매체 1 또는 2 h 피크의 식물 성장 (일반적으로 약 2) OD₆₀₀ 값에 도달 하면 추가 허용 하는 문화 이후 빛⁵에서 그것을 보호 하는 동안 sporulate.
4. 제 7 일: 포자의 수확
   1. 100 배 확대에 단계 대조 현미경 검사 법을 사용 하 여 구별 단계 어두운 세포에서 단계 밝은 포자와 포자 가능성이 비 성숙 하 포자 형성 수확량 (포자 vs 식물 세포)를 결정 합니다. 90% 단계 밝은 포자 수확량으로 예상 된다.
   2. 둥근 바닥 원심 분리기 튜브에 4 ° C에서 15 분 동안에 4,270 x g 에서 포자 작은 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 ( 재료의 표참조)에 2-3 회 살 균 매우 순수한 타입 1 광된 물 40 mL와 포자 펠 릿을 세척. 스핀-다운 4,270 x g 15 분 (4 ° C)에서 각 세척에.
5. 제 7 일: 포자 정화
   1. 정화 포자: 포자 펠 릿 20% 비 밀도 그라데이션 매체의 750 µ L에서 일시 중지 ( 재료의 표참조) 소독된 microcentrifuge 튜브에 50% 비 밀도 그라데이션 매체의 800 µ L에 로드. 60 분 21500 x g에서 원심 분리기. 얻은 펠 릿 무료 포자를 포함 합니다. 20% 비 밀도 그라데이션 매체의 200 µ L에서 포자 펠 릿을 일시 중단 하 고 50% 비 밀도 그라데이션 매체는 microcentrifuge와 21500 x g에서 15 분 동안 원심 분리기의 1 mL에 로드 합니다.
   2. 세척 최종 포자 준비 및 저장: 순화 된 휴면 포자 얻은 펠 릿에 포함 되어 있습니다. 워시 2-3 회 살 균 매우 순수한 타입 1의 1.5 mL와 포자 펠 릿 물 ( 재료의 표참조) 및 스핀-다운 사이 9560 x g 4 ° c.에 15 분에서 마지막으로, 대략 30의 최종 세₆₀₀ 살 균 매우 순수한 타입 1 물에 펠 릿을 일시 중단 합니다. 포자의 aliquots 8 주¹⁴-80 ° C에 저장할 수 있습니다.

2. decoating

1. PS4150 포자를 치료와 0.1 m M NaCl/0.1 M NaOH/1% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) / 1 h. 70 ° C에서 0.1 M dithiothreitol (DTT) 세척 소독된 매우 순수한 타입 1 물^15,16와 10 번 포자. 이렇게 함으로써, 어떤 FM4-64 프로브 포자의 외부 막에 흡착 하 고 외부 레이어를 제거 됩니다.

3. Coverslip 및 슬라이드 준비¹¹ (타이밍: 관찰 하기 전에 1 시간)

1. 정리 전 높은 정밀도 coverslips ( 재료의 표참조) 부드럽게 흔들어 물 욕조에 30 분 동안 1 M HCl와. 매우 순수한 타입 1 물에 두 번 coverslips를 세척 하 고 100% (vol/vol) EtOH에에서 저장. 그들은 건조 하 고 사용 하기 전에 그들의 선명도 확인 하자. 70%의 유리 슬라이드를 미리 청소 EtOH. 그들은 건조 하 고 사용 하기 전에 그들의 선명도 확인 하자.

4. 샘플링 형광 스피어 또는 포자 진 프레임에서 슬라이드¹⁰ (15 분 타이밍)

1. 미리 두 70 %EtOH 청소 따뜻한 고 말린된 유리 슬라이드 ( 재료의 표참조) 70 ° C가 열 블록에 몇 초 동안, 한 유리 슬라이드 위에 70 ° C에서 개최 하는 멸 균된 2 %agarose 65 μ 드롭 공기와 agarose b 확산 위에 다른 유리 슬라이드를 배치 etween 슬라이드. Agarose 패치는 약 5 분에 건조 됩니다.
2. 유리 슬라이드 중 하나를 제거한 후 agarose 패치를 1 x 1 cm 섹션에 잘라, 형광 스피어 (~ 10⁸/mL의 포자), 샘플의 0.4 μ를 추가 하 고 패치에 coverslip 배치 하 여 높은 정밀도 coverslip에 패치를 전송 및 떨어져 슬라이딩.
3. 에 coverslip 현미경 검사 법에 사용 하기 위해 슬라이드를 따라서 완료 프레임의 모든 모서리를 닫는 배치는 말린된 슬라이드에 유전자 프레임 (1.5 x 1.6 cm², 65 µ L)를 수정 합니다.

5. 영상^11,17(타이밍: 1 시간)

1. 빨간색의 혼합 뿐만 아니라 포자의 전송 및 형광 이미지를 캡처하고 구조화 조명 현미경에 카복실산 수정 형광 스피어 노란색-녹색 석유 객관적인 (x 100 장착 ( 자료의 표참조) 수 가늠 구멍 = 1.49), CCD 카메라 및 이미지 분석 소프트웨어 ( 재료의 표참조). 주변광의 방해 없이 실 온에서 모든 이미지를 생성 합니다. 항상 객관적이 고 슬라이드 이미징 하기 전에 75% 에탄올 x 100를 청소 있는지 확인 합니다.
2. 100 nm (직경) 형광 스피어에 집중 하 고 대칭 psf 이미지의 최소화 얻을 때까지 100 x 목표의 수정 반지를 조정 하 여 점 퍼짐 기능 (psf)를 최적화. Psf는 임펄스 응답 또는 포인트 소스 또는 지점 개체에 대 한 이미징 시스템의 응답.
3. 약 10 라운드 형광 스피어와 보기의 필드를 선택 합니다. 격자를 적용 초점 모두 561에 대 한 조정 및 이미지 분석 소프트웨어에 대 한 가이드로 488 nm 여기 웨이브 길이.
4. 전송 빛 포자를 집중 하 고 각 이미지에 대 한 200 ms 노출으로 16 × 평균 모드에서 전송 빛 이미지를 캡처.
5. 14-비트, 그리고 175에서 EM 이득에서 조명 모드 "3D-SIM", 판독 모드 전자 멀티 (EM) 이득 10 MHz에 카메라 설정 포자의 3D 시뮬레이션 원시 형광 이미지를 캡처하십시오. 20% 레이저 전력, 561 nm 레이저 빛 PS4150 포자에서 FM4-64 프로브와 400 ms의 조명 시간을 자극 합니다.
6. GerKB-mCherry 자극 및 KGB80에 게르트 GFP 포자와, 각각, 561 nm 레이저 광 레이저 30% 전력 1 s, 및 488 nm 레이저 빛 60 %3 미 Z 스택 설정은 위에서 바닥 모드, 0.2 µ m / 단계, 7 단계 및 germinosome에 대 한 20 단계에 대 한 레이저 출력 및 임 분석, 각각.
   참고: 이러한 레이저 매개 변수는 약 4000의 히스토그램 윈도우의 최대 밝기 값을 보장 하기 위해 적용 되었다.

6. 3D SIM FM4-64 PS4150 포자 스테인드의 Raw 이미지 재구성

1. FM4-64 스테인드 PS4150 포자 원시 데이터에 대 한 N-SIM 슬라이스 재구성을 수행 합니다. N-SIM 슬라이스 개조 창을 열려면 N SIM 패드 탭 시트에 재구성 조각 Param 단추 클릭 합니다.
2. N-SIM 슬라이스 개조 창에서 재건 매개 변수를 설정 합니다. 완벽 한 복원된 이미지를 얻으려면 N SIM 지침의 제안에 따라 하 고 조명 변조 대비 (IMC) 설정 자동, 높은 N-SIM 슬라이스 재건 창에서 적절 한 컨트롤에 클릭 해상도 잡음 억제 (HRNS) 1.00을 시작 지점으로 0.05에 초점 흐림 억제 (OFBS)에서 .
3. 재구성 슬라이스 단추 이미지를 재구성 하 N SIM 슬라이스 개조 창에서 클릭 합니다. 고속 푸리에 변환 (FFT) 이미지 재건¹²후 표시 재건 점수에 의해 재구성 된 이미지의 품질을 평가 합니다.
4. 0.10에서 HRNS 조정 5.00 및 OFBS 0.01에서 0.50 최고의 매개 변수 설정을 얻을 수 있습니다 때까지 N-SIM 슬라이스 개조 창에서 해당 컨트롤을 클릭 하 여.
5. 변경 된 매개 변수를 적용 하려면 N SIM 슬라이스 Reconstuction 창에서 적용 단추를 클릭 합니다. 창을 닫으려면 닫기 단추를 클릭 합니다.
6. FM4-64 PS4150 포자 raw 이미지를 활성 및 N-SIM 패드 탭 시트에 슬라이스 재구성 단추 클릭 스테인드 조각 개조를 실행을 확인 합니다. 복원된 이미지를 저장 합니다.

7. 이미지 분석

1. KGB80 germinosome의 의사 Widefield 이미지 변환
   1. ImageJ 플러그인 의사-Widefield¹² SIMcheck 유틸리티 원시 데이터 시 왼쪽된 클릭으로 활성화 하 여 의사-Widefield 이미지에 3D SIM KGB80의 원시 이미지를 변환 합니다. 의사-Widefield 원시 SIM 데이터에서 이미지를 평균 하 고 비교를 위해, 기존의 widefield 조명¹²에 해당 이미지를 조립. ImageJ 자체에 대 한 https://imagej.net/Welcome를 참조 하십시오. 형광 의사 Widefield 이미지에 나중에 germinosome 분석에 대 한 각 거꾸로 전송 이미지에 25 포자를 임의로 선택 합니다.
   2. 두 개의 슬라이드에서 14 시야에 총 약 350 (이 예에서 346) KGB80 포자에서 선택 합니다. 선택한 KGB80 포자에 게르트 GFP와 GerKB mCherry 형광 foci 숫자는 두 연구원에 의해 독립적으로 세어 져야 한다. 연구원은 포자에 별도 형광 germinosome foci의 존재의 의심에 때마다 3D SIM raw 이미지를 다시 참조할 수 있습니다.
   3. 각 게르트 GFP와 GerKB mCherry 초점의 최대 농도 각 KGB80 포자의 3D 이미지 ImageJ의 통합된 강도 평가 합니다.
2. 의사-Widefield KGB80 germinosome의 이미지 분석
   1. KGB80 포자의 통합된 신호 강도로 7 스택 의미 통합된 강도 값을 사용 합니다. 동일한 설정을 사용 하 여 배경 스트레인 PS4150 이미징 하 여 배경 농도 결정 합니다. 대해 형광 명소 개별 KGB80 포자에 germinosome foci로 그들은 배경에서 명확 하 게 구별 합니다.
   2. 적용 소프트웨어 근원 9.0 중요성 결정에 대 한 단방향 ANOVA 테스트. P 값을 고려 하면 < 0.05 통계적으로 중요 한. Spearman의 순위 상관 계수¹⁸ 를 사용 하 여 식도 GFP와 GerKB mCherry foci 번호의 상관 관계와 통합 된 신호 강도의 측정 평가.

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결과

현재 프로토콜 세균성 포자에 대 한 SIM 현미경 이미징 절차를 제공합니다. 포자 형성 및 슬라이드 준비 절차 이미징 하기 전에 그림 1 에 표시 된 대로 실행 되었다. 이미징 및 분석 절차 적용 후, 모두 (발 아 단백질을 분류 하는 형광 단백질)을 흐리게 하 고 밝은 (닥터지 프로브 IM 스테인드) 포자 샘플 다음 텍스트와 같이.

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토론

제시 하는 프로토콜 FM4-64 스테인드 B. subtilis 포자 포자 형성, 슬라이드 준비와 이미징 프로세스의 분석을 위한 표준 3D-SIM 절차를 포함 합니다. 또한, 프로토콜 설명 수정된 SIMcheck (ImageJ)-3D 이미징 B. subtilis 포자 germinosomes 형광 기자 표시의 SIM 현미경 검사 법에 대 한 프로세스를 지원. 후자의 절차를 사용 하 여 향상 된 콘트라스트와 함께 희미 한이 구조를 관찰할 수 있었습니다. 두 가...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air dried glass slides	Menzel Gläser	630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 L	Sigma-Aldrich	Z567868
Erlenmeyer flasks 250 mL	Sigma-Aldrich	Z723088
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres	Invitrogen, 0.1 μm	F8803
FM4-64	Thermo Fisher Scientific	F34653
Histodenz nonionic density gradient medium	Sigma-Aldrich	D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera	Andor Technology		https://imagej.net/Welcome
LB Agar	Sigma-Aldrich	L2897
Microfuge tubes 1.5 mL	Thermo Fisher Scientific	3451PK
Microscope imaging software	Nikon, Japan	NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water	Millipore	Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscope
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL	Thermo Fisher Scientific	75003800
Precision Coverslips	Paul Marienfeld	117650
Round Bottom tubes 15 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM
Screw cap tubes 50 mL	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM