Visualización de complejos endógenos de mitophagy in Situ en células beta pancreáticas humanas que utilizan el ensayo de ligadura de proximidad

Resumen

Este protocolo describe un método para el análisis cuantitativo de la formación de complejos de proteínas mitophagy específicamente en células beta a partir de muestras de islet humanos primarios. Esta técnica permite así el análisis de la mitopagia a partir de material biológico limitado, que son cruciales en las muestras preciosas de células beta pancreáticas humanas.

Resumen

La mitopagia es una vía de control de calidad mitocondrial esencial, que es crucial para la bioenergética de células beta de islotes pancreáticos para alimentar la liberación de insulina estimulada por la glucosa. La evaluación de la mitopagia es un reto y a menudo requiere reporteros genéticos o múltiples técnicas complementarias que no se utilizan fácilmente en muestras de tejido, como islotes pancreáticos humanos primarios. Aquí demostramos un enfoque robusto para visualizar y cuantificar la formación de complejos de mitopagia endógenos clave en islotes pancreáticos humanos primarios. Utilizando la técnica de ensayo de ligadura de proximidad sensible para detectar la interacción de los reguladores de mitopagia NRDP1 y USP8, somos capaces de cuantificar específicamente la formación de complejos de mitopagia esenciales in situ. Al acoplar este enfoque a la contramancha para el factor de transcripción PDX1, podemos cuantificar los complejos de mitopagia, y los factores que pueden afectar la mitopagia, específicamente dentro de las células beta. La metodología que describimos supera la necesidad de grandes cantidades de extractos celulares necesarios para otros estudios de interacción proteína-proteína, como la inmunoprecipitación (IP) o la espectrometría de masas, y es ideal para muestras de islotes humanos preciosos generalmente no disponibles en cantidades suficientes para estos enfoques. Además, esta metodología evita la necesidad de técnicas de clasificación de flujo para purificar las células beta de una población de isletes heterogéneos para aplicaciones de proteínas aguas abajo. Por lo tanto, describimos un protocolo valioso para la visualización de la mitopagia altamente compatible para su uso en poblaciones celulares heterogéneas y limitadas.

Introducción

Las células beta pancreáticas producen la insulina necesaria para mantener la homeostasis normal de glucosa, y su fracaso resulta en el desarrollo de todas las formas de diabetes. Las células beta conservan una robusta capacidad mitocondrial para generar la energía necesaria para acoplar el metabolismo de la glucosa con la liberación de insulina. Recientemente, se ha hecho evidente que el mantenimiento de la masa mitocondrial funcional es de importancia fundamental para la función óptima de la célula beta^1,2,3. Con el fin de mantener la masa mitocondrial funcional, las células beta dependen de mecanismos de control de calidad para eliminar las mitocondrias disfuncionales, dañadas o envejecidas⁴. Nosotros y otros hemos demostrado previamente que las células beta se basan en una forma especializada de rotación mitocondrial, llamada autofagia mitocondrial (o mitopagy), para mantener el control de calidad mitocondrial tanto en roedores como en islas humanas^{1, 2,5}. Desafortunadamente, sin embargo, no había un método simple para detectar la mitopagia, o los componentes de mitopagia expresados endógenamente, en células beta pancreáticas humanas.

Recientemente hemos demostrado que la regulación ascendente de la mitopagia en células beta se basa en la formación de un complejo proteico que comprende las ligases E3 CLEC16A y NRDP1 y la desubiquitinasa USP8¹. NRDP1 y USP8 han demostrado de forma independiente afectar la mitopagia a través de la acción en el iniciador clave de mitopagy PARKIN^6,7. NRDP1 se dirige a PARKIN para la ubiquitinación y degradación para desactivar la mitopagia^6,y USP8 desubiquitiniza específicamente PARKIN vinculado a K6 para promover su translocación a las mitocondrias⁷. La tecnología de ensayo de ligadura de proximidad (PLA) hasido un avance reciente en el campo de la biología de la interacción proteica 8, permitiendo la visualización de interacciones proteicas endógenas in situ en células individuales, y no está limitada por el escaso material de la muestra. Esta metodología es particularmente tentadora para la biología de células de islotes/beta humanas, debido a la escasa de la disponibilidad de la muestra, junto a la necesidad de comprender los complejos proteicos fisiológicamente relevantes dentro de los tipos de células heterogéneas.

Utilizando el enfoque PLA, somos capaces de observar los complejos de mitopagia endógenos clave en las células beta pancreáticas primarias y las líneas celulares neuronales, y demostrar los efectos de un ambiente diabetogénico en la vía mitophagia¹. En resumen, el objetivo general de este protocolo es analizar complejos específicos de proteína mitopagia en tejidos que carecen de material abundante, o donde los estudios convencionales de interacción proteica no son posibles.

Protocolo

El uso de islotes pancreáticos humanos de donantes no identificados se realiza a través de una exención de la Junta de Revisión Institucional (IRB) y en cumplimiento de la política de irB de la Universidad de Michigan. Los islotes pancreáticos humanos fueron proporcionados por el Programa Integrado de Distribución de Islotes (IIDP, por sus siglas en que se patrocinó por NIH/NIDDK).

1. Preparación de muestras de islet humano

1. Disociación de una sola célula
   1. Muestras de islotes humanos de cultivo (4000–6000 equivalentes de islotes/10 ml medios) durante al menos 1 día a 37 oC en medios de islotes pancreáticos (PIM(S)) complementados con 1 mM de glutamina (PIM(G)), 100 unidades/ml antibiótico-antibiótico, piruvato sódico de 1 mM y 10 % de bovino fetal suero aB humano o suero aB humano.
   2. Utilice un microscopio de luz de disección con un aumento de 3x para contar los islotes humanos individuales del cultivo. Escoja 40 islotes por tratamiento/condición de interés (como glucolipotoxicidad) en tubos de 1,5 ml en medios de islotes.
   3. Islas centrífugas a 400 x g durante 1 min a 10oC a sedimentos.
   4. Las muestras de lavado, mediante una breve inversión de tubos a temperatura ambiente, dos veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato de 1 ml (PBS) que contiene 50 m PR619 (un inhibidor de la deubiquitinasa; para preservar las interacciones proteicas dependientes de la ubiquitina), con centrifugación entre cada lavado a 400 x g durante 1 min a 10oC.
   5. Disociar islotes en células individuales con 125 ml de trippsina al 0,25% que contienen 50 oM PR619 mediante la incubación de tripsina precalentada (37 oC) durante 3 minutos con pellets de islotes. Disperse suavemente los islotes durante este tiempo con un pipeteo suave periódico utilizando una pipeta de 200 ml.
   6. Quench la trippsina con 1 mL calentado (37 oC) de medios PIM(S) que contengan 50 m PR619, luego células sedimentarias centrifugando a 400 x g durante 1 min.
   7. Lavar las células por centrifugación a 400 x g durante 1 min, dos veces, con PBS + 50 m PR619.
   8. Por último, resuspenda las células en PBS de 150 ml que contengan 50 oM PR619.
2. Adherencia y fijación de una sola célula
   1. Después de la resuspensión, gire la solución celular sobre diapositivas de microscopio esmeriladas, cargadas, usando una citocentrífuga a 28 x g durante 10 min.
   2. Después de la citocentrifugación, delinee el área celular con una pluma hidrófoba (ver la Tabla de Materiales)para minimizar los volúmenes de solución de anticuerpos/PLA necesarios. Fijar células con 4% de paraformaldehído en PBS durante 15 min a temperatura ambiente.
      ADVERTENCIA: La PFA es peligrosa y debe manipularse con cuidado.
   3. Para obtener los mejores resultados, realice la tinción/PLA inmediatamente, o dentro de las 24 h. Si es necesario, conservar las muestras en PBS a 4oC hasta la tinción durante no más de 48 h.

2. Inmunohistoquímica

1. Bloqueo
   1. Lave las células dos veces con 1pbS durante 5 minutos a temperatura ambiente.
   2. Bloquear la solución celular, para eliminar la tinción de fondo, con 10% de suero de burro en PBS que contiene 0,3% detergente (ver la Tabla de Materiales)durante 1 h a temperatura ambiente.
2. Tinción
   1. Incubar células con anticuerpos primarios de ratón o conejo contra USP8 (1:250) y NRDP1 (1:250) respectivamente (ver la Tabla de Materiales)diluidas en solución salina tamponada de fosfato con detergente (PBT, ver Tabla de Materiales),a 4oC durante la noche, a detectar la señalización compleja mitophagy a través de PLA.
   2. Coincubar celdas con un marcador específico para la identificación de células beta que no se elevó en el ratón o conejo para no interferir con la señal PLA. En este caso incubar células con PDX1 anticabra (1:500) en PBT. Incubar todos los anticuerpos primarios durante la noche a 4oC, utilizando película de plástico encima de la solución para evitar la evaporación.

3. Ensayo de ligadura de proximidad

1. Sonda pLA y contramancha
   1. Preparar la solución de sonda PLA de acuerdo con las instrucciones del fabricante, es decir, hacer 20 ml de solución de sonda por muestra preparando una concentración final de 1:5 solución de solución de sonda anti-ratón y anticonejo en PBT, e incubando durante 20 minutos en la habitación Temperatura.
   2. Después de la incubación durante la noche, lavar las células dos veces con 1x PBS durante 5 minutos cada una, en un balancín.
   3. Justo antes de la incubación con solución de sonda, añada Cy5 secundario anti-cabra a una concentración final de 1:600 a la solución de sonda (para la detección de PDX1 endógeno). Añadir la solución de la sonda de 20 l a cada condición celular, cubrir suavemente con película de plástico e incubar a 37 oC durante 1 h.
2. Ligadura
   1. Lave las células dos veces, a temperatura ambiente, con el Tampón A (ver la Tabla de Materiales para la receta) durante 5 minutos cada una, en un balancín.
   2. Preparar la solución de ligadura (parte de los reactivos de detección, ver Tabla de materiales)de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para ello, diluir la culata (5x) 1:5 en agua tratada con piricarbonato dietílico (DEPC). Inmediatamente antes de la incubación añadir 0.025 U/ml de ligasa. Añadir solución de ligadura de 20 l a las células. Cubrir con película de plástico e incubar a 37oC durante 30 min.
3. Amplificación
   1. Lave las células dos veces a temperatura ambiente con Tampón A durante 2 minutos cada una.
   2. Realice una solución de amplificación (parte de los reactivos de detección, consulte Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Diluir el tampón de amplificación (5x) 1:5 en agua tratada con DEPC y mantener en la oscuridad hasta su uso. Agregue una dilución 1:80 de la polimerasa (parte de los reactivos de detección, ver Tabla de materiales) a la solución inmediatamente antes de agregar la solución a las células.
   3. Añadir 20 sl de solución de amplificación a las células. Cubrir con película de plástico y colocar en la oscuridad a 37 oC durante entre 1 h 40 min a 2 h para la señal máxima.
4. Preparación para la toma de imágenes
   1. Lave las células dos veces con El tampón B (ver la Tabla de Materiales para la receta) durante 10 minutos a temperatura ambiente, en un balancín.
   2. Finalmente, lave las células una vez en 0.01x Buffer B, durante 2 minutos a temperatura ambiente en un balancín.
   3. Montar muestras añadiendo una gota de medios de montaje que contengan 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) y colocando cuidadosamente un cubreobjetos sobre las muestras utilizando una cuchilla de bisturí para expulsar las burbujas formadas. Selle los cubreobjetos usando esmalte de uñas transparente alrededor de los bordes.
   4. Muestras de imágenes en un microscopio capaz de capturar múltiples planos focales, como un microscopio confocal de escaneo láser, o un microscopio de fluorescencia invertido con capacidades de desconvolución, tomando al menos 9 imágenes de plano focal diferentes.
      1. Capture imágenes con un aumento de 100x, con una altura de pila z de aproximadamente 0,45 mm. Capturar PLA a 550 nm excitación, 570 nm de emisión; contramanchas a 650 nm excitación, 670 nm de emisión; y DAPI a 405 nm excitación, 450 nm de emisión.
   5. Para garantizar que las señales de fondo de la imagen de fluorescencia y la luz perdida se minimicen para el análisis posterior de eventos PLA (especialmente en microscopios de campo ancho), las imágenes de proceso que utilizan un algoritmo de desconvolución bidimensional (vecino más cercano) a través de un algoritmo de desconvolución bidimensional (vecino más cercano) a través de un algoritmo de desconvolución bidimensional (vecino más cercano) a través de un algoritmo de desconvolución bidimensional (vecino más cercano) a través de un algoritmo de desconvolución bidimensional (vecino más cercano) a través de un algoritmo de desconvolución bidimensional (vecino más software de procesamiento de imágenes estándar de su elección.
      NOTA: Para el uso de CellSens de Olympus, Nikon utiliza NIS-Elements, Leica utiliza LAS X, Zeiss – ZEN, Metamorph, MATLAB, Huygens Software, así como varios plugins disponibles a través de Image-J. Para el análisis, el número total de interacciones en todas las pilas z debe analizarse utilizando el software Image-J, asegurando que solo se analicen las celdas positivas Pdx-1 (sección 3.5).
5. Cuantificación de las interacciones de PLA
   1. Abra la aplicación gratuita de software Image-J y abra la imagen PLA. Comience desde la primera imagen PLA enfoco.
   2. Haga clic en la pestaña de la imagen y seleccione ajustary, a continuación, umbral (figura1A). Ajuste el umbral para eliminar toda la señal PLA no específica, tome nota del ajuste del umbral y trate de mantenerlo consistente durante todo el análisis.
   3. Haga clic en la pestaña Process y seleccione binaryy, a continuación, haga binario (Figura1B). Utilice la imagen binaria para medir partículas, haciendo clic en la pestaña "analizar" y presionando analizar partículas (Figura 1C).
   4. Para el análisis, asegúrese de que la configuración es la siguiente: Tamaño - 0–Infinito, Circularidad - 0–1.0, Mostrar - Esquemas, casillas de verificación para Mostrar resultadosy Borrar resultados (Figura 1D). Haga clic en Aceptar. Tome nota del número de partículas analizadas en una hoja de cálculo que denota la muestra y la posición de la pila z.
   5. Repita los pasos 3.5.2–3.5.4 hasta que se hayan analizado todas las pilas z enfocadas de la muestra. Sume el número total de partículas de la muestra en la hoja de cálculo para cuantificar el número total de interacciones.

Resultados

Realizamos experimentos iniciales en la línea de células beta pancreática sin páncreas MIN6 y la línea celular de neuroblastoma SH-SY5Y SH-SY5Y, para optimizar y confirmar tanto la especificidad de los anticuerpos como las interacciones proteicas visualizadas. Las células MIN6 se nivelaron en los labios de las cubiertas a 30.000 células/ml y se dejaron adheridas durante 48 h, las células SH-SY5Y se enchaparon en los labios de las cubiertas a 15.000 células/ml y se dejaron adherid...

Discusión

Aquí describimos un enfoque simple y eficiente para utilizar NRDP1:USP8 PLA en tejidos/células de interés para cuantificar la formación de complejos mitopagia aguas arriba. Anteriormente confirmamos la formación del complejo de mitopagia CLEC16A-NRDP1-USP8 en células beta pancreáticas por varias metodologías, incluyendo experimentos de co-inmunoprecipitación, estudios de interacción sin células, y in vitro, así como basado en células ubiquitinación, y demostró cómo este complejo impulsa el flujo mitopági...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA 1X	Life Technologies	25200-056
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Block solution	Homemade		Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.
Buffer A	Homemade		To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use
Buffer B	Homemade		To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use
Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat	Jackson Labs	705-175-147
Detection Reagents Red	Sigma- Aldrich	DU092008-100RXN	Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.
DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS	Sigma- Aldrich	DU092004-100RXN
DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS	Sigma- Aldrich	DU092002-100RXN
Fetal bovine serum
Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)	Santa Cruz	SC-14664	RRID: AB_2162373
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MIN6 pancreatic cell line	Gift from D. Stoffers		Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.
Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)	Sigma- Aldrich	SAB200527
Pap-pen	Research Products International	195505
Parafilm			Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.
PBT (phosphate buffered saline with triton)	Homemade		To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)
Penicillin-Streptomycin (100X)	Life Technologies	15140-122
Phosphate buffered saline, 10X	Fisher Scientific	BP399-20
PIM(ABS) Human AB serum	Prodo Labs	PIM-ABS001GMP
PIM(G) (glutamine)	Prodo Labs	PIM-G001GMP
PIM(S) media	Prodo Labs	PIM-S001GMP
PR619	Apex Bio	A812
Prolong Gold antifade reagent with DAPI	Life Technologies (Molecular Probes)	P36935
Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)	Bethyl Laboratories	A300-049A	RRID: AB_2181251
SH-SY5Y cells	Gift from L. Satin		Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.
Sodium Pyruvate (100X)	Life Technologies	11360-070
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
Water for RNA work (DEPC water)	Fisher Scientific	BP361-1L