Visualisierung von endogenen Mitophagie-Komplexen in Situ in menschlichen Pankreas-Betazellen unter Verwendung von Proximity Ligation Assay

Zusammenfassung

Dieses Protokoll skizziert eine Methode zur quantitativen Analyse der Mitophagie-Protein-Komplexbildung speziell in Beta-Zellen aus primären menschlichen Ischenproben. Diese Technik ermöglicht somit die Analyse der Mitophagie aus begrenztem biologischem Material, die in wertvollen menschlichen Betazellproben der Bauchspeicheldrüse entscheidend sind.

Zusammenfassung

Mitophagie ist ein wesentlicher mitochondrialer Qualitätskontrollweg, der für die Betazell-Bioenergetik der Pankreas-Islet entscheidend ist, um die Glukose-stimulierte Insulinfreisetzung zu fördern. Die Bewertung der Mitophagie ist eine Herausforderung und erfordert oft genetische Reporter oder mehrere komplementäre Techniken, die nicht leicht in Gewebeproben verwendet werden können, wie z. B. primäre menschliche Pankreasinseln. Hier zeigen wir einen robusten Ansatz zur Visualisierung und Quantifizierung der Bildung von wichtigen endogenen Mitophagiekomplexen in primären menschlichen Pankreasinseln. Mit der empfindlichen Näherungsligations-Assay-Technik zur Erkennung der Wechselwirkung der Mitophagieregler NRDP1 und USP8 sind wir in der Lage, die Bildung wesentlicher Mitophagiekomplexe vor Ort gezielt zu quantifizieren. Durch die Kopplung dieses Ansatzes zur Gegenfärbung des Transkriptionsfaktors PDX1 können wir Mitophagiekomplexe und die Faktoren quantifizieren, die die Mitophagie beeinträchtigen können, insbesondere innerhalb von Betazellen. Die von uns beschriebene Methodik überwindet den Bedarf an großen Mengen zellulärer Extrakte, die für andere Protein-Protein-Interaktionsstudien wie Immunpräzipitation (IP) oder Massenspektrometrie erforderlich sind, und ist ideal für wertvolle menschliche Isletproben, die in der Regel nicht in ausreichenden Mengen für diese Ansätze zur Verfügung. Darüber hinaus entfällt diese Methode die Notwendigkeit von Strömungsssierungstechniken, um Betazellen aus einer heterogenen Isletpopulation für nachgelagerte Proteinanwendungen zu reinigen. So beschreiben wir ein wertvolles Protokoll zur Visualisierung von Mitophagie, die für den Einsatz in heterogenen und begrenzten Zellpopulationen hochkompatibel ist.

Einleitung

Pankreas-Betazellen produzieren das Insulin, das erforderlich ist, um eine normale Glukosehomöostase aufrechtzuerhalten, und ihr Versagen führt zur Entwicklung aller Formen von Diabetes. Beta-Zellen behalten eine robuste mitochondriale Fähigkeit, die Energie zu erzeugen, die erforderlich ist, um den Glukosestoffwechsel mit der Insulinfreisetzung zu koppeln. Kürzlich hat sich gezeigt, dass die Aufrechterhaltung der funktionellen mitochondrialen Masse von zentraler Bedeutung für die optimale Beta-Zellfunktion^1,2,3ist. Um die funktionelle mitochondriale Masse aufrechtzuerhalten, verlassen sich Betazellen auf Qualitätskontrollmechanismen, um dysfunktionale, beschädigte oder alternde Mitochondrien zu entfernen⁴. Wir und andere haben zuvor gezeigt, dass Betazellen auf einer spezialisierten Form des mitochondrialen Umsatzes, genannt mitochondriale Autophagie (oder Mitophagie), beruhen, um die mitochondriale Qualitätskontrolle sowohl bei Nagetieren als auch bei menschlichen Inseln aufrecht zu erhalten^{1, 2,5}. Leider gab es jedoch keine einfache Methode, um Mitophagie oder endogen exprimierte Mitophagiekomponenten in menschlichen Pankreas-Betazellen zu erkennen.

Wir haben vor kurzem gezeigt, dass die vorgelagerte Regulierung der Mitophagie in Betazellen auf der Bildung eines Proteinkomplexes beruht, der die E3-Ligase CLEC16A und NRDP1 und die Deubiquitinase USP8¹umfasst. NRDP1 und USP8 haben unabhängig gezeigt, mitophagie durch Maßnahmen auf den wichtigsten Mitophagie-Initiator PARKIN^6,7beeinflussen. NRDP1 zielt auf PARKIN für Ubiquitination und Abbau, um Mitophagie⁶abzuschalten, und USP8 deubiquitiniert speziell K6-verknüpfte PARKIN, um seine Translokation zu Mitochondrien zu fördern⁷. Die Proximity Ligation Assay (PLA)-Technologie ist seit kurzem ein Fortschritt auf dem Gebiet der Proteininteraktionsbiologie⁸, die die Visualisierung endogener Proteininteraktionen in situ in einzelnen Zellen ermöglicht und nicht durch knappes Probenmaterial begrenzt wird. Diese Methode ist besonders verlockend für die menschliche Islet/Beta-Zellbiologie, aufgrund der geringen Verfügbarkeit von Proben, gekoppelt an die Notwendigkeit, physiologisch relevante Proteinkomplexe innerhalb heterogener Zelltypen zu verstehen.

Mit Dem PLA-Ansatz sind wir in der Lage, wichtige endogene Mitophagie-Komplexe in primären menschlichen Pankreas-Beta-Zellen und neuronalen Zelllinien zu beobachten und die Auswirkungen einer diabetogenen Umgebung auf den Mitophagieweg¹zu demonstrieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das übergeordnete Ziel dieses Protokolls darin besteht, spezifische Mitophagie-Proteinkomplexe in Geweben zu analysieren, die kein reichlichvorhandenes Material haben oder bei denen herkömmliche Protein-Interaktionsstudien nicht möglich sind.

Protokoll

Die Verwendung von nicht identifizierten spenderhumanen Pankreasinseln erfolgt über eine Ausnahmedesweise des Institutional Review Board (IRB) und in Übereinstimmung mit der IRB-Richtlinie der University of Michigan. Menschliche Pankreasinseln wurden vom von NIH/NIDDK gesponserten Integrated Islet Distribution Program (IIDP) bereitgestellt.

1. Humane Insel Probenvorbereitung

1. Einzelzelldissoziation
   1. Kultur menschliche Islet-Proben (4000–6000 Islet-Äquivalente/10 ml Medien) für mindestens 1 Tag bei 37 °C in Pankreas-Islet-Medien (PIM(S)-Medien, ergänzt mit 1 mM Glutamin (PIM(G)), 100 Einheiten/ml Antimykotiktik-Antibiotikum, 1 mM Natriumpyruvat und 10 % fetalem Rinder Serum (FBS) oder menschliches AB-Serum.
   2. Verwenden Sie ein Sezierlichtmikroskop bei 3-facher Vergrößerung, um einzelne menschliche Inselchen aus der Kultur zu zählen. Pick 40 Inselchen pro Behandlung/Bedingung von Interesse (wie Glucolipotoxizität) in 1,5 ml Röhren in Inselmedien.
   3. Zentrifugeninseln bei 400 x g für 1 min bei 10 °C zu Sedimenten.
   4. Waschen Sie Proben, durch kurze Inversion von Röhrchen bei Raumtemperatur, zweimal mit 1 ml Phosphat gepufferter Saline (PBS) mit 50 M PR619 (ein Deubiquitinase-Inhibitor; zur Erhaltung der Ubiquitin-abhängigen Proteinwechselwirkungen), mit Zentrifugation zwischen jeder Wäsche bei 400 x g für 1 min bei 10 °C.
   5. Dissoziieren Sie Inselchen in Einzelzellen mit 125 l von 0,25% Trypsin, die 50 'M PR619 enthalten, indem Sie vorgewärmtes Trypsin (37 °C) für 3 min mit Inselpellets inkubieren. In dieser Zeit werden die Inselchen mit einer 200-L-Pipette sanft verteilt.
   6. Das Trypsin mit 1 ml erwärmtem (37 °C) PIM(S)-Medien, das 50 'M PR619 enthält, dann Sedimentzellen durch Zentrifugieren bei 400 x g für 1 min.
   7. Waschen Sie Zellen durch Zentrifugation bei 400 x g für 1 min, zweimal, mit PBS + 50 m PR619.
   8. Schließlich können Sie Die Zellen in 150 L PBS, die 50 M PR619 enthalten, wieder aussetzen.
2. Einzelzellige Haftung und Fixierung
   1. Nach der Resuspension drehen Sie die Zelllösung mit einer Zytozentrifuge bei 28 x g für 10 min auf gefrostete, aufgeladene Mikroskopdias.
   2. Um die benötigten Antikörper-/PLA-Lösungsvolumina zu minimieren, um nach der Zytozentrifugation den zellulären Bereich mit einem hydrophoben Pen (siehe Materialtabelle)zu skizzieren. Fix Zellen mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min bei Raumtemperatur.
      VORSICHT: PFA ist gefährlich und muss mit Vorsicht behandelt werden.
   3. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, führen Sie färbung/PLA sofort oder innerhalb von 24 h durch. Falls erforderlich, Proben in PBS bei 4 °C bis zur Färbung nicht länger als 48 h lagern.

2. Immunhistochemie

1. Blockieren
   1. Waschen Sie Zellen zweimal mit 1x PBS für 5 min bei Raumtemperatur.
   2. Blockzelllösung, um Hintergrundfärbung zu beseitigen, mit 10% Eselserum in PBS, das 0,3% Reinigungsmittel enthält (siehe Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur.
2. Färbung
   1. Inkubieren Sie Zellen mit primären Maus- oder Kaninchenantikörpern gegen USP8 (1:250) bzw. NRDP1 (1:250) (siehe Materialtabelle), die in Phosphat gepufferter Saline mit Waschmittel (PBT, siehe Materialtabelle)verdünnt sind, bei 4 °C über Nacht Mitophagie-Komplexe Signalisierung über PLA zu erkennen.
   2. Ko-Inkubationszellen mit einem Marker, der speziell für die Betazellidentifikation spezifisch ist und nicht bei Maus oder Kaninchen angehoben wurde, um das PLA-Signal nicht zu stören. In diesem Fall brüten Zellen mit Anti-Ziegen PDX1 (1:500) in PBT. Inkubieren Sie alle primär Antikörper über Nacht bei 4 °C, mit Kunststofffolie auf der Oberseite der Lösung, um Verdunstung zu verhindern.

3. Proximity Ligation Assay

1. PLA-Sonde und Gegenfleck
   1. Bereiten Sie die PLA-Sondenlösung gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, d. h. stellen Sie 20 L Sondenlösung pro Probe her, indem Sie eine Endkonzentration von 1:5-Lösung der Anti-Maus- und Anti-Kaninchen-Sonde-Lösung in PBT vorbereiten und 20 min im Raum brüten. temperatur.
   2. Nach der nächtlichen Inkubation zweimal mit 1x PBS für jeweils 5 min auf einer Wippe waschen.
   3. Kurz vor der Inkubation mit Sondenlösung, fügen Sie Anti-Ziege Cy5 sekundär bei einer Endkonzentration von 1:600 der Sondenlösung hinzu (zum Nachweis von endogenem PDX1). Fügen Sie jeder Zellbedingung eine 20-L-Sondenlösung hinzu, decken Sie sie vorsichtig mit Kunststofffolie ab und brüten bei 37 °C für 1 h.
2. Verbindung
   1. Waschen Sie Zellen zweimal, bei Raumtemperatur, mit Puffer A (siehe Tabelle der Materialien für das Rezept) für jeweils 5 min, auf einer Wippe.
   2. Bereiten Sie ligation Lösung (Teil der Detektionsreagenzien, siehe Tabelle der Materialien) nach Herstelleranweisungen. Dazu verdünnt Ligationsbestand (5x) 1:5 in diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser. Unmittelbar vor der Inkubation 0,025 U/ml Ligase hinzufügen. Fügen Sie den Zellen eine Ligationslösung von 20 L hinzu. Mit Kunststofffolie abdecken und bei 37 °C 30 min inkubieren.
3. erläuterungen
   1. Waschen Sie Zellen zweimal bei Raumtemperatur mit Puffer A für jeweils 2 min.
   2. Erstellen Sie eine Amplifikationslösung (Teil der Nachweisreagenzien, siehe Materialtabelle) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Amplifikationspuffer (5x) 1:5 in DEPC-behandeltem Wasser verdünnen und bis zur Anwendung im Dunkeln halten. Fügen Sie der Lösung unmittelbar vor dem Hinzufügen der Lösung zu den Zellen eine Verdünnung der Polymerase (Teil der Nachweisreagenzien, siehe Materialtabelle) hinzu.
   3. Fügen Sie den Zellen eine Ampl-Verstärkungslösung hinzu. Mit Kunststofffolie abdecken und bei 37 °C für 1 h 40 min bis 2 h für maximales Signal in die Dunkelheit stellen.
4. Vorbereitung auf die Bildgebung
   1. Waschen Sie Zellen zweimal mit Puffer B (siehe Tabelle der Materialien für Rezept) für 10 min bei Raumtemperatur, auf einer Wippe.
   2. Schließlich waschen Zellen einmal in 0.01x Puffer B, für 2 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe.
   3. Montieren Sie Proben, indem Sie einen Tropfen Montagemedien hinzufügen, die 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) enthalten, und legen Sie sorgfältig einen Coverslip über die Proben, indem Sie eine Skalpellklinge verwenden, um die gebildeten Blasen herauszupressen. Versiegeln Sie Abdeckungen mit klarem Nagellack an den Rändern.
   4. Bildproben auf einem Mikroskop, das in der Lage ist, mehrere Fokale-Ebenen zu erfassen, wie z. B. ein konfokales Laserscanning-Mikroskop oder ein invertiertes Fluoreszenzmikroskop mit Dekonvolution-Fähigkeiten, wobei mindestens 9 verschiedene Fokale-Ebenenbilder aufgenommen werden.
      1. Erfassen Sie Bilder mit 100-facher Vergrößerung mit ca. 0,45 mm Z-Stack-Höhe. Erfassen Sie PLA bei 550 nm Anregung, 570 nm Emission; Gegenfleck bei 650 nm Anregung, 670 nm Emission; und DAPI bei 405 nm Anregung, 450 nm Emission.
   5. Um sicherzustellen, dass Fluoreszenzbild-Hintergrundsignale und Streulicht für die nachgelagerte Analyse von PLA-Ereignissen (insbesondere auf Weitfeldmikroskopen) minimiert werden, werden Prozessbilder unter Verwendung eines zweidimensionalen Dekonvolutionalgorithmus (nächster Nachbar) Standard-Bildverarbeitungssoftware der Wahl.
      HINWEIS: Für Olympus verwenden CellSens, Nikon verwenden NIS-Elemente, Leica verwenden LAS X, Zeiss – ZEN, Metamorph, MATLAB, Huygens Software, sowie mehrere Plugins über Image-J verfügbar. Für die Analyse sollte die Gesamtzahl der Interaktionen über alle Z-Stacks mit der Image-J-Software analysiert werden, um sicherzustellen, dass nur Pdx-1-positive Zellen analysiert werden (Abschnitt 3.5).
5. Quantifizierung von PLA-Interaktionen
   1. Öffnen Sie die kostenlose Image-J-Softwareanwendung, und öffnen Sie das PLA-Image. Beginnen Sie mit dem ersten stark fokussierten PLA-Bild.
   2. Klicken Sie auf die Registerkarte Bild, und wählen Sie anpassenaus , dann den Schwellenwert (Abbildung 1A). Passen Sie den Schwellenwert an, um alle nicht spezifischen PLA-Signale zu entfernen, notieren Sie sich die Schwellenwertanpassung und versuchen Sie, sie während der gesamten Analyse konsistent zu halten.
   3. Klicken Sie auf die Registerkarte Prozess, und wählen Sie binäraus, und erstellen Sie dann binäre (Abbildung 1B). Verwenden Sie das binäre Bild, umPartikel zu messen, indem Sie auf die Registerkarte "Analysieren" klicken und analysieren dein Analyseteilchen drücken (Abbildung 1C).
   4. Stellen Sie für die Analyse sicher, dass die Einstellungen wie folgt lauten: Größe = 0 –Unendlichkeit, Zirkularität = 0–1,0, Anzeigen = Umrisse, Kontrollkästchen für Anzeigeergebnisseund Ergebnisse löschen (Abbildung 1D). Klicken Sie auf OK. Beachten Sie die Anzahl der Partikel, die in einer Kalkulationstabelle analysiert wurden, die die Probe angibt, und die Z-Stack-Position.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 3.5.2–3.5.4, bis alle in Fokus-Z-Stacks für die Probe analysiert wurden. Summiert die Gesamtzahl der Partikel für die Probe in der Kalkulationstabelle, um die Gesamtzahl der Wechselwirkungen zu quantifizieren.

Ergebnisse

Wir führten erste Experimente in der MIN6-Pankreas-Beta-Zelllinie und der SH-SY5Y-Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y durch, um sowohl die Spezifität der Antikörper als auch die visualisierten Proteinwechselwirkungen zu optimieren und zu bestätigen. MIN6-Zellen wurden mit 30.000 Zellen/ml auf Deckscheiben plattiert und für 48 h, SH-SY5Y-Zellen auf Abdeckungen mit 15.000 Zellen/ml plattiert und für 24 h haften gelassen. Das PLA-Protokoll wurde dann wie oben gefolgt, beginnend mit Schritt ...

Diskussion

Hier beschreiben wir einen einfachen und effizienten Ansatz zur Verwendung von NRDP1:USP8 PLA in Geweben/Zellen von Interesse, um die Bildung von vorgelagerten Mitophagie-Komplexen zu quantifizieren. Zuvor haben wir die Bildung des Mitophagiekomplexes CLEC16A-NRDP1-USP8 in pankreatischen Betazellen durch verschiedene Methoden bestätigt, darunter Co-Immunpräzipitationsexperimente, zellfreie Interaktionsstudien und in vitro sowie zellbasierte Ubiquitinationstests und demonstrierte, wie dieser Komplex regulierten mitophag...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA 1X	Life Technologies	25200-056
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Block solution	Homemade		Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.
Buffer A	Homemade		To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use
Buffer B	Homemade		To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use
Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat	Jackson Labs	705-175-147
Detection Reagents Red	Sigma- Aldrich	DU092008-100RXN	Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.
DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS	Sigma- Aldrich	DU092004-100RXN
DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS	Sigma- Aldrich	DU092002-100RXN
Fetal bovine serum
Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)	Santa Cruz	SC-14664	RRID: AB_2162373
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MIN6 pancreatic cell line	Gift from D. Stoffers		Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.
Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)	Sigma- Aldrich	SAB200527
Pap-pen	Research Products International	195505
Parafilm			Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.
PBT (phosphate buffered saline with triton)	Homemade		To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)
Penicillin-Streptomycin (100X)	Life Technologies	15140-122
Phosphate buffered saline, 10X	Fisher Scientific	BP399-20
PIM(ABS) Human AB serum	Prodo Labs	PIM-ABS001GMP
PIM(G) (glutamine)	Prodo Labs	PIM-G001GMP
PIM(S) media	Prodo Labs	PIM-S001GMP
PR619	Apex Bio	A812
Prolong Gold antifade reagent with DAPI	Life Technologies (Molecular Probes)	P36935
Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)	Bethyl Laboratories	A300-049A	RRID: AB_2181251
SH-SY5Y cells	Gift from L. Satin		Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.
Sodium Pyruvate (100X)	Life Technologies	11360-070
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
Water for RNA work (DEPC water)	Fisher Scientific	BP361-1L