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要約

このプロトコルは、一次ヒト化物試料からベータ細胞に特異的にミトファジータンパク質複合体形成の定量分析のための方法を概説する。この技術により、貴重なヒト膵臓ベータ細胞サンプルにおいて重要な限られた生物材料からのミトファジーの分析が可能になります。

要約

ミトファジーは、膵島のβ細胞バイオエネルギッシュがグルコース刺激インスリン放出を燃料にする上で重要なミトコンドリア品質管理経路である。ミトファジーの評価は困難であり、多くの場合、一次ヒト膵島などの組織サンプルでは容易に利用できない遺伝的レポーターまたは複数の相補的な技術を必要とする。ここでは、一次ヒト膵島における主要な内因性ミトファジー複合体の形成を可視化し、定量化するための堅牢なアプローチを示す。ミトファジーレギュレータNRDP1とUSP8の相互作用を検出する敏感な近接ライゲーションアッセイ技術を利用して、その中で不可欠なミトファジー複合体の形成を具体的に定量することができる。転写因子PDX1のアンチステインに対するこのアプローチを結合することにより、ミトファジー複合体と、特にベータ細胞内でミトファジーを損なう可能性のある因子を定量化することができます。我々が説明する方法論は、免疫沈殿(IP)または質量分析のような他のタンパク質相互作用研究に必要な大量の細胞抽出物の必要性を克服し、一般的に貴重なヒトのイストリーサンプルにとって理想的ではないこれらのアプローチのために十分な量で利用できる。さらに、この方法論は、下流タンパク質アプリケーションのための不均一なイストリール集団からベータ細胞を精製するためのフローソート技術の必要性を妨げる。したがって、異種および限られた細胞集団での使用に対して高い互換性を持つミトファジーの可視化のための貴重なプロトコルを説明する。

概要

膵臓ベータ細胞は、正常なグルコース恒常性を維持するために必要なインスリンを産生し、その失敗は糖尿病のすべての形態の発症をもたらす。ベータ細胞は、グルコース代謝とインスリン放出を結合するために必要なエネルギーを生成するために堅牢なミトコンドリア容量を保持します。近年,ミトコンドリア質量の維持が最適なβ細胞機能1,2,3にとって極めて重要であることが明らかになった。機能的なミトコンドリア質量を維持するために、ベータ細胞は、機能不全、損傷、または老化ミトコンドリア4を除去するために品質管理メカニズムに依存しています。私たちや他の人は、ベータ細胞がげっ歯類とヒトの島の両方でミトコンドリア品質管理を維持するために、ミトコンドリアオートファジー(またはミトファジー)と呼ばれるミトコンドリアターンオーバーの特殊な形態に依存していることを以前に実証しました。2,5.しかし、残念ながら、ヒト膵臓ベータ細胞では、ミトファジー、または内因性発現ミトファジー成分を検出する簡単な方法はありませんでした。

我々は最近、ベータ細胞におけるミトファジーの上流調節が、E3リガスCLEC16AおよびNRDP1およびデュビキチナーゼUSP81を含むタンパク質複合体の形成に依存することを示した。NRDP1およびUSP8は、主要なミトファジーイニシエーターPARKIN6,7に対する作用を通じてミトファジーに影響を与えるために独立して示されている。NRDP1は、ミトファジー6をオフに切り替えるためにユビキチン化と劣化のためのPARKINをターゲットとし、USP8は特にミトコンドリア7への転座を促進するためにK6リンクされたPARKINをデュビキチンテートします。近接ライゲーションアッセイ(PLA)技術は、タンパク質相互作用生物学8の分野における最近の進歩であり、単一細胞における内因性タンパク質相互作用の可視化を可能にし、かつ希少なサンプル材料によって制限されない。この方法論は、特にヒトの膵物/β細胞生物学にとって魅力的であり、サンプルの入手可能性が非常に小さいため、異種細胞型内の生理学的に関連するタンパク質複合体を理解する必要性と相まって、

PLAアプローチを用いて、原発性ヒト膵臓ベータ細胞および神経細胞株における主要な内因性ミトファジー複合体を観察し、ミトファジー経路1に対する糖尿病性環境の影響を実証することができる。要約すると、このプロトコルの包括的な目標は、豊富な材料を欠いている組織における特定のミトファジータンパク質複合体を分析すること、または従来のタンパク質相互作用研究が不可能な場合です。

プロトコル

非同定ドナーヒト膵島の使用は、機関審査委員会(IRB)の免除を介して、ミシガン大学IRBポリシーに準拠しています。ヒト膵島は、NIH/NIDDK主催の統合島分布プログラム(IIDP)によって提供された。

1. ヒトのイレットサンプル調製

  1. 単一細胞解離
    1. 培養ヒト島試料(4000~6000個相当/10mL培地)膵島培地(PIM(S))で少なくとも1日、1mMグルタミン(PIM(G))、100単位/mL抗mycocoチック系抗生物質、1mMmM膜ピルビン酸、10%のヒトピクルビン酸菌を含む培養物である。血清(FBS)またはヒトAB血清。
    2. 3倍の倍率で解剖光顕微鏡を使用して、個々のヒトの島を培養から数えます。対象の治療/状態(グルコリポ毒性など)ごとに40の島を、島媒体の1.5 mLチューブに選びます。
    3. 遠心分離島は400 x gで、10°Cで1分間堆積物にする。
    4. 洗浄サンプルは、室温でチューブの短い反転によって、50 μM PR619(デュビキチナーゼ阻害剤;ユビキチン依存性タンパク質相互作用を維持するために)を含む1mLリン酸緩衝生理食べ物(PBS)を2回、各洗浄の間の遠心分離を400で行う。10°Cで1分間x g。
    5. 50 μM PR619を含む125μLの125μLを有する単一細胞に解離し、3分間、予備温めたトリプシン(37°C)をインキュベートして、島ペレットで分けた。この期間中に島を200 μLピペットを使用して定期的に穏やかなピペットで穏やかに分散させます。
    6. 50 μM PR619を含む1mL(37°C)PIM(S)培温でトリプシンをクエンチし、次いで1分間400xgで遠心分離して堆積細胞を入れ子にする。
    7. 遠心分離で細胞を1分間、2回、PBS + 50 μM PR619で洗浄します。
    8. 最後に、50 μM PR619を含む150 μL PBSで細胞を再中断する。
  2. 単一細胞の付着と固定
    1. 再懸濁後、細胞溶液をフロスト、帯電、顕微鏡スライドに回し、28 x gのサイトセントリファッジを10分間使用します。
    2. サイトセントリファゲーションに続いて、必要な抗体/PLA溶液量を最小限に抑えるために、疎水性ペン(材料の表を参照)で細胞領域の概要を説明します。室温で15分間PBSに4%パラホルムアルデヒドを含む細胞を固定します。
      注意:PFAは危険であり、注意して取り扱う必要があります。
    3. 最良の結果を得るには、直ちに、または24時間以内に染色/PLAを行います。必要に応じて、48時間を超える染色までPBSでサンプルを4°Cで保存してください。

2. 免疫組織化学

  1. ブロック
    1. 室温で5分間1x PBSで細胞を2回洗います。
    2. ブロック細胞溶液は、バックグラウンド染色を排除し、0.3%の洗剤を含むPBS中の10%ロバ血清(材料の表を参照)を室温で1時間使用する。
  2. 染色
    1. USP8(1:250)およびNRDP1(1:250)に対する一次マウスまたはウサギ抗体を用いて細胞をインキュベート(材料の表を参照)、リン酸緩衝生理食液で希釈(PBT、材料の表を参照)、一晩で4°Cで、PLAを介してミトファジー複合シグナリングを検出します。
    2. PLA信号を妨げないように、マウスまたはウサギで発生しなかったβ細胞同定に特異的なマーカーを用いて細胞を共インキュベートする。この場合、PBTで抗ヤギPDX1(1:500)で細胞をインキュベートする。すべての一次抗体を4°Cで一晩インキュベートし、溶液の上にプラスチックフィルムを使用して蒸発を防ぎます。

3. 近接ライゲーションアッセイ

  1. PLAプローブとカウンターステイン
    1. 製造業者の指示に従ってPLAプローブ溶液を準備し、すなわち、PBTで抗マウスおよび抗ウサギプローブ溶液の最終濃度1:5溶液を調製し、部屋で20分間インキュベートすることにより、サンプルあたり20μLのプローブ溶液を作る温度。
    2. 一晩インキュベーションした後、ロッカー上でそれぞれ5分間1x PBSで細胞を2回洗浄する。
    3. プローブ溶液を用いたインキュベーションの直前に、プローブ溶液に最終濃度1:600で抗ヤギCy5二次を加加える(内因性PDX1の検出用)。各細胞条件に20 μLプローブ溶液を加え、プラスチックフィルムで穏やかに覆い、37°Cで1時間インキュベートします。
  2. 結紮
    1. 室温で細胞を2回洗い、バッファーA(レシピの材料表を参照)をロッカー上でそれぞれ5分間洗います。
    2. ライゲーション溶液(検出試薬の一部、材料の表を参照)をメーカーの指示に従って準備します。このため、ジエチルパイロカーボネート(DEPC)処理水中の希釈ライゲーションストック(5x)1:5。インキュベーション直前に0.025 U/mLリゲスを追加します。細胞に20 μLライゲーション溶液を添加します。プラスチックフィルムで覆い、37°Cで30分間インキュベートします。
  3. 増幅
    1. 室温で細胞を2回バッファーAで2分間洗う。
    2. 製造元の指示に従って増幅液(検出試薬の一部、材料の表を参照)を作成します。DEPC処理水中の希釈増幅バッファー(5x)1:5を使用するまで暗く保管します。ポリメラーゼの1:80希釈(検出試薬の一部、材料の表を参照)を細胞に溶液を追加する直前に溶液に追加します。
    3. 細胞に20 μLの増幅液を加えます。プラスチックフィルムで覆い、最大信号のために1時間40分から2時間の間に37 °Cで暗闇の中に置きます。
  4. イメージングの準備
    1. ロッカーで室温で10分間、バッファーB(レシピの材料表を参照)で細胞を2回洗います。
    2. 最後に、0.01xバッファBに1回、ロッカーの室温で2分間細胞を洗浄します。
    3. 4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)を含む取り付けメディアのドロップを追加し、メスブレードを使用してサンプルの上に慎重にカバースリップを配置して、形成された気泡を押し出すことによってサンプルをマウントします。シールは、エッジの周りに明確なマニキュアを使用してスリップをカバーします。
    4. レーザー走査共焦点顕微鏡や逆畳み込み機能を備えた反転蛍光顕微鏡など、複数の焦点面を捕捉できる顕微鏡上の画像サンプルは、少なくとも9種類の焦点面画像を撮影します。
      1. 約0.45mm zスタック高さで、100倍の倍率で画像をキャプチャします。550 nm励起、570 nm放出でPLAをキャプチャします。650 nm励起、670 nm放出でのカウンターステイン;405 nm励起、450 nm放出でDAPI。
    5. PLA事象(特に広視野顕微鏡)の下流解析のために蛍光画像の背景信号と迷光を最小限に抑えるために、2次元の破壊(最も近い隣人)アルゴリズムを使用して画像を処理します。選択の標準的なイメージ処理ソフトウェア。
      注:オリンパスはCellSensを使用し、ニコンはNIS-エレメントを使用し、ライカはLAS X、ツァイスを使用します – ZEN、メタモルフ、MATLAB、ホイヘンスソフトウェアだけでなく、Image-Jを介して利用可能ないくつかのプラグイン。解析では、すべてのZスタック上の相互作用の総数をImage-Jソフトウェアを使用して分析し、Pdx-1陽性細胞のみが分析されるようにする必要があります(セクション3.5)。
  5. PLA相互作用の定量化
    1. 無料の Image-J ソフトウェア アプリケーションを開き、PLA イメージを開きます。最初のシャープに焦点を合わせ始める PLA イメージから開始します。
    2. [画像]タブをクリックし、[調整] を選択し、しきい値を選択します (図 1A)。 しきい値を調整して、すべての非特異的 PLA 信号を削除し、しきい値の調整をメモし、分析中に一貫性を保つようにします。
    3. プロセスタブをクリックし、バイナリを選択し、バイナリを作成します (図 1B)。バイナリ画像を使用して、[分析]タブをクリックし、パーティクルの分析を押し続けることで、パーティクルを測定します (図 1C)。
    4. 解析では、設定が次のようになります:サイズ= 0 - 無限大、円形= 0 ~1.0、[アウトラインの表示]、[結果の表示] チェック ボックス、および[結果のクリア] (図 1D)を確認します。[OK]をクリックします。サンプルを示すスプレッドシートで分析されたパーティクルの数と Z スタックの位置をメモします。
    5. サンプルのすべてのインフォーカス Z スタックが分析されるまで、手順 3.5.2 ~ 3.5.4 を繰り返します。スプレッドシート内のサンプルのパーティクルの合計数を合計して、インタラクションの総数を定量化します。

結果

MIN6膵β細胞株とSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞株SH-SY5Yで初期実験を行い、抗体の特異性と可視化されたタンパク質相互作用の両方を最適化・確認しました。MIN6細胞を30,000細胞/mLでカバースリップにめっきし、48時間、SH-SY5Y細胞を15,000細胞/mLでカバースリップ上にめっきし、24時間付着させた。PLA プロトコルは、ステップ 1.2.3 から始まり、上記のように続きました。PLAシグナ...

ディスカッション

ここでは、上流のミトファジー複合体の形成を定量化するために目的の組織/細胞でNRDP1:USP8 PLAを使用するための簡単で効率的なアプローチについて説明する。我々は以前に、共免疫沈殿実験、無細胞相互作用研究、インビトロおよび細胞ベースを含むいくつかの方法論によって、膵臓ベータ細胞におけるCLEC16A-NRDP1-USP8ミトファジー複合体の形成を確認した。ユビキチン化アッセイは、この複?...

開示事項

著者は何も開示していない。

謝辞

著者らは、JDRF(CDA-2016-189およびSRA-2018-539)、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所、国立衛生研究所(R01-DK-108921)、ブレム家、およびアンソニー家からの資金援助を認めている。S.A.S.へのJDRFキャリア開発賞は、ノボ・ノルディスク財団が支援するデンマーク糖尿病アカデミーの支援を受けています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTA 1XLife Technologies25200-056
Antibiotic-AntimycoticLife Technologies15240-062
Block solutionHomemadeUse 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.
Buffer AHomemadeTo make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use
Buffer BHomemadeTo make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use
Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goatJackson Labs705-175-147
Detection Reagents RedSigma- AldrichDU092008-100RXNKit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.
DuoLink PLA probe anti-mouse MINUSSigma- AldrichDU092004-100RXN
DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUSSigma- AldrichDU092002-100RXN
Fetal bovine serum
Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)Santa CruzSC-14664RRID: AB_2162373
HEPES (1M)Life Technologies15630-080
MIN6 pancreatic cell lineGift from D. StoffersMouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.
Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)Sigma- AldrichSAB200527
Pap-penResearch Products International195505
ParafilmUse to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.
PBT (phosphate buffered saline with triton)HomemadeTo make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)
Penicillin-Streptomycin (100X)Life Technologies15140-122
Phosphate buffered saline, 10XFisher ScientificBP399-20
PIM(ABS) Human AB serumProdo LabsPIM-ABS001GMP
PIM(G) (glutamine)Prodo LabsPIM-G001GMP
PIM(S) mediaProdo LabsPIM-S001GMP
PR619Apex BioA812
Prolong Gold antifade reagent with DAPILife Technologies (Molecular Probes)P36935
Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)Bethyl LaboratoriesA300-049ARRID: AB_2181251
SH-SY5Y cellsGift from L. SatinHuman neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.
Sodium Pyruvate (100X)Life Technologies11360-070
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
Water for RNA work (DEPC water)Fisher ScientificBP361-1L

参考文献

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