근접 결찰 분석분석서를 활용한 인간 췌장 베타 세포에서 내인성 미토파기 복합체의 시각화

요약

이 프로토콜은 1차 인간 아일렛 샘플로부터의 베타 세포에서 특히 미토파지 단백질 복합체 형성의 정량적 분석을 위한 방법을 간략하게 설명한다. 이 기술은 이렇게 귀중한 인간 췌장 베타 세포 견본에서 결정적인 한정된 생물학 물자에서 mitophagy의 분석을 허용합니다.

초록

미토파지는 필수 미토콘드리아 품질 관리 경로로, 췌도 베타 세포 바이오에너지가 포도당 자극 인슐린 방출에 연료를 공급하는 데 매우 중요합니다. mitophagy의 평가는 도전적이고 수시로 1 차적인 인간 췌장 섬과 같은 조직 견본에서 쉽게 이용되지 않는 유전 기자 또는 다중 상보적인 기술을 요구합니다. 여기에서 우리는 1 차적인 인간 적인 췌도에 있는 중요한 내인성 mitophagy 복합물의 대형을 구상하고 정량화하는 강력한 접근을 보여줍니다. 미토파지 조절제 NRDP1 및 USP8의 상호작용을 검출하기 위해 민감한 근접 결찰 분석 기술을 활용하여, 우리는 특히 그(것)들에서 필수적인 미토파지 복합체의 형성을 정량화할 수 있습니다. 전사 인자 PDX1에 대한 역착에 대한 이 접근법을 결합함으로써, 우리는 미토파지 복합체, 특히 베타 세포 내에서 미토파지를 손상시킬 수 있는 요인을 정량화할 수 있다. 우리가 설명하는 방법론은 면역 침전 (IP) 또는 질량 분광법과 같은 다른 단백질 상호 작용 연구에 필요한 다량의 세포 추출물의 필요성을 극복하고 일반적으로 귀중한 인간 췌도 샘플에 이상적입니다. 이러한 접근 방식에 충분한 수량으로 사용할 수 있습니다. 또한, 이 방법론은 다운스트림 단백질 응용을 위한 이기종 아일렛 집단으로부터 베타 세포를 정화하는 유동 선별 기술의 필요성을 제거합니다. 따라서, 우리는 이기종 및 제한된 세포 집단에서 사용하기 위해 매우 호환되는 미토파기의 시각화를 위한 귀중한 프로토콜을 기술한다.

서문

췌장 베타 세포는 정상적인 포도당 항상성을 유지하는 데 필요한 인슐린을 생성하고, 그들의 실패는 모든 형태의 당뇨병의 발달을 초래한다. 베타 세포는 인슐린 방출과 포도당 대사를 결합하는 데 필요한 에너지를 생성하는 강력한 미토콘드리아 용량을 유지합니다. 최근에는 기능성 미토콘드리아 질량의 유지가 최적의 베타 세포 기능^1,2,^3에중추적인 중요성이 있음이 명백해지고 있다. 기능성 미토콘드리아 질량을 유지하기 위해 베타 세포는 기능 장애, 손상 또는 노화 미토콘드리아^4를제거하기 위해 품질 관리 메커니즘에 의존합니다. 우리와 다른 사람들은 이전에 베타 세포가 설치류와 인간 섬 모두에서 미토콘드리아 품질 관리를 유지하기 위해 미토콘드리아 자가 포식 (또는 미토파지)이라고 불리는 미토콘드리아 회전율의 특수 한 형태에 의존한다는 것을 입증했습니다^{1. 2,5}. 불행하게도, 그러나, 인간 췌장 베타 세포에서, mitophagy, 또는 내인성 발현 된 미토파지 성분을 검출하는 간단한 방법이 없었다.

우리는 최근 베타 세포에서 미토파지의 상류 조절이 E3 리가제 CLEC16A 및 NRDP1 및 듀비퀴티나아제 USP81을 포함하는 단백질 복합체의 형성에 의존한다는 것을 보여주었다. NRDP1과 USP8은 키 미토파지 이니시에이터 PARKIN^6,7에대한 조치를 통해 미토파지에 영향을 미치는 것으로 독립적으로 나타났다. NRDP1은 미토파지 6을 끄기 위해 유비퀴틴화및 분해를 위한 PARKIN을 목표로 하고, USP8은 특히 K6-연결된 PARKIN을 미토콘드리아^7로전좌화하기 위해 타겟팅합니다. 근접 결찰 분석(PLA) 기술은 단백질 상호작용 생물학^분야에서최근 진보되어 왔으며, 단일 세포에서 현장내 내인성 단백질 상호작용의 시각화를 가능하게 하고, 부족한 샘플 물질에 의해 제한되지 않는다. 이 방법론은 특히 인간 췌도/베타 세포 생물학에 대해 특히 유혹적이며, 표본 가용성의 희소성으로 인해 이기종 세포 유형 내에서 생리학적으로 관련된 단백질 복합체를 이해해야 할 필요성과 결합됩니다.

PLA 접근법을 활용하여, 우리는 1차 인간 췌장 베타 세포 및 뉴런 세포주에서 주요 내인성 미토파지 복합체를 관찰할 수 있으며, 미토파지 경로^1에대한 당뇨병 환경의 효과를 입증할 수 있다. 요약하자면, 이 프로토콜의 가장 중요한 목표는 풍부한 물질이 부족한 조직또는 기존의 단백질 상호작용 연구가 불가능한 조직에서 특정 미토파지 단백질 복합체를 분석하는 것입니다.

프로토콜

비식별 기증자 인간 췌도의 사용은 기관 검토 위원회 (IRB) 면제를 통해 미시간 대학 IRB 정책을 준수합니다. 인간 췌도는 NIH/NIDDK가 후원하는 통합 섬 분배 프로그램(IIDP)에 의해 제공되었습니다.

1. 인간 아일렛 샘플 준비

1. 단세포 해리
   1. 배양 인간 아일렛 샘플(4000-6000 췌도 등가물/10 mL 배지)은 췌도 에서 37°C에서 적어도 1일 동안 1mMM글루타민(PIM(G)) 및 100 단위/mL 항미내 항생제, 1 mM나트륨 피바테 및 1mM나트륨 피바테로 보충된 배지(PIM(S))에서 혈청 (FBS) 또는 인간 AB 세럼.
   2. 배양된 개별 적인 인간 섬을 계산하기 위하여 3배 배율에 해부 광 현미경을 이용하십시오. 아일렛 매체의 1.5 mL 튜브에 관심 치료 /관심 상태 당 40 개의 섬을 선택하십시오.
   3. 400 x g의 원심분리기 는 10 °C에서 퇴적물까지 1 분 동안.
   4. 50 μM PR619 (듀비퀴티나아제 억제제; 유비퀴틴 의존단백질 상호 작용을 보존하기 위해)를 함유한 1mL 인산완충식염수(PBS)로 2회, 실온에서 튜브를 간략하게 반전시킴으로써, 각 세척시 400에서 원심분리를 사용하여 시료를 세척합니다. 10 °C에서 1 분 동안 x g.
   5. 50 μM PR619를 함유하는 트립신 을 함유하는 125 μL의 125 μL로 단일 세포로 디스콘을 해리하여 미리 온난화된 트립신(37°C)을 3분 동안 아일레 펠릿으로 배양하였다. 200 μL 파이펫을 사용하여 주기적인 부드러운 파이펫팅으로 이 시간 동안 섬을 부드럽게 분산시소.
   6. 트립신을 1 mL 로 데운(37°C) PIM(S) 50 μM PR619를 함유한 다음, 퇴적세포를 400 x g에서 1분 동안 원심분리하여 담금질한다.
   7. PBS + 50 μM PR619로 1 분, 두 번 400 x g에서 원심 분리하여 세포를 씻으십시오.
   8. 마지막으로, 50 μM PR619를 함유하는 150 μL PBS에서 세포를 재중단한다.
2. 단세포 부착 및 고정
   1. 재서스펜션 후, 세포 용액을 10 분 동안 28 x g의 세포 중심 리퓨지를 사용하여 서리가 내린, 충전 된 현미경 슬라이드에 돌십시오.
   2. 세포원각화 후, 필요한 항체/PLA 용액 부피를 최소화하기 위해 소수성 펜으로 세포 영역을 윤곽을 잡아보세요(재료 표참조). 실온에서 15 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정하십시오.
      주의: PFA는 위험하며 주의해서 취급해야 합니다.
   3. 최상의 결과를 얻으려면 즉시 염색/PLA를 사용하거나 24시간 이내에 수행하십시오. 필요한 경우 샘플을 4°C에서 PBS에 보관하여 48시간 이상 염색하지 않습니다.

2. 면역화학

1. 차단
   1. 실온에서 5분 동안 1x PBS로 세포를 두 번 세척하십시오.
   2. 블록 셀 용액은, 배경 염색을 제거하기 위해, 실온에서 1 시간 동안 0.3 % 세제를 함유한 PBS에서 10 % 당나귀 혈청 (재료 표참조).
2. 얼룩
   1. USP8 (1:250) 및 NRDP1 (1:250)에 대하여 1 차 마우스 또는 토끼 항체를 가진 배양 세포는 각각 (재료의 표참조) 세제로 인산완충 식염수에 희석 (PBT, 재료표참조), 4 °C에서 하룻밤, PLA를 통해 미토파지 복합 신호를 감지합니다.
   2. PLA 신호를 방해하지 않도록 마우스 또는 토끼에서 제기되지 않은 베타 세포 식별을 위한 마커를 가진 공동 배양 세포. 이 경우 PBT에서 항 염소 PDX1 (1:500)으로 세포를 배양합니다. 증발을 방지하기 위해 용액 위에 플라스틱 필름을 사용하여 4 °C에서 밤새 모든 1 차 항체를 배양하십시오.

3. 근접 결찰 분석

1. PLA 프로브 및 카운터스테인
   1. 제조업체의 지침에 따라 PLA 프로브 솔루션을 준비합니다( 즉, PBT에서 마우스 및 항토끼 프로브 용액의 최종 농도 1:5 솔루션을 준비하고 실내에서 20분 동안 배양하여 샘플당 20 μL의 프로브 솔루션을 만듭니다.) 온도.
   2. 하룻밤 배양 후, 로커에 각각 5 분 동안 1 x PBS로 세포를 두 번 씻으하십시오.
   3. 프로브 용액으로 배양하기 직전에, 프로브 용액에 1:600의 최종 농도에서 항 염소 Cy5 보조를 추가하십시오 (내인성 PDX1 검출용). 각 세포 상태에 20 μL 프로브 용액을 추가하고 플라스틱 필름으로 부드럽게 덮고 37 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
2. 결찰
   1. 로커에서 각각 5분 동안 버퍼 A(레시피용 재료 표 참조)로 실온에서 세포를 두 번 세척합니다.
   2. 제조업체의 지침에 따라 결찰 용액(검출 시약의 일부, 재료 표참조)을 준비합니다. 이를 위해, 희석 국윤 (5x) 1:5 디에틸 파이로 카보네이트 (DEPC) 처리 된 물. 배양 직전에 0.025 U/mL 리가즈를 추가합니다. 세포에 20 μL 결찰 액을 추가하십시오. 플라스틱 필름으로 덮고 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
3. 증폭
   1. 실온에서 2회 버퍼 A로 셀을 2분 동안 세척합니다.
   2. 제조업체의 지침에 따라 증폭 솔루션(검출 시약의 일부, 재료 표 참조)을 확인하십시오. 증폭 완충제(5x)를 DEPC 처리된 물에 1:5로 희석하고 사용할 때까지 어둠 속에서 보관하십시오. 셀에 용액을 추가하기 직전에 용액에 폴리머라제 1:80 희석(검출 시약의 일부, 재료 표 참조)을 추가합니다.
   3. 세포에 20 μL의 증폭 용액을 추가하십시오. 최대 신호를 위해 플라스틱 필름으로 덮고 37 °C에서 1 시간 40 분에서 2 시간 사이에 어둠 속에서 놓습니다.
4. 이미징 준비
   1. 로커에서 실온에서 10분 동안 버퍼 B로 셀을 두 번 세척합니다(레시피용 재료 표 참조).
   2. 마지막으로, 로커의 실온에서 2분 동안 0.01x 버퍼 B에 한 번 세척합니다.
   3. 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 포함하는 장착 매체의 방울을 추가하고 조심스럽게 형성 된 거품을 눌러 메스 블레이드를 사용하여 샘플 위에 커버 슬립을 배치하여 샘플을 마운트합니다. 가장자리 주위에 명확한 매니큐어를 사용하여 씰 커버립.
   4. 레이저 스캐닝 공초점 현미경, 또는 디콘볼루션 기능을 갖춘 반전형광 현미경과 같은 여러 초점 평면을 캡처할 수 있는 현미경의 이미지 샘플은 최소 9개의 서로 다른 초점 평면 이미지를 촬영합니다.
      1. 약 0.45mm z 스택 높이로 100배 배율로 이미지를 캡처합니다. 550 nm 여기, 570 nm 방출에서 PLA를 캡처; 650 nm 여기, 670 nm 방출에서 카운터 얼룩; 및 DAPI에서 405 nm 여기, 450 nm 방출.
   5. PLA 이벤트(특히 광시야 현미경)의 하류 분석을 위해 형광 이미지 배경 신호및 미광을 최소화하기 위해 2차원 데콘볼루션(가장 가까운 이웃) 알고리즘을 활용하는 프로세스 이미지 선택의 표준 이미지 처리 소프트웨어.
      참고 : 올림푸스 는 셀센스를 사용, 니콘은 NIS-Elements를 사용, 라이카는 LAS X를 사용, 자이스 – 젠, 변신, MATLAB, 휴이겐스 소프트웨어, 뿐만 아니라 이미지 J를 통해 사용할 수있는 여러 플러그인. 분석을 위해 모든 z-stacks에 대한 총 상호 작용 수를 Image-J 소프트웨어를 사용하여 분석해야 하며 Pdx-1 양성 세포만 분석되어야 합니다(섹션 3.5).
5. PLA 상호 작용정량화
   1. 무료 Image-J 소프트웨어 응용 프로그램을 열고 PLA 이미지를 엽니다. 첫 번째 선명하게 초점을 맞춘 PLA 이미지부터 시작합니다.
   2. 이미지 탭을 클릭하고 조정을 선택한 다음 임계값(그림1A)을선택합니다. 임계값을 조정하여 비특이적 PLA 신호를 모두 제거하고, 임계값 조정을 기록하고, 분석 전반에 걸쳐 일관성을 유지하려고 합니다.
   3. 프로세스 탭을 클릭하고 바이너리를선택한 다음 바이너리(그림 1B)를만듭니다. 이진 이미지를 사용하여 "분석" 탭을클릭하고 입자 분석(그림1C)을눌러 파티클을 측정합니다.
   4. 분석의 경우 크기 = 0-무한대, 원형 = 0-1.0, 표시 = 윤곽선, 표시 결과에대한 확인란 및 결과 지우기(그림 1D)와같이 설정이 있는지 확인합니다. 확인을클릭합니다. 샘플을 나타내는 스프레드시트에서 분석된 파티클 수와 z 스택 위치를 기록합니다.
   5. 3.5.2-3.5.4 단계를 반복하여 샘플에 대한 모든 포커스 z 스택을 분석할 때까지 반복합니다. 스프레드시트의 샘플에 대한 총 파티클 수를 합산하여 총 상호 작용 수를 정량화합니다.

결과

우리는 MIN6 췌장 베타 세포주 및 SH-SY5Y 신경 아세포종 세포주 SH-SY5Y에서 초기 실험을 수행하여 항체의 특이성과 가시화된 단백질 상호작용을 모두 최적화하고 확인하였다. MIN6 세포는 30,000 세포/mL에서 커버슬립에 도금하고 48시간 동안 부착하도록 방치하였고, SH-SY5Y 세포는 15,000 세포/mL에서 커버슬립 상에 도금되고 24시간 동안 부착하도록 방치하였다. PLA 프로토콜은 1.2.3 ?...

토론

여기에서 우리는 상류 mitophagy 복합물의 대형을 정량화하기 위하여 관심 있는 조직/세포에 NRDP1:USP8 PLA를 사용하는 간단하고 능률적인 접근을 기술합니다. 우리는 이전에 공동 면역 침전 실험, 무세포 상호 작용 연구 및 시험관 내 뿐만 아니라 세포 기지를 둔 몇몇 방법론에 의해 췌장 베타 세포에 있는 CLEC16A-NRDP1-USP8 미토파지 복합체의 대형을 확인했습니다 유비퀴틴 화 검사, 이 복잡한 드라이브가...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA 1X	Life Technologies	25200-056
Antibiotic-Antimycotic	Life Technologies	15240-062
Block solution	Homemade		Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent.
Buffer A	Homemade		To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use
Buffer B	Homemade		To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use
Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat	Jackson Labs	705-175-147
Detection Reagents Red	Sigma- Aldrich	DU092008-100RXN	Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase.
DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS	Sigma- Aldrich	DU092004-100RXN
DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS	Sigma- Aldrich	DU092002-100RXN
Fetal bovine serum
Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17)	Santa Cruz	SC-14664	RRID: AB_2162373
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-080
MIN6 pancreatic cell line	Gift from D. Stoffers		Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays.
Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872)	Sigma- Aldrich	SAB200527
Pap-pen	Research Products International	195505
Parafilm			Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes.
PBT (phosphate buffered saline with triton)	Homemade		To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20)
Penicillin-Streptomycin (100X)	Life Technologies	15140-122
Phosphate buffered saline, 10X	Fisher Scientific	BP399-20
PIM(ABS) Human AB serum	Prodo Labs	PIM-ABS001GMP
PIM(G) (glutamine)	Prodo Labs	PIM-G001GMP
PIM(S) media	Prodo Labs	PIM-S001GMP
PR619	Apex Bio	A812
Prolong Gold antifade reagent with DAPI	Life Technologies (Molecular Probes)	P36935
Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1)	Bethyl Laboratories	A300-049A	RRID: AB_2181251
SH-SY5Y cells	Gift from L. Satin		Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays.
Sodium Pyruvate (100X)	Life Technologies	11360-070
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
Water for RNA work (DEPC water)	Fisher Scientific	BP361-1L