Un modelo de ratón no aleatorio para la reactivación farmacológica de Mecp2 en el cromosoma X inactivo

Resumen

Aquí describimos un protocolo para generar un modelo murino femenino viable con inactivación cromosómica no aleatoria, es decir, el cromosoma X de herencia maternalmente está inactivo en el 100% de las células. También describimos un protocolo para probar la viabilidad, la tolerabilidad y la seguridad de la reactivación farmacológica del cromosoma X inactivo in vivo.

Resumen

La inactivación del cromosoma x (XCI) es el silenciamiento aleatorio de un cromosoma X en las hembras para lograr el equilibrio de dosis genéticas entre los sexos. Como resultado, todas las hembras son heterocigósas para la expresión génica ligada al X. Uno de los reguladores clave de XCI es Xist, que es esencial para el inicio y mantenimiento de XCI. Estudios previos han identificado 13 factores de inactivación cromosómica de acción trans (XCIFs) que utilizan una pantalla genética de pérdida de función a gran escala. La inhibición de XCIFs, como ACVR1 y PDPK1, mediante el uso de ARN de horquilla corta o de inhibidores de moléculas pequeñas, reactiva los genes relacionados con los cromosomas X en las células cultivadas. Pero la viabilidad y tolerabilidad de reactivar el cromosoma X inactivo in vivo queda por determinar. Hacia este objetivo, se ha generado un modelo de ratón Xistδ: MECP2/Xist: MECP2-GFP con XCI no aleatorio debido a la eliminación de Xist en un cromosoma X. Usando este modelo, la extensión de la reactivación X inactiva fue cuantitada en el cerebro del ratón después del tratamiento con inhibidores de XCIF. Los resultados publicados recientemente muestran, por primera vez, que la inhibición farmacológica de XCIFs reactiva el Mecp2 del cromosoma X inactivo en las neuronas corticales del cerebro viviente del ratón.

Introducción

La inactivación del cromosoma x (XCI) es un proceso de compensación de dosis que equilibra la expresión génica ligada al X mediante el silenciamiento de una copia del cromosoma X en las hembras¹. Como resultado, el cromosoma X inactivo (XI) acumula rasgos característicos de la heterocromatina, incluyendo la metilación del ADN y las modificaciones de la histona inhibitoria, tales como histona H3-lisina 27 trimetilación (H3K27me3) e histona H2A ubiquitinación (H2Aub) ². el regulador maestro del silenciamiento cromosómico x es la región centro de inactivación x (XIC), alrededor de 100-500 KB, que controla el conteo y emparejamiento de los cromosomas x, la elección aleatoria del cromosoma x para la inactivación, y la iniciación y propagación del silenciamiento a lo largo del cromosoma X³. El proceso de inactivación X se inicia mediante una transcripción específica X inactiva (Xist) que recubre el XI en CIS para mediar el silenciamiento de todo el cromosoma y la remodelación de la estructura tridimensional del cromosoma X⁴. Recientemente, varias pantallas proteómicas y genéticas han identificado reguladores adicionales de XCI, como las proteínas de interacción Xist ^{5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12}. por ejemplo, un estudio anterior que utiliza una pantalla de interferencia de ARN no sesgada de todo el genoma identificó 13 factores de XCI de acción Trans(xcifs)¹². Mecaniísticamente, XCIFs regula la expresión Xist y, por lo tanto, interferir con la función xcifs causa XCI¹²defectuoso. En conjunto, los avances recientes en el campo han proporcionado información importante sobre la maquinaria molecular necesaria para iniciar y mantener la XCI.

La identificación de los reguladores de XCI y la comprensión de su mecanismo en XCI es directamente relevante para las enfermedades humanas vinculadas a X, como el síndrome de rett (RTT)^13,14. El RTT es un trastorno raro del desarrollo neurológico causado por una mutación heterocigosa en la proteína de unión al metil-CpG 2 ligada al X (MECP2) que afecta predominantemente a las niñas¹⁵. Debido a que el MECP2 se encuentra en el cromosoma X, las niñas RTT son heterocigosas para la deficiencia de MECP2 con ~ 50% de células que expresan el tipo salvaje y ~ 50% expresan un mutante MECP2. En particular, las células mutantes RTT albergan una copia inactiva pero de tipo salvaje de Mecp2 en el XI, proporcionando una fuente del gen funcional, que si se reactiva, podría aliviar los síntomas de la enfermedad. Además del RTT, hay varias otras enfermedades humanas vinculadas al X, para las que la reactivación de XI representa un posible enfoque terapéutico, como el síndrome de DDX3X.

La inhibición de XCIFs, proteína de 3-fosfoinositida dependiente quinasa-1 (PDPK1), y Activin un receptor tipo 1 (ACVR1), ya sea por el ARN corto del pelo (shRNA) o inhibidores de moléculas pequeñas, reactiva los genes XI-vinculados¹². La reactivación farmacológica de genes XI-ligados se observa en varios modelos ex vivo que incluyen líneas celulares de fibroblastos de ratón, neuronas corticales de ratones adultos, fibroblastos embrionarios de ratón y líneas celulares de fibroblastos derivadas de un paciente RTT¹². Sin embargo, queda por demostrar si la reactivación farmacológica de los genes vinculados con XI es factible in vivo. Un factor limitante es la falta de modelos animales efectivos para medir con precisión la expresión de los genes de la reactivada XI. Hacia este objetivo, se ha generado un Xistδ: MECP2/Xist: modelo de ratón MECP2-GFP que lleva un MECP2 genéticamente etiquetado en XI en todas las células debido a la deleción Heterocigosa en Xist en el cromosoma X materno¹⁶. Usando este modelo, la expresión de Mecp2 de XI se ha cuantitado después del tratamiento con inhibidores de xcifs en el cerebro de los ratones vivos. Aquí se describe la generación de xistδ: MECP2/Xist: modelo de ratón MECP2-GFP y metodología para la reactivación de cuantificar XI en neuronas corticales utilizando ensayos basados en inmunofluorescencia.

Protocolo

El trabajo relacionado con ratones fue aprobado por el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad de Virginia (IACUC; #4112).

1. genere un modelo de ratón XCI no aleatorio con el Mecp2 genéticamente etiquetado en XI

Nota: Las cepas de ratón utilizadas en el estudio fueron las siguientes: MECP2-GFP/MECP2-GFP (MECP2^{TM 3.1 Bird}, tabla de materiales) y Xist/δxist (B6; 129-Xist < tm5Sado >; proporcionada por Antonio bedalov, Fred Centro Oncológico Hutchinson, Seattle). Las estrategias de cría entre las respectivas cepas han sido diseñadas para expandir las colonias de ratones para cada cepa.

1. Realizar genotipado por PCR en todas las cepas de ratones y los respectivos progenies obtenidos después de la cría utilizando imprimadores específicos de genes enumerados en la tabla 1.

2. Diseñe la estrategia de reproducción del ratón para generar Xistδ: MECP2/Xist: MECP2-GFP

1. Establecer un par de cría por la vivienda de un Mecp2-GFP/Y macho y un XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2 hembra juntos (12 h/12 h: ciclo claro/oscuro) (figura 1A). Idealmente, establecer por lo menos 5 parejas reproductoras a la vez utilizando ratones viables y fértiles. Después de que la hembra embarazada da a luz, le permite levantar su primera camada con el macho.
   Nota: Debido a que el Xist Knockout paterno deteriora la XCI impresa, la compensación de dosificación y las vías de diferenciación¹⁷, el uso de ratones xistδ-Mecp2/Y en la cría no producirá las crías femeninas con el genotipo requerido.
2. Después de destetar la camada en el día 21 (p21) post-natal, identifique y etiquete las crías de la hembra Xistδ: MECP2/Xist: MECP2-GFP utilizando un ensayo de genotipado basado en PCR (figura 1B).
   Nota: En cuanto al número de animales necesarios por grupo, para los resultados que se indican a continuación, se configuraron 5 pares reproductoras que generaron aproximadamente 10 hembras Xistδ: MECP2/Xist: los ratones MECP2-GFP .
3. Utilice modelos de ratón hembra para todos los experimentos propuestos.
   Nota: El sexo es una variable biológica importante para los estudios de XCI, y el modelo masculino no tiene en cuenta los efectos de confusión del XCI aleatorio.
4. Para ser consistente a lo largo de los estudios en animales y descartar cualquier efecto de la edad animal, realizar todos los experimentos en 5-8-semana-edad hembra Xistδ: MECP2/Xist: los ratones MECP2-GFP .

3. aislar la hembra Xistδ: MECP2/Xist: fibroblastos embrionarios de ratón de Mecp2-GFP (MEFS)

1. Configure el acoplamiento cronometrado entre la hembra MECP2-GFP/y macho y xistδ-Mecp2/Xist-MECP2 . Configurar por lo menos 3 − 4 jaulas de acoplamiento para aumentar la probabilidad de embarazo.
2. Después de confirmar el tapón vaginal la mañana después del apareamiento, separar la hembra y este día se considera embrionario día 0,5 (E 0.5). Monitorear el aumento de peso de la futura hembra embarazada y inspeccionar visualmente el abdomen de los ratones para confirmar el embarazo. En E 14.5 − 15.5, eutanasia a las hembras embarazadas a través de la dislocación cervical.
3. Bajo una capucha laminar, limpie el abdomen de la hembra embarazada con etanol al 70%. Con tijeras estériles, diseccionar la cavidad abdominal y extraer los cuernos uterinos que contengan los embriones. Usando fórceps, retire suavemente los embriones mientras se corta el tejido abdominal restante (6 − 12 embriones por lo general se espera).
4. Coloque los cuernos uterinos que contengan los embriones en un plato de cultivo de tejido de 10 mm. Usando tijeras y fórceps estériles, haga una incisión a lo largo de los cuernos uterinos para aislar los sacos individuales que llevan un embrión. Con cuidado, coloque los cuernos uterinos que contengan el resto de los embriones en 30 mL de solución de sal equilibrada (HBSS) estéril de Hanks sobre hielo.
5. Cortar suavemente abrir el saco y aislar el embrión usando tijeras y fórceps estériles. Retira la placenta cortando el cordón umbilical.
6. Decapitar el embrión.
   Nota: Mientras que el resto del tejido embrionario será procesado más adelante, el tejido de la cabeza del embrión será utilizado para aislar el ADN para el genotipado.
7. Abra el abdomen cortando la línea media del embrión usando tijeras y fórceps estériles. Retira los órganos viscerales, como el corazón, el hígado y los pulmones.
8. Transfiera el tejido embrionario restante a una placa de cultivo de tejido estéril de 60 mm y córtela en trozos pequeños usando tijeras o una cuchilla de afeitar. Para abrir los grumos celulares, añadir 3 mL de tripsina-EDTA (0,05%) e incubar a 37 ° c durante 15 min.
9. Neutralizar tripsina-EDTA añadiendo 5 mL de medio de águila modificada de Dulbecco (DMEM) con un 10% de suero bovino fetal (FBS) y 10 μg/mL de penicilina/estreptomicina (Pen/estreptococo) a la placa y disociar el tejido mediante pipeteo repetitivo (aproximadamente 20 − 30 veces).
10. Gire las células a 300 x g durante 5 min y vuelva a suspender el pellet de células en 4 ml de DMEM con 10% de FBS y 10 μg/ml de pluma/estreptococo. Placa las células en un plato de cultivo de 60 mm, y cultivo de las células a 37 ° c en presencia de 5% CO₂.
11. Lleve a cabo los pasos 3.5 − 3.10 para cada embrión.
12. Cultura MEFs obtenida en el paso 3,11 durante al menos 3 − 4 días.
    Nota: En esta etapa, los MEFs también pueden ser crioreservados para futuros experimentos.
13. Para determinar el sexo y el genotipo de cada embrión, llevar a cabo genotipado-PCR utilizando ADN aislado de las cabezas de los embriones utilizando cebadores y condiciones de PCR enumeradas en la tabla 1.

4. Confirme la falta de expresión de proteína fluorescente verde (GFP) en el cerebro de Xistδ: los ratones MECP2/Xist: MECP2-GFP que utilizan un ensayo basado en la clasificación de células activadas por ffluorescencia

1. Usando tijeras, separe la corteza cerebral del resto de los hemisferios cerebrales, y colóquelo en 1 mL de tampón de medio de aislamiento de núcleos fríos (NIM) que contenga una sacarosa de 250 mM, cloruro de potasio de 25 mM (KCl), cloruro de magnesio de 5 mM (MgCl₂), Tris-cl de 10 mm, complementado con 2% de paraformaldehído (PFA), y 0,1% surfactante no iónico (tabla de materiales).
2. Homogeneizar con un homogenizador de vidrio frío-hielo.
3. Gire hacia abajo el tejido homogeneizado a 600 x g, 4 ° c durante 5 min.
4. Quitar el sobrenadante y el pellet de resuspendio en 1 mL de un 25% de iodixanol en la solución NIM.
5. Añadir 1 ml de un 29% de lodixanol en la solución Nim a un tubo de ultracentrífuga de 4 ml (conservar en hielo hasta que las muestras estén listas) y cuidadosamente la capa de 1 ml de muestra (en un 25% de lodixanol).
6. Centrifugar a 9.000 x g, 4 ° c durante 10 min en una ultracentrifuge.
7. Aspirar el sobrenadante y el pellet de resuspendio en 500 μL de tampón de separación de células activadas por fluorescencia (FACS) (solución salina amortiguada con fosfato [PBS] suplementado con 1 mM EDTA, 0,05% azida sódica y 2% albúmina sérica bovina [BSA]).
   Nota: Las muestras se pueden almacenar a 4 ° c o hasta 1 semana.
8. Añadir 5 μL de 7-amino-actinomicina D (7-AAD; 50 mg/mL) durante 5 min a temperatura ambiente para manchar el ADN.
9. Analice muestras para la señal de 7-AAD y proteína fluorescente verde (GFP) utilizando citometría de flujo.

5. Determine la viabilidad del modelo de ratón Xistδ: MECP2/Xist: MECP2-GFP para la reactivación XI

1. Semilla 1 x 10⁵ células/ml hembra xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP MEFS, Mecp2/Mecp2-GFP Y Xist-MECP2/y MEFS obtenida en el paso 3,12 en un formato de 6 pozo y en portaobjetos de cámara, en DMEM con 10% de FBS y 10 μg/ml de pluma/estreptococo 37, a presencia de 5% de CO₂.
   Nota: Los MEFS MECP2/MECP2-GFP y Xist-MECP2/y se utilizan como controles positivos y negativos en los experimentos.
2. Añadir un medio fresco a las células después de 24 h. Para Xistδ: MECP2/Xist: MECP2-GFP MEFS, añadir medio complementado con inhibidores de xcifs (p. ej., 0,5 μm LDN193189 y 2,5 μm GSK650394), o vehículo solo. Reemplace el medio complementado con un inhibidor fresco o un vehículo solo cada 2 días. Para MECP2/MECP2-GFP y Xist-MECP2/y MEFS, agregue un medio fresco cada 2 días.
3. Después de 1 semana de tratamiento inhibidor, cosechar MEFs para el aislamiento de ARN (placa de 6-Well) o fijar las células para la inmunofluorescencia (diapositivas de la cámara). Utilice MEFs aislados de embriones de MECP2/MECP2-GFP como embriones positivos y Xist-Mecp2/Y como controles negativos respectivamente.
   1. Para el aislamiento de ARN, aislar el ARN total del reactivo de extracción de ARN basado en el tiocianato de guanidinio, y transcribir inverso utilizando la transcriptasa inversa. Mida la expresión Mecp2-GFP mediante la transcriptasa-PCR inversa cuantitativa (QRT-PCR) utilizando MECP2-WT y MECP2-GFP, y los imprimadores enumerados en la tabla 1, como se describió anteriormente¹².
   2. Para la inmunofluorescencia, mancha MEFS con un anticuerpo primario anti-GFP (1:100), como se describió anteriormente^12,16. Mida la intensidad GFP por inmunofluorescencia cuantitativa en el fármaco tratado Xistδ: MECP2/Xist: MECP2-GFP MEFS, como se describió anteriormente¹⁸.

6. demostrar la reactivación farmacológica XI en el cerebro del Xistδ: MECP2/Xist: modelo de ratón MECP2-GFP

1. Prepare medicamentos y controle el vehículo.
   1. Prepare una solución fresca y estéril del vehículo (0,9% NaCl, 0,5% metilcelulosa, 4,5% dimetilsulfóxido [DMSO]) para las inyecciones cerebrales.
   2. Preparar inhibidores químicos incluyendo 1,5 mM LDN193189 (inhibidor de molécula pequeña de ACVR1) y 1,6 mM GSK650394 (inhibidor de molécula pequeña de SGK1, un efector descendente de PDPK1) re-suspendido en vehículo (0,9% NaCl, 0,5% metilcelulosa, 4,5% DMSO), o vehículo Solo. El volumen total de inhibidores químicos o de vehículos inyectados es de 10 μL por dosis por animal.
2. Prepare animales para inyecciones cerebrales.
   1. Prepare el área quirúrgica limpiando el Banco y la almohadilla térmica con desinfectante (solución de hipoclorito de sodio al 10%).
   2. Anestesiar el ratón de 4 semanas de edad con una inyección intraperitoneal de la mezcla de ketamina/xilazina a una dosis de 140 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente. Utilice el reflejo de retirada del pedal para determinar el nivel de anestesia.
   3. Aplicar ungüento oftálmico a los ojos después de la inducción de la anestesia para prevenir el secado corneal.
   4. Afeitarse el pelaje desde el cuello hasta la parte superior de la cabeza del ratón.
   5. Coloque el ratón en la plataforma estereotáctica enganchando los dientes incisivos del ratón en la barra de mordida del hocico y apretando la abrazadera de la nariz sobre el hocico mientras se asegura de que la cabeza del ratón está en un plano nivelado.
   6. Ajustar la altura de las barras del oído, según sea necesario, para llegar a la porción caudal del conducto auditivo, asegurándolos de tal manera que la cabeza del ratón está en un plano de nivel e inmovilizado en el tacto del dedo.
   7. Desinfectar la cabeza del ratón con toallitas alternas de un antiséptico tópico, como povidona-yodo y etanol al 70%.
3. Administrar drogas.
   1. Usando un bisturí estéril, haz una incisión horizontal de 0,75 cm en el cuero cabelludo medio.
   2. Utilizando una rebaba de 0,45 mm, taladre dos orificios simétricos por encima de los hemisferios corticales derecho e izquierdo (2 mm de la sutura sagital y 2 mm de la sutura lambdoidea, aproximadamente la mitad del hueso parietal).
   3. Fije firmemente una jeringa de 10 μL a la plataforma estereotáctica.
   4. Mezclar la solución de inhibidores químicos y extraer 10 μL de solución en la jeringa. Evite las burbujas de aire en la jeringa.
   5. Avance la aguja de la jeringa en el orificio de rebabas manteniendo la aguja perpendicular (90 °) al cráneo. Cuando la aguja atraviesa el cráneo, cero las coordenadas en la pantalla digital estereotáctica y luego avanzar la punta de la aguja hasta que alcanza una profundidad de 2,5 mm.
   6. Retirar la aguja 0,5 mm a la profundidad de 2 mm.
   7. Inyectar lentamente 10 μL de solución (~ 1 min). Una vez completada la inyección, deje la aguja en el cerebro durante ~ 1 min y luego retire la aguja.
   8. Repetir la inyección para el segundo hemisferio (control de vehículo solamente).
   9. El uso de suturas o "pegamento de la piel" cerrar la piel del ratón (si la herida es > 0,5 cm tanto suturas y "pegamento de la piel" debe ser utilizado).
   10. Afloje las barras del oído y retire el ratón del aparato estereotáctico.
   11. Administrar analgésicos (buprenorphine SR 0,5 mg/kg IP) y colocar el ratón sobre una almohadilla térmica configurada a 37 ° c hasta que el animal recupere la consciencia.
   12. Una vez que el ratón esté alerta y sensible, transfiera el animal de vuelta a su jaula original.
   13. Repita el procedimiento cada 2 días durante 20 días. No es necesario repetir la perforación de la zona para las inyecciones posteriores.
4. Aísla el cerebro del ratón.
   1. Una vez finalizada la pauta posológica, eutanasia al ratón en una cámara CO₂ .
   2. Inmovilizar el ratón sobre una superficie con agujas.
   3. Haga una incisión lateral a través del integumento y la pared abdominal justo debajo de la caja torácica usando tijeras y fórceps. Separe cuidadosamente el hígado del diafragma.
   4. Usando tijeras, cortar el diafragma y continuar cortando a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural.
   5. Con las tijeras, haz una incisión en el extremo posterior del ventrículo izquierdo.
   6. Inmediatamente, comience a inyectar la cámara cardíaca derecha con ~ 15 mL de PBS sobre ~ 2 min. cambio de color del hígado de rojo a rosa pálido es indicativo de buena perfusión.
   7. Inyecte la cámara derecha del corazón del ratón con ~ 10 mL de paraformaldehído al 4% en PBS sobre ~ 2 min.
   8. Decapitar el ratón, y utilizar tijeras para hacer una incisión de la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo.
   9. Coloque una punta de las tijeras en el foramen magnum, y corte lateralmente en el cráneo hacia el ojo. Repite para el otro lado. Trate de mantener el extremo de las tijeras lo más superficial posible para evitar lesiones en el cerebro.
   10. Utilice tijeras para cortar la región entre los ojos y por encima de la nariz del ratón.
   11. Usa fórceps para pelar suavemente los huesos craneales de los hemisferios cerebrales.
   12. Levante el cerebro con una espátula y use tijeras para diseccionar cuidadosamente las fibras nerviosas craneales que lo fijan al cráneo.
   13. Coloque el cerebro en un plato de plástico, corte el cerebelo y las bombillas olfativas, y coloque el cerebro en un tubo de 15 mL lleno de 4% de PFA es PBS.
5. Cryo-Section el cerebro del ratón.
   1. Fije el cerebro en un 4% de paraformaldehído en PBS a 4 ° c durante la noche.
   2. Enjuague el cerebro con PBS a 4 ° c al menos 3x durante 5 min cada uno.
   3. Etiquete los moldes desechables para la criopreserva de los tejidos.
   4. Cortar la parte frontal del cerebro usando tijeras y fórceps (empezar a hacer ~ 5 mm secciones de sitios de inyección).
   5. Transfiera el cerebro al crimomoldeo con la parte frontal del cerebro hacia abajo para obtener secciones coronales. Sumerja el molde que contiene el cerebro en el compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT).
   6. Vierta el nitrógeno líquido en una placa de Petri de plástico de 10 mm y coloque el cerebro en el criomoldeo en el nitrógeno.
      Nota: Es importante orientar el tejido como se describe en el paso 6.5.5 para guiar la seccionción del cerebro.
   7. Cuando la OCT es de color blanco sólido, coloque el cerebro congelado en un congelador de-80 ° c para almacenarse.
   8. Equilibrar el cerebro a-20 ° c durante al menos 30 minutos antes de la seccionamiento con criostato y cricosección (5 − 6 μm de espesor) del cerebro, montaje de 2 − 3 secciones por diapositiva. Las diapositivas se pueden almacenar a-80 ° c para su uso posterior.
6. Determine la reactivación XI utilizando un enfoque basado en inmunofluorescencia.
   1. Antes de comenzar el procedimiento de tinción, seque las secciones cerebrales durante la noche a 4 ° c.
   2. Sumergir diapositivas en solución de recuperación de antígeno (0,1 M de ácido cítrico, 0,1 M Tris-base, pH = 6,0) en un bloque de calor de 100 ° c durante 5 min.
   3. Lave las diapositivas 4x con 1x PBS durante 5 min cada una a temperatura ambiente.
   4. Sumergir los portaobjetos en la solución de bloqueo (0,1 M NH₄cl/PBS/0,2% gelatina/0,05% tensioactivo no iónico) durante 20 min a temperatura ambiente.
   5. Lavar las diapositivas 3x con tampón de lavado (PBS/0,2% gelatina) a temperatura ambiente durante 5 min cada uno.
   6. Manchas en las secciones cerebrales con anticuerpos anti-GFP-AlexaFluor647 (1:100) y anti-MAP2 (1:1000) en medio de incubación (PBS/0,2% de gelatina/1% de BSA) e incubar a 4 ° c durante la noche.
   7. Recoja los anticuerpos primarios (se pueden reutilizar). Lave las diapositivas 4x con el tampón de lavado durante un total de 30 minutos a temperatura ambiente.
   8. Incubar las secciones cerebrales con la cabra anti-pollo fluoresceina isotiocianato (FITC)-etiquetado secundario anticuerpo (1:1000) en medio de incubación e incubar 1 − 2 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
   9. Lave las diapositivas 4x con el tampón de lavado durante un total de 30 minutos a temperatura ambiente.
   10. Coloque una gota de medio de montaje con 4 ′, 6-diamidino-2-Phenylindole (DAPI) en un recubrimiento de 22 mm x 50 mm, luego invierta el cubreobjetos en una diapositiva, cubriendo todas las secciones de tejido.
   11. Imagen en un microscopio y ajuste las imágenes para el contraste y el brillo. Capture imágenes y cuantifique el número de células GFP positivas tanto para el tratamiento con fármacos como para el tratamiento con el vehículo Xistδ: MECP2/Xist: los hemisferios cerebrales del ratón de Mecp2-GFP.

Resultados

Para demostrar la viabilidad del modelo de ratón Xistδ: MECP2/Xist: MECP2-GFP para estudios de reactivación XI, se probó la reactivación por inhibidor de xcif del Mecp2-GFP de XI ligado en fibroblastos embrionarios de ratones (MEFS). Las MEFs femeninas se aislaron del día 15,5 Xistδ: MECP2/Xist: embriones de MECP2-GFP como se describe en la sección 3 (figura 1A). Los genotipos de la hembra Xistδ: MECP2/Xist: los MEFS de MECP2-GFP

Discusión

Anteriormente, se identificaron XCIFs que son requeridos selectivamente para el silenciamiento de genes ligados a XI en células femeninas de mamíferos¹². Además, optimizamos potentes inhibidores de moléculas pequeñas para apuntar a XCIFs, como ACVR1 y efectores descendentes de PDPK1, que reactivan eficientemente el Mecp2 ligado a XI en líneas celulares de fibroblastos de ratón, neuronas corticales de ratón y una célula de fibroblastos humanos línea derivada de un paciente con RT...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICE
Mecp2tm3.1Bird	The Jackson Laboratory	#014610
B6;129-Xist (tm5Sado)	provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle
REAGENTS
22x22 mm coverslip	FISHERfinest (Fisher Scientific)	125488
32% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S
50 ml syringe	Medline Industries	NPMJD50LZ
60mm culture dish	CellStar	628160
7-AAD	BioLegend	420403
ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Chemical	A661-3
anti-GFP-AlexaFluor647	Invitrogen	A-31852
anti-MAP2	Aves Labs	MAP
BSA	Promega	R396D
Buprenorphine SR	Zoopharm
citric acid	Sigma	C-1857
DMSO	Fisher Bioreagents	BP231-100
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Ethanol	Decon Labs	2701
fetal bovine serum (FBS)	VWR Life Science	89510-198
gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
glass slides	Fisherbrand	22-034-486
goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody	Aves Labs	F-1005
GSK650394	ApexBio	B1051
hamilton 10μl syringe	Hamilton Sigma-Aldrich	28615-U
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-092
Ketamine	Ketaset	NDC 0856-2013-01
Large blunt/blunt curved scissors	Fine Science Tools	14519-14
LDN193189	Cayman Chemicals	11802
lodixanol	Sigma	1343517
magnesium chloride (MgCl2)	Fisher Chemical	M35-212
Methylcelulose	Sigma	M0262-100G
mounting medium with DAPI	Vectashield	H-1200
Needle tip, 26 GA x 1.25"	PrecisionGlide	305111
ophthalmic ointment	Refresh Lacri-Lube	93468
optimal cutting temperature (O.C.T.)	ThermoFisher
PCR mix
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Corning	30-002-Cl
Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)	Corning Cellgro	46-103-CM
Potassium chloride (KCl)	Fisher Scientific	P330-500
scalpel blades
Shallow glass or plastic tray
skin glue/tissue adhesive	3M Vetbond	1469SB
sodium azide	Fisher Scientific	CAS 26628-22-8
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Chemical	S642-212
standard hemostat forceps	Fine Science Tools	13013-14
Standard tweezers	Fine Science Tools	11027-12
Straight iris scissors	Fine Science Tools	14058-11
sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Tris-base	Fisher Bioreagents	BP152-5
Triton X-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
Xylazine	Akorn	NDC: 59399-111-50
EQUIPMENT
Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope	Zeiss	Zeiss AxioObserver
0.45mm burr	IDEAL MicroDrill	67-1000
BD FACScalibur
centrifuge
glass homogenizer
cell culture incubator	Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i	13-998-213
Leica 3050S research cryostat
stereotactic platform
thermocycler
Timer
ultracentrifuge	Beckman Coulter Optima L-100 XP
Water bath (37 ºC)	Fisher Scientific Isotemp 2239