מודל עכבר שאינו אקראי עבור ההפעלה הפרמקולוגית של Mecp2 על כרומוזום X לא פעיל

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקול כדי ליצור מודל קיימא נשי מורטין עם כרומוזום לא אקראי הפעלה X, כלומר, maternally בירושה כרומוזום X אינו פעיל ב 100% של התאים. כמו כן, אנו מתארים פרוטוקול לבדיקת היתכנות, סבילות, ובטיחות של ההפעלה הפרמקולוגית של כרומוזום X לא פעיל ב vivo.

Abstract

כרומוזום x הפעלה (XCI) הוא אקראי השתקה של כרומוזום X אחד אצל נקבות כדי להשיג איזון המינון הגנטי בין המינים. כתוצאה מכך, כל הנקבות מheterozygous ביטוי גנטי מקושר ל-X. אחד הרגולטורים המפתח של XCI הוא Xist, אשר חיוני עבור ייזום ותחזוקה של xci. מחקרים קודמים זיהו 13 משחק טרנס כרומוזום X בכרומוזום הפעלה (XCIFs) באמצעות בקנה מידה גדול, אובדן הפונקציה של המסך הגנטי. עיכוב של XCIFs, כגון ACVR1 ו-PDPK1, באמצעות מעכבי מולקולת ה-RNA או מולקולה קטנה, מפעיל מחדש את הגנים המקושרים כרומוזום X בתאים מתורבתים. אבל הכדאיות והסבילות של הפעלה מחדש של כרומוזום X לא פעיל בvivo שרידים להיקבע. לקראת מטרה זו, XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר נוצר עם xci שאינם אקראיים בשל מחיקה של xist על כרומוזום X אחד. באמצעות מודל זה, היקף ההפעלה הפעילה של X לא פעיל היה כימות במוח העכבר לאחר הטיפול עם מעכבי XCIF. תוצאות שפורסמו לאחרונה להראות, בפעם הראשונה, כי עיכוב תרופתי של XCIFs מפעיל מחדש Mecp2 מן כרומוזום X לא פעיל בנוירונים בקליפת המוח של העכבר החי.

Introduction

כרומוזום x הפעלה (XCI) הוא תהליך של פיצוי המינון המאזן ביטוי גנים מקושר X על ידי השתקה עותק אחד של כרומוזום X אצל נקבות¹. כתוצאה מכך, כרומוזום X לא פעיל (Xi) מצטבר תכונות אופייניות של הטרוכרוטין כולל מתילציה DNA ומעכבות שינויים היסטון, כגון היסטון H3-ליזין 27 הטריתילציה (H3K27me3) ו H2A ההיסטון (H2Aub) ². הרגולטור הראשי של כרומוזום x השתקה הוא מרכז x-inactivation פעלה (Xic) אזור, סביב 100 לערך 500 kb, אשר שולט את הספירה ואת הזיווג של כרומוזומים X, הבחירה האקראית של כרומוזום x עבור inactivation פעלה, ואת החניכה ו הפצת שהשתקה לאורך כרומוזום X³. התהליך של הפעלת X מופעל על ידי תעתיק ספציפי X לא פעיל (Xist) כי מעילים את Xi ב- cis כדי לתווך כרומוזום-רחב השתקה לשפץ את המבנה תלת מימדי של כרומוזום X⁴. לאחרונה, כמה מסכי פרוטאומית וגנטית זיהו הרגולטורים נוספים של xci, כגון שישי אינטראקציה חלבונים^{5,6,7,8,9 ,} מיכל ^{עשור ,} מיכל בן ^{11 , 12}. למשל, מחקר הקודם באמצעות הגנום משוחדת כלל הפרעה RNA התערבות מזוהה 13 משחק טרנסמפעל גורמי Xci (xcifs)¹². מכונאי, XCIFs להסדיר ביטוי Xist ולכן, הפרעה עם הפונקציה xcifs גורם לפגום xci¹². יחד, ההתקדמות האחרונה בתחום סיפקו תובנות חשובות לתוך המנגנון המולקולרי הנדרש ליזום ולתחזק XCI.

זיהוי של הרגולטורים xci והבנת המנגנון שלהם ב-xci רלוונטי ישירות למחלות אנושיות המקושרות באמצעות X, כגון תסמונת רט (rtt)^13,14. RTT היא הפרעה נוירוהתפתחותית נדירה הנגרמת על ידי מוטציה heterozygous בחלבון כריכת מתיל-CpG מקושר-X 2 (MECP2) המשפיעה בעיקר על בנות¹⁵. מכיוון MECP2 ממוקם על כרומוזום X, בנות rtt הם Heterozygous עבור MECP2 מחסור עם ~ 50% תאים המבטא פראי סוג ו ~ 50% להביע MECP2מוטציה. במיוחד, RTT תאי מוטציה הנמל העתק רדום אך פראי של Mecp2 על Xi, מתן מקור של הגן הפונקציונלי, אשר אם מופעל מראש, עלול להקל על סימפטומים של המחלה. בנוסף RTT, יש כמה מחלות אחרות הקשורות ל-X, שעבורן ההפעלה החוזרת של Xi מייצגת גישה טיפולית פוטנציאלית, כגון תסמונת DDX3X.

עיכוב של XCIFs, 3-פוספהונותזול חלבון קינאז-1 (PDPK1), ופעילות מסוג קולטן 1 (ACVR1), או על ידי מעכבי מולקולה קטנה (שרין) או מולקולת מולקולות קטנות, מפעיל מחדש את הגנים המקושרים Xi¹². ההפעלה הפרמקולוגית של גנים מקושרים Xi הוא נצפתה בדגמי vivo ex שונים הכוללים את העכבר לתאי הפיצוץ קווים, נוירונים למבוגרים העכבר הקליפת המין, העכבר העובריים מתחלקים, ואת קווי התאים פיברובפיצוץ נגזר מחולה RTT¹². עם זאת, אם ההפעלה הפרמקולוגית של גנים מקושרים Xi הוא אפשרי vivo שרידים להיות הפגינו. גורם מגביל אחד הוא חוסר של מודלים יעילים בעלי חיים כדי למדוד במדויק את הביטוי של גנים מופעל מראש Xi. לקראת מטרה זו, XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר נוצר כי נושאת גנטית מתויג Mecp2 על Xi בכל התאים בשל Heterozygous מחיקה ב Xist על כרומוזום X אימהי¹⁶. באמצעות מודל זה, הביטוי של Mecp2 מ Xi כבר כימות בעקבות הטיפול עם מעכבי XCIFs במוח של עכברים חיים. כאן, הדור של הXistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר ומתודולוגיה כדי כימות ההפעלה הראשונה של נוירונים בקליפת הסביבה המבוססת על מבוססי immunofluorescence מבוססת מתוארת.

Protocol

עבודה מעורבים עכברים אושרה על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת וירג (IACUC;4112).

1. ליצור מודל מסוג XCI עכבר שאינו אקראי עם התווית גנטית Mecp2 על Xi

הערה: זנים העכבר המשמשים במחקר היו כדלקמן: Mecp2-gfp/Mecp2-gfp (Mecp2^{tm 3.1 ציפור}, שולחן חומרים) ו xist/ΔXist (B6; 129-xist < tm5Sado >; שסופקו על ידי אנטוניו בדפורלוב, פרד האצ המרכז לסרטן, סיאטל). אסטרטגיות רבייה בין הזנים המתאימים עוצבו כדי להרחיב את מושבות העכבר על כל זן.

1. לבצע PCR-הקלדה על כל זני עכברים הprogenies שהתקבלו לאחר הרבייה באמצעות התחל הספציפי ג'ין המפורטים בטבלה 1.

2. עיצוב אסטרטגיית רבייה העכבר כדי ליצור XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp

1. הגדר זוג הרבייה על ידי דיור Mecp2-Gfp/Y זכר XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2 נקבה יחד (12 h/12 h: מחזור אור/כהה) (איור 1A). באופן אידיאלי, להגדיר לפחות 5 זוגות רבייה בכל פעם באמצעות עכברים קיימא ופורה. אחרי שהנקבה ההרה יולדת, הרשי לה לגדל את האשפה הראשונה שלה עם הזכר.
   הערה: בגלל הנוקאאוט האבהי Xist פוגע מוטבע xci, מינון פיצוי, ובידול מסלולים¹⁷, השימוש XistΔ-Mecp2/Y עכברים ברבייה לא יצליחו לייצר את הגורים הנקביים עם גנוטיפ נדרש.
2. לאחר הגמילה המלטה ביום לאחר לידה 21 (P21), לזהות ולתייג את XistΔ: Mecp2/Xist: גורי נשים Mecp2-Gfp באמצעות שיטת ה-PCR המבוססת על הקלדה (איור 1b).
   הערה: במונחים של מספר בעלי החיים הדרושים לכל קבוצה, עבור התוצאות שדווחו להלן, 5 זוגות רבייה הוגדרו שנוצרו כ 10 נקבה XistΔ: Mecp2/Xist: עכברים Mecp2-Gfp .
3. השתמש מודלים העכבר הנשי עבור כל הניסויים המוצעים.
   הערה: סקס הוא משתנה ביולוגי חשוב למחקרים XCI, והמודל הגברי אינו מסביר את ההשפעות הקונקקריות של XCI אקראיים.
4. להיות עקביים במהלך לימודי החיות ולשלול את כל ההשפעות של גיל החי, לבצע את כל הניסויים ב-5 XistΔ נקבה בת 8 שבועות : Mecp2/Xist: עכברים Mecp2-Gfp .

3. לבודד נקבה XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp העכבר העובריים (mefs)

1. להגדיר ההזדווגות מתוזמן בין Mecp2-Gfp/Y זכר ו XistΔ-Mecp2/Xist-Mecp2 נקבה. הגדר לפחות 3-4 כלובי ההזדווגות כדי להגדיל את הסבירות של ההריון.
2. לאחר אישור תקע הנרתיק בבוקר לאחר ההזדווגות, הפרד את הנקבה ואת היום הזה נחשב יום עובריים 0.5 (E 0.5). לפקח על העלייה במשקל של האישה ההרה פוטנציאליים ולבדוק חזותית את הבטן של העכברים כדי לאשר הריון. ב-14.5 בבוקר הייתה המתת החסד של העכברים הנשיים באמצעות נקע בצוואר הרחם.
3. מתחת למכסה המנוע, נגב את הבטן של האישה ההרה עם 70% אתנול. באמצעות מספריים סטרילי, לנתח את חלל הבטן ולהסיר את הקרניים הרחם המכיל את העוברים. באמצעות מלקחיים, בעדינות להוציא את העוברים בזמן לחתוך את רקמת הבטן שנותרה (6-12 עוברים בדרך כלל צפוי).
4. הניחו את קרני הרחם המכילות את העוברים בצלחת של 10 מ"מ ברקמת הרקמה. באמצעות מספריים סטרילי מלקחיים, לבצע חתך לאורך קרני הרחם כדי לבודד שקי בודדים נושאת העובר. בזהירות, במקום קרניים הרחם המכיל את שאר העוברים ב 30 מ ל של תמיסת מלח סטרילי מאוזנת של הנקס (HBSS) על הקרח.
5. לחתוך בעדינות את השק לבודד את העובר באמצעות מספריים סטרילי מלקחיים. להסיר את השליה על ידי חיתוך חבל הטבור.
6. . לערוף את ראשו של העובר
   הערה: בעוד שאר הרקמה העובריים יהיה מעובד נוסף, הרקמה מהראש העובר ישמש לבידוד ה-DNA עבור גנוהקלדה.
7. פתח את הבטן על ידי חיתוך קו האמצע של העובר באמצעות מספריים סטרילי מלקחיים. הסירו את אברי הקרביים, כגון הלב, הכבד והריאות.
8. להעביר את הרקמה העובארית הנותרים לתוך לוחית סטרילית 60 מ"מ רקמות רקמה וחותכים לחתיכות קטנות באמצעות מספריים או סכין גילוח. כדי לשבור את המקבצים לפתוח את התאים, להוסיף 3 מ ל טריפסין-EDTA (0.05%) ו הדגירה ב 37 ° צ' צלזיוס עבור 15 דקות.
9. לנטרל את טריפסין-EDTA על ידי הוספת 5 מ ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMG) עם 10% סרום העובר העוברי (FBS) ו 10 μx/mL פניצילין/סטרפטומיצין (עט/דלקת) לצלחת והנתק את הרקמה על ידי ליטוף חוזר (כ 20-30 פעמים).
10. לסובב את התאים ב 300 x g עבור 5 דקות ו-מחדש להשעות את הגלולה התא ב 4 מ ל של DMEM זיכרון עם 10% fbs ו 10 Μg/mL עט/דלקת. צלחת התאים על הצלחת תרבות 60 מ"מ, ותרבות התאים ב 37 ° c בנוכחות של 5% CO₂.
11. בצע את השלבים 3.5-3.10 עבור כל עובר.
12. התרבות MEFs השיגה בשלב 3.11 לפחות 3-4 ימים.
    הערה: בשלב זה, MEFs יכול גם להיות הקפאת שמורות לניסויים עתידיים.
13. כדי לקבוע את המין ואת הגנוטיפ של כל עובר, לבצע את ה-גנוהקלדה-PCR באמצעות דנ א מבודדים מראשי העוברים באמצעות תנאי התחל ו-PCR המפורטים בטבלה 1.

4. לאשר את העדר חלבון פלורסנט ירוק (GFP) ביטוי במוח של XistΔ: Mecp2/Xist: עכברים Mecp2-Gfp באמצעות מיון מבוסס תא המופעל בשיטת המיון

1. באמצעות מספריים, הפרד את קליפת המוח משאר האונות המוחית, ובמקום 1 מ ל של הקרח קר גרעיני מדיה בידוד (נים) מאגר המכיל 250 mM סוכות, 25 מ"מ אשלגן כלוריד (KCl), 5 מ"מ מגנזיום כלוריד (MgCl₂), 10 מ"מ טריס-Cl, שיושלם עם 2% פראפורמלדהיד (בתחתית), ו 0.1% nonionic החומר (טבלת חומרים).
2. הומוגון באמצעות מכשיר זכוכית קר-קרח.
3. ספין למטה רקמת הומוגניים ב 600 x g, 4 ° צ' עבור 5 דקות.
4. הסר supernatant ולהשהות את הגלולה ב 1 מ ל של 25% יודיקסנול בפתרון נים.
5. להוסיף 1 מ ל של 29% lodixanol בפתרון נים ל 4 מ"ל ultracentrifuge tube (חנות על הקרח עד הדגימות מוכנים) ובזהירות שכבה 1 מ ל של מדגם (ב 25% lodixanol).
6. צנטריפוגה ב 9,000 x g, 4 ° צ' עבור 10 דקות ב ultracentrifuge.
7. ולאחר מכן השעיית מחדש את הגלולה ב-500 μL של מיון תאים המופעל על ידי הפלואורסצנטית (FACS) מאגר (מלוחים המלח באגירה [PBS] שיושלם עם 1 מ"מ EDTA, 0.05% נתרן azide, ו 2% סרום שיסמין [BSA]).
   הערה: ניתן לאחסן דגימות ב-4 ° צ' או עד 1 שבוע.
8. הוסף 5 μL של 7-אמינו-אקטינומיצין D (7-עמ מ; 50 mg/mL) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכתים דנ א.
9. לנתח דגימות עבור 7-עמ ' חלבון פלורסנט ירוק (GFP) האות באמצעות הזרימה cy, לנסות.

5. קביעת הכדאיות של XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר עבור ההפעלה הראשונה של Xi

1. Seed 1 x 10⁵ תאים/mL נקבה XistΔ: Mecp2/xist: Mecp2-gfp mefs, Mecp2/Mecp2-gfp ו xist-Mecp2/Y mefs שהתקבל בשלב 3.12 בפורמט 6-טוב ובשקופיות קאמרית, ב-dmem עם 10% fbs ו 10 μg/mL עט/דלקת, ב 37 ° c ב נוכחות של 5% CO₂.
   הערה: Mecp2/Mecp2-Gfp ו Xist-Mecp2/Y mefs משמשים כפקדים חיוביים ושליליים בניסויים.
2. הוסף מדיום טרי לתאים לאחר 24 שעות. עבור XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp mefs, להוסיף בינוני בתוספת עם מעכבי XCIFs (למשל, 0.5 ΜM LDN193189 ו 2.5 ΜM GSK650394), או רכב לבד. החלף בינוני בתוספת עם מעכב או רכב טרי לבדו כל יומיים. עבור Mecp2/Mecp2-Gfp ו Xist-Mecp2/Y mefs, להוסיף מדיום טרי כל יומיים.
3. פוסט 1 שבוע של טיפול מעכב, הקציר MEFs גם עבור בידוד RNA (6-באר צלחת) או לתקן תאים לאימונולואואורנציה (שקופיות קאמרית). השתמש ב-MEFs בודד מ- Mecp2/Mecp2-Gfp כאשר עוברים חיובי ו -Xist-Mecp2/Y כפקדים שליליים בהתאמה.
   1. עבור בידוד RNA, לבודד RNA הכולל על ידי guanidinium מבוסס רנ א החילוץ מבוססי RNA, ולהפוך את הפוך באמצעות היפוך הטרנססקריפט. למדוד ביטוי Mecp2-Gfp על ידי היפוך כמותי הטרנססקריפט-Pcr (רביעיית-pcr) באמצעות Mecp2-WT ו Mecp2-gfp, ו התחל בלוח 1, כפי שמתואר בעבר¹².
   2. עבור immunofluorescence, כתם הכתמים עם נוגדן ראשוני אנטי gfp (1:100), כפי שמתואר בעבר^12,16. למדוד את עוצמת GFP על ידי אימונוXistΔ כמותיים לטיפול תרופתי : Mecp2/Xist: Mecp2-gfp mefs, כפי שמתואר בעבר¹⁸.

6. להדגים את ההפעלה הפרמקולוגית במוח של XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר

1. . הכן סמים ושליטה ברכב
   1. הכינו פתרון טרי וסטרילי של הרכב (0.9% הנאגל, 0.5% מתיל תאית, 4.5% diמתיל סולפוקסיד [DMSO]) עבור זריקות המוח.
   2. הכנת מעכבי כימיים כולל 1.5 mM LDN193189 (מולקולה קטנה מעכב של ACVR1) ו 1.6 mM GSK650394 (מולקולה קטנה מעכב של SGK1, המורד הזרם של PDPK1) מושעה מחדש ברכב (0.9% הנאגל, 0.5% מתילתאית, 4.5% DMSO), או רכב לבד. הנפח הכולל של מעכבי כימיים או רכב הוזרק הוא 10 μL לכל מינון לכל חיה.
2. . הכן חיה לזריקות מוחית
   1. הכן את אזור כירורגי על ידי ניגוב הספסל ומשטח חימום עם חיטוי (10% נתרן היפוכלוניט הפתרון).
   2. מורדם העכבר 4 השבוע עם הזרקה התוך הצפק של תערובת קטמין/xylazine במינון של 140 מ"ג/ק"ג ו 10 מ"ג/ק"ג, בהתאמה. השתמש ברפלקס הדוושה כדי לקבוע את רמת ההרדמה.
   3. החלת משחה אופטלמולוגית לעיניים בעקבות אינדוקציה של הרדמה כדי למנוע ייבוש הקרנית.
   4. לגלח את הפרווה מהצוואר עד ראש העכבר.
   5. למקם את העכבר בפלטפורמת סטריאוטקטיקה על ידי חיבור השיניים חותכת של העכבר בתוך החטיף של הרסן החוטם והידוק מהדק האף על החוטם תוך הבטחת כי הראש של העכבר הוא על מישור רמה.
   6. כוונן את גובה פסי האוזן, בהתאם לצורך, כדי להגיע לחלק caudal של תעלת האוזן, ומאבטח אותם כך שראש העכבר נמצא במישור ברמה ומתכוונן על מגע האצבע.
   7. לחטא את הראש של העכבר עם מגבונים לסירוגין של חיטוי אקטואלי, כגון povidone-יוד ו 70% אתנול.
3. . מנהל סמים
   1. באמצעות אזמל סטרילי, לעשות חתך אופקי 0.75 ס מ באמצע הקרקפת.
   2. באמצעות בר 0.45 מ"מ, לקדוח שני חורים סימטריים מעל האונות הימנית והשמאלית (2 מ"מ מן תפר משונן 2 מ"מ מתפר המדוגת, בערך באמצע עצם הקודקוד).
   3. הצמד מזרק של 10 μL לפלטפורמת הסטריאוטקטיקה בחוזקה.
   4. לערבב את הפתרון של מעכבי כימיים, ולצייר 10 μL של פתרון לתוך המזרק. הימנע בועות אוויר במזרק.
   5. מראש את המחט מזרק לתוך חור בגולגולת שמירה על המחט בניצב (90 °) לגולגולת. כאשר המחט החוצה את הגולגולת, לאפס את נקודות הציון על התצוגה הדיגיטלית סטריאוטקטיקה ולאחר מכן לקדם את קצה המחט עד שהוא מגיע לעומק של 2.5 מ"מ.
   6. משיכת המחט 0.5 מ"מ לעומק עבור 2 מ"מ.
   7. הכנס לאט את 10 μL של פתרון (~ 1 דקות). לאחר ההזרקה הושלמה, להשאיר את המחט במוח עבור ~ 1 דקות ולאחר מכן למשוך את המחט.
   8. חזרו על הזריקה לחצי הכדור השני (בקרת הרכב בלבד).
   9. באמצעות תפרים או "דבק עור" לסגור את העור של העכבר (אם הפצע הוא > 0.5 ס"מ שני תפרים ו" דבק העור "יש להשתמש).
   10. שחרר את פסי האוזן והסר את העכבר ממנגנון הסטריאוטקטיקה.
   11. ניהול משככי כאבים (בוטאורפין SR 0.5 mg/ק"ג) ומניחים את העכבר על כרית חימום שנקבעה ל-37 ° c עד שהחיה תחזור להכרה.
   12. ברגע שהעכבר הוא ערני ומגיב, העבר את החיה חזרה לכלוב המקורי.
   13. חזור על ההליך מדי יומיים במשך 20 יום. הקידוח החוזר של האזור אינו נדרש לזריקות הבאות.
4. . תבודד את מוח העכבר
   1. לאחר משטר המינון הושלמה, המתת החסד העכבר בחדר CO₂ .
   2. לשתק את העכבר על פני השטח באמצעות מחטים.
   3. לעשות חתך לרוחב דרך הקיר עור והבטן ממש מתחת לכלוב הצלעות באמצעות מספריים מלקחיים. . הפרידו בזהירות את הכבד מהסרעפת
   4. באמצעות מספריים, חותכים את הסרעפת וממשיכים לחתוך לאורך כל כלוב הצלעות כדי לחשוף את חלל הצפק.
   5. באמצעות מספריים, לבצע חתך לקצה האחורי של החדר השמאלי.
   6. מיד, התחל להזריק את חדר הלב הימני עם ~ 15 מ ל של PBS מעל ~ 2 דקות. צבע הכבד שינוי מאדום כדי ורוד בהיר מעיד על perfusion טוב.
   7. הכנס את התא הימני של לב העכבר עם ~ 10 mL של 4% פאראפורמלדהיד ב PBS מעל ~ 2 דקות.
   8. ערוף את ראשו של העכבר, ולהשתמש במספריים לעשות חתך באמצע קו של הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
   9. הניחו קצה אחד של המספריים לתוך מגנום האמן, וחתכו אותו לתוך הגולגולת לכיוון העין. . אני חוזר לצד השני נסו לשמור על סוף המספריים שטחיות ככל האפשר כדי למנוע פגיעה במוח.
   10. להשתמש במספריים כדי לחתוך את האזור בין העיניים ומעל האף של העכבר.
   11. השתמש מלקחיים כדי לקלף בעדינות את עצמות הגולגולת מהמיאונות במוח.
   12. הרם את המוח במרית, והשתמש במספריים כדי לנתח בזהירות את סיבי העצב הגולגולתית שיתקנו אותה לגולגולת.
   13. מניחים את המוח על צלחת פלסטיק, לגזור את נורות המוח ואת הריח, ולמקם את המוח לתוך 15 מ ל שפופרת מלא עם 4% בתחתית הוא PBS.
5. . מחלקת ההקפאה במוח העכבר
   1. לתקן את המוח ב 4% פאראפורמלדהיד ב-PBS ב 4 ° c בלילה.
   2. לשטוף את המוח עם PBS ב 4 ° צ' לפחות 3 x עבור 5 דקות כל אחד.
   3. סמן את התבניות החד החד-פעמיות עבור הקפאת הרקמות.
   4. חותכים את החלק הקדמי של המוח באמצעות מספריים מלקחיים (להתחיל לעשות ~ 5 מ"מ סעיפים מאתרי הזרקה).
   5. להעביר את המוח לקריוזקן עם החזית של המוח הפונה כלפי מטה כדי להשיג סעיפים ילתית. טבול את העובש המכיל את המוח בתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT).
   6. יוצקים חנקן נוזלי לצלחת מפלסטיק 10 מ"מ ומניחים את המוח בתבנית ההקפאה לתוך החנקן.
      הערה: חשוב לכוון את הרקמה כמתואר בשלב 6.5.5 כדי להנחות את הכיוון של המוח.
   7. כאשר OCT הוא לבן מוצק, מניחים את המוח הקפוא לתוך a-80 מקפיא ° c לאחסון.
   8. המוח עד 20 ° c לפחות 30 דקות לפני הפסקה עם קריוסטט ו קריומטר (5-6 יקרומטר עובי) המוח, הרכבה 2-3 סעיפים לכל שקופית. ניתן לאחסן שקופיות ב-80 ° צ' לשימוש מאוחר יותר.
6. לקבוע את ההפעלה העצמית באמצעות הגישה המבוססת על immunofluorescence.
   1. לפני שמתחילים בהליך ההכתמים, מייבשים את חתכי המוח ללילה ב -4 ° c.
   2. שקופיות לטבול בפתרון אחזור אנטיגן (0.1 m חומצת לימון, 0.1 M טריס-base, pH = 6.0) 100 על בלוק חום בגובה ° c עבור 5 דקות.
   3. לשטוף את השקופיות 4x עם 1x PBS עבור 5 דקות כל אחד בטמפרטורת החדר.
   4. לטבול שקופיות בפתרון חסימה (0.1 M NH₄CL/PBS/0.2% ג'לטין/0.05% nonionic) עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. לשטוף שקופיות 3 x עם מאגר לשטוף (PBS/0.2% ג'לטין) בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות כל אחד.
   6. כתם המוח סעיפים עם anti-GFP-AlexaFluor647 (1:100) ו anti-MAP2 (1:1000) נוגדנים ב דגירה בינונית (PBS/0.2% ג'לטין/1% BSA) ו דגירה ב 4 ° c לילה.
   7. לאסוף נוגדנים עיקריים (ניתן לעשות שימוש חוזר). לשטוף שקופיות 4x עם מאגר לשטוף עבור סך של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   8. דגירה סעיפים המוח עם עז נגד עוף Fluorescein isothiocyanate (FITC)-מסומן נוגדן משני (1:1000) ב דגירה בינונית ו דגירה 1-2-h בטמפרטורת החדר בחושך.
   9. לשטוף שקופיות 4x עם מאגר לשטוף עבור סך של 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   10. מקום טיפה של בינוני הרכבה עם 4 ′, 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) על מחליק 22 מ"מ x 50 מ"מ, ואז להפוך את coverslip על שקופית, כיסוי כל מקטעי רקמות.
   11. תמונה על מיקרוסקופ ולהתאים תמונות לניגודיות ובהירות. לכידת תמונות ולכמת את מספר התאים GFP-חיוביים עבור תרופות מטופלים והרכב שטופלו XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp המוח העכבר אונות.

תוצאות

כדי להדגים את הכדאיות של XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp מודל העכבר עבור לימודי ההפעלה מראש של XI, xcif מעכבי-בתיווך ההפעלה של xi מקושרים Mecp2-gfp נבדק העכבר מעובריים מתחלקים (mefs). הנקבה MEFs היו מבודדים מיום 15.5 XistΔ: Mecp2/Xist: Mecp2-Gfp העוברים כמתואר בסעיף 3 (איור 1a). הגנוטיפים של הנ...

Discussion

בעבר, XCIFs כי הם נדרשים באופן סלקטיבי עבור השתקה של גנים מקושרים Xi בתאי נשים ביונקים זוהו¹². אנחנו עוד אופטימיזציה מולקולה קטנה חזקה מעכבי כדי XCIFs היעד, כגון ACVR1 ו המורד הזרם של PDPK1, אשר ביעילות הפעלה מחדש של Xi Mecp2 בעכבר פיברוההדף קווים תא, נוירונים בקליפת העכבר, ו תא האדם פיברו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICE
Mecp2tm3.1Bird	The Jackson Laboratory	#014610
B6;129-Xist (tm5Sado)	provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle
REAGENTS
22x22 mm coverslip	FISHERfinest (Fisher Scientific)	125488
32% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S
50 ml syringe	Medline Industries	NPMJD50LZ
60mm culture dish	CellStar	628160
7-AAD	BioLegend	420403
ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Chemical	A661-3
anti-GFP-AlexaFluor647	Invitrogen	A-31852
anti-MAP2	Aves Labs	MAP
BSA	Promega	R396D
Buprenorphine SR	Zoopharm
citric acid	Sigma	C-1857
DMSO	Fisher Bioreagents	BP231-100
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Ethanol	Decon Labs	2701
fetal bovine serum (FBS)	VWR Life Science	89510-198
gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
glass slides	Fisherbrand	22-034-486
goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody	Aves Labs	F-1005
GSK650394	ApexBio	B1051
hamilton 10μl syringe	Hamilton Sigma-Aldrich	28615-U
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-092
Ketamine	Ketaset	NDC 0856-2013-01
Large blunt/blunt curved scissors	Fine Science Tools	14519-14
LDN193189	Cayman Chemicals	11802
lodixanol	Sigma	1343517
magnesium chloride (MgCl2)	Fisher Chemical	M35-212
Methylcelulose	Sigma	M0262-100G
mounting medium with DAPI	Vectashield	H-1200
Needle tip, 26 GA x 1.25"	PrecisionGlide	305111
ophthalmic ointment	Refresh Lacri-Lube	93468
optimal cutting temperature (O.C.T.)	ThermoFisher
PCR mix
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Corning	30-002-Cl
Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)	Corning Cellgro	46-103-CM
Potassium chloride (KCl)	Fisher Scientific	P330-500
scalpel blades
Shallow glass or plastic tray
skin glue/tissue adhesive	3M Vetbond	1469SB
sodium azide	Fisher Scientific	CAS 26628-22-8
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Chemical	S642-212
standard hemostat forceps	Fine Science Tools	13013-14
Standard tweezers	Fine Science Tools	11027-12
Straight iris scissors	Fine Science Tools	14058-11
sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Tris-base	Fisher Bioreagents	BP152-5
Triton X-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
Xylazine	Akorn	NDC: 59399-111-50
EQUIPMENT
Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope	Zeiss	Zeiss AxioObserver
0.45mm burr	IDEAL MicroDrill	67-1000
BD FACScalibur
centrifuge
glass homogenizer
cell culture incubator	Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i	13-998-213
Leica 3050S research cryostat
stereotactic platform
thermocycler
Timer
ultracentrifuge	Beckman Coulter Optima L-100 XP
Water bath (37 ºC)	Fisher Scientific Isotemp 2239