Un modello di mouse non casuale per la riattivazione farmacologica di MECP2 sul cromosoma X inattivo

Riepilogo

Qui, descriviamo un protocollo per generare un modello murino femminile vitale con inattivazione cromosomico X non casuale, cioè il cromosoma X ereditato dalla materna è inattivo nel 100% delle cellule. Descriviamo anche un protocollo per testare la fattibilità, la tollerabilità e la sicurezza della riattivazione farmacologica del cromosoma X inattivo in vivo.

Abstract

X inattivazione cromosoma (XCI) è il silenziamento casuale di un cromosoma X nelle femmine per raggiungere l'equilibrio di dosaggio genico tra i sessi. Di conseguenza, tutte le femmine sono eterozigoti per l'espressione genica legata alla X. Uno dei regolatori chiave di XCI è XIST, che è essenziale per l'avvio e la manutenzione di XCI. Studi precedenti hanno identificato 13 fattori di inattivazione del cromosoma X Trans-azione (XCIFs) utilizzando uno schermo genetico su larga scala e perdita di funzione. L'inibizione degli Xcif, come ACVR1 e PDPK1, mediante l'utilizzo di RNA a breve tornante o di piccoli inibitori delle molecole, riattiva i geni collegati al cromosoma X nelle cellule coltivate. Ma la fattibilità e la tollerabilità di riattivare il cromosoma X inattivo in vivo rimane da determinare. Verso questo obiettivo, un modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP è stato generato con XCI non casuali a causa della cancellazione di XIST su un cromosoma X. Utilizzando questo modello, l'estensione della riattivazione X inattiva è stata quantitata nel cervello del topo dopo il trattamento con inibitori XCIF. I risultati recentemente pubblicati mostrano, per la prima volta, che l'inibizione farmacologica di XCIFs riattiva MECP2 dal cromosoma X inattivo nei neuroni corticali del cervello del topo vivente.

Introduzione

L'inattivazione cromosoma x (XCI) è un processo di compensazione del dosaggio che bilancia l'espressione genica legata all'X silenziando una copia del cromosoma X nelle femmine¹. Di conseguenza, il cromosoma X inattivo (XI) accumula le caratteristiche tipiche dell'eterocromatina, inclusa la metilazione del DNA e le modifiche dell'istone inibitorio, come l'istone H3-lisina 27 trimetilazione (H3K27me3) e l'istone H2A ubiquitinazione (H2Aub) ². il regolatore principale del silenziamento cromosomico x è la regione del centro di inattivazione x (XIC), intorno a 100 − 500 KB, che controlla il conteggio e l'accoppiamento dei cromosomi x, la scelta casuale del cromosoma x per l'inattivazione, e l'inizio e la diffusione del silenziamento lungo il cromosoma X³. Il processo di inattivazione X è iniziato dalla trascrizione specifica X inattiva (XIST) che ricopre il XI in CIS per mediare il silenziamento a livello cromosoma e rimodellare la struttura tridimensionale del cromosoma x⁴. Recentemente, diversi schermi proteomici e genetici hanno identificato ulteriori regolatori di XCI, come le proteine interagenti XIST ^{5,6,7,8,9 , 10} il ^{, 11} il ^{, 12}. ad esempio, uno studio precedente che utilizza uno schermo di interferenza dell'RNA a livello di genoma imparziale ha identificato 13 fattori XCI transagionanti (xcif)¹². Meccanisticamente, XCIFs regolano l'espressione XIST e quindi, interferendo con la funzione xcifs provoca XCI¹²difettoso. Insieme, i recenti progressi nel campo hanno fornito importanti approfondimenti sui macchinari molecolari che sono necessari per avviare e mantenere XCI.

L'identificazione dei regolatori XCI e la comprensione del loro meccanismo in XCI è direttamente rilevante per le malattie dell'uomo legate all'X, come la sindrome di Rett (RTT)^13,14. La RTT è un raro disturbo dello sviluppo neurologico causato da una mutazione eterozigote nella proteina 2 (MECP2) legata al metil-CPG X-linked che colpisce prevalentemente le ragazze¹⁵. Poiché MECP2 si trova sul cromosoma X, le ragazze RTT sono eterozigoti per deficit di MECP2 con ~ 50% cellule che esprimono Wild-Type e ~ 50% esprimendo MECP2mutante. In particolare, le cellule mutanti RTT porto una copia dormiente ma Wild-Type di MECP2 sul XI, fornendo una fonte del gene funzionale, che se riattivato, potrebbe potenzialmente alleviare i sintomi della malattia. Oltre alla RTT, ci sono diverse altre malattie umane legate alla X, per le quali la riattivazione di XI rappresenta un potenziale approccio terapeutico, come la sindrome DDX3X.

L'inibizione di XCIFs, 3-fosfoinositide dipendente proteina chinasi-1 (PDPK1), e activina un recettore di tipo 1 (ACVR1), sia da RNA corto (shRNA) o piccoli inibitori di molecola, riattiva geni XI-Linked¹². La riattivazione farmacologica dei geni collegati a XI è osservata in vari modelli ex vivo che includono linee cellulari di fibroblasti del topo, neuroni corticali di topi adulti, fibromi embrionali del topo e linee cellulari di fibroblast derivate da un paziente RTT¹². Tuttavia, se la riattivazione farmacologica dei geni collegati a XI è fattibile in vivo rimane da dimostrare. Un fattore limitante è la mancanza di modelli animali efficaci per misurare accuratamente l'espressione dei geni da riattivato XI. Verso questo obiettivo, è stato generato un modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP che trasporta un MECP2 geneticamente etichettato su XI in tutte le cellule a causa dell'eliminazione eterozigote in XIST sul cromosoma X materno¹⁶. Utilizzando questo modello, l'espressione di MECP2 da XI è stata quantitata dopo il trattamento con inibitori di XCIFs nel cervello dei topi viventi. Qui è descritta la generazione del modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP e la metodologia per quantificare la riattivazione di XI nei neuroni corticali utilizzando saggi basati su immunofluorescenza.

Protocollo

Il lavoro che coinvolge i topi è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Virginia (IACUC; #4112).

1. generare un modello di mouse XCI non casuale con MECP2 geneticamente etichettato su Xi

Nota: Ceppi di topo utilizzati nello studio sono stati i seguenti: MECP2-GFP/MECP2-GFP (MECP2^{TM 3.1 uccello}, tabella dei materiali) e XIST/δxist (B6; 129-XIST < tm5Sado >; fornito da Antonio bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle). Le strategie di allevamento tra i rispettivi ceppi sono state progettate per espandere le colonie di topi per ogni ceppo.

1. Eseguire la genotipizzazione della PCR su tutti i ceppi di topi e le rispettive progenie ottenute dopo l'allevamento utilizzando primer specifici del gene elencati nella tabella 1.

2. progettare la strategia di allevamento del mouse per generare Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP

1. Impostare una coppia di allevamento con un MECP2-GFP/Y maschio e una femmina XistΔ-MECP2/XIST-MECP2 insieme (12 h/12 h: ciclo chiaro/scuro) (Figura 1a). Idealmente, impostare almeno 5 coppie di allevamento alla volta utilizzando topi vitali e fertili. Dopo che la femmina incinta partorì, le permettesse di sollevare la sua prima lettiera con il maschio.
   Nota: Poiché il paterno XIST Knockout altera gli XCI imstampati, la compensazione del dosaggio e le vie di differenziazione¹⁷, l'uso di topi Xistδ-MECP2/Y nell'allevamento non produrrà i cuccioli femminili con il genotipo richiesto.
2. Dopo lo svezzamento della lettiera al giorno 21 post-natale (p21), identificare e contrassegnare i cuccioli di Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP femmina utilizzando un saggio di genotipo basato sulla PCR (Figura 1B).
   Nota: In termini di numero di animali necessari per gruppo, per i risultati riportati di seguito, sono state create 5 coppie di allevamento che hanno generato circa 10 femmine Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP topi.
3. Utilizzare modelli di mouse femminili per tutti gli esperimenti proposti.
   Nota: Il sesso è una variabile biologica importante per gli studi XCI, e il modello maschile non rappresenta gli effetti confondenti di XCI casuali.
4. Per essere coerenti in tutti gli studi sugli animali e escludere qualsiasi effetto dell'età animale, eseguire tutti gli esperimenti in 5 − 8-settimana-vecchia femmina Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP topi.

3. isolare Xistδ femminile: MECP2/XIST: MECP2-GFP fibroblasti embrionali del topo (MEFs)

1. Impostare l'accoppiamento temporizzato tra il MECP2-GFP/Y maschio e Xistδ-MECP2/XIST-MECP2 femmina. Impostare almeno 3 − 4 gabbie di accoppiamento per aumentare la probabilità di gravidanza.
2. Dopo aver confermato la spina vaginale la mattina dopo l'accoppiamento, separare la femmina e questo giorno è considerato embrionale giorno 0,5 (E 0.5). Monitorare l'aumento di peso della futura femmina incinta e ispezionare visivamente l'addome dei topi per confermare la gravidanza. Su e 14.5 − 15.5, eutanasia i topi femminili gravidi attraverso la lussoposizione cervicale.
3. Sotto una cappa laminare, pulire l'addome della femmina incinta con 70% di etanolo. Utilizzando forbici sterili, sezionare la cavità addominale e rimuovere le corna uterina contenenti gli embrioni. Usando le pinze, estrarre delicatamente gli embrioni durante il taglio del tessuto addominale rimanente (si prevede solitamente l'uso di 6 − 12 embrioni).
4. Collocare le corna uterina contenenti gli embrioni in un piatto di coltura tissutale di 10 mm. Usando forbici e pinze sterili, fai un'incisione lungo le corna uterina per isolare le singole sacche che trasportano un embrione. Con cautela, collocare le corna uterini contenenti il resto degli embrioni in 30 mL di soluzione salina equilibrata di Hanks (HBSS) sul ghiaccio.
5. Tagliare delicatamente aprire il sacco e isolare l'embrione utilizzando forbici sterili e pinze. Rimuovere la placenta tagliando il cordone ombelicale.
6. Decapitate l'embrione.
   Nota: Mentre il resto del tessuto embrionale sarà ulteriormente elaborato, il tessuto della testa dell'embrione sarà utilizzato per isolare il DNA per la genotipizzazione.
7. Aprire l'addome tagliando la linea mediana dell'embrione utilizzando forbici e pinze sterili. Rimuovere gli organi viscerali, come il cuore, fegato, e polmoni.
8. Trasferire il tessuto embrionale rimanente in una piastra di coltura tissutale sterile da 60 mm e tagliare in piccoli pezzi utilizzando forbici o una lama per rasoio. Per rompere aprire i grumi di cellule, aggiungere 3 mL di tripsin-EDTA (0,05%) e incubare a 37 ° c per 15 min.
9. Neutralizzare la tripsina-EDTA aggiungendo 5 mL del medium Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e 10 μg/mL di penicillina/streptomicina (Pen/STREP) alla piastra e dissociare il tessuto mediante Pipettaggio ripetitivo (circa 20 − 30 volte).
10. Girare verso il basso le cellule a 300 x g per 5 min e risospendere il pellet cellulare in 4 ml di DMEM con 10% FBS e 10 μg/ml Pen/Strep. Piastra le cellule su un piatto di coltura 60 mm, e la coltura le cellule a 37 ° c in presenza di 5% CO₂.
11. Eseguire i passaggi 3.5 − 3.10 per ciascun embrione.
12. I MEF della coltura ottenuti al passo 3,11 per almeno 3 − 4 giorni.
    Nota: In questa fase, i MEF possono anche essere criopriservati per esperimenti futuri.
13. Per determinare il sesso e il genotipo di ciascun embrione, eseguire la genotipo-PCR utilizzando il DNA isolato dalle teste degli embrioni utilizzando primer e condizioni di PCR elencate nella tabella 1.

4. confermare la mancanza di espressione di proteina fluorescente verde (GFP) nel cervello di Xistδ: MECP2/XIST: topi MECP2-GFP utilizzando un saggio basato sulla selezione delle cellule attivato da Ffluorescenza

1. Utilizzando le forbici, separare la corteccia cerebrale dal resto degli emisferi cerebrali, e mettere in 1 mL di ghiaccio-freddo nuclei isolamento media (NIM) tampone contenente 250 mM di saccarosio, 25 mM di cloruro di potassio (KCl), 5 mM di cloruro di magnesio (MgCl₂), 10 mm Tris-Cl, integrato con 2% paraformaldeide (PFA), e 0,1% tensioattivo non ionico (tabella dei materiali).
2. Omogeneizzare con un omogeneizzatore di vetro ghiacciato.
3. Girare verso il basso il tessuto omogeneizzato a 600 x g, 4 ° c per 5 min.
4. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di iodixanol al 25% in soluzione NIM.
5. Aggiungere 1 ml di lodixanol al 29% in soluzione NIM a un tubo ultracentrifuga da 4 ml (conservare su ghiaccio fino a quando i campioni sono pronti) e accuratamente strato 1 ml di campione (in 25% lodixanol).
6. Centrifugare a 9.000 x g, 4 ° c per 10 min in un Ultracentrifuge.
7. Aspirare l'aspirato surnatante e risospendere il pellet in 500 μL di tampone di cernita delle cellule attivate a fluorescenza (FACS) (soluzione salina tamponata con fosfato [PBS] integrata con EDTA da 1 mM, 0,05% di sodio azide e 2% di albumina sierica bovina [BSA]).
   Nota: I campioni possono essere conservati a 4 ° c o fino a 1 settimana.
8. Aggiungere 5 μL di 7-amino-actinomycin D (7-AAD; 50 mg/mL) per 5 minuti a temperatura ambiente per macchiare il DNA.
9. Analizzare i campioni per il segnale 7-AAD e proteina fluorescente verde (GFP) usando la citometria a flusso.

5. determinare la fattibilità del modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP per la riattivazione XI

1. Seme 1 x 10⁵ cellule/ml femmina Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP MEFs, MECP2/MECP2-GFP e XIST-MECP2/Y MEFs ottenuti nel passo 3,12 in un formato 6-Well e in diapositive a camera, in DMEM con 10% FBS e 10 μg/ml Pen/STREP, a 37 ° c nel presenza di 5% CO₂.
   Nota: MECP2/MECP2-GFP e XIST-MECP2/Y MEFs vengono utilizzati come controlli positivi e negativi negli esperimenti.
2. Aggiungere il mezzo fresco alle cellule dopo 24 h. Per Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP MEFs, aggiungere mezzo integrato con XCIFs inibitori (ad esempio, 0,5 μm LDN193189 e 2,5 μm GSK650394), o veicolo da solo. Sostituire il mezzo con un nuovo inibitore o un veicolo da solo ogni 2 giorni. Per MECP2/MECP2-GFP e XIST-MECP2/Y MEFs, aggiungere un mezzo fresco ogni 2 giorni.
3. Post 1 settimana di trattamento con inibitori, raccogliere MEF sia per l'isolamento dell'RNA (6-pozzetto piastra) o fissare le cellule per immunofluorescenza (diapositive camera). Utilizzare i MEF isolati da embrioni MECP2/MECP2-GFP come embrioni positivi e XIST-MECP2/Y come controlli negativi rispettivamente.
   1. Per l'isolamento dell'RNA, isolare l'RNA totale dal reagente di estrazione dell'RNA basato su tiocianato di guanidinio e trascrittasi inversa utilizzando la trascriptasi inversa. Misurare l'espressione MECP2-GFP in base alla PCR trascrittasi inversa quantitativa (qRT-PCR) utilizzando MECP2-WT e MECP2-GFP e i primer elencati nella tabella 1, come descritto in precedenza¹².
   2. Per immunofluorescenza, macchia MEFs con un anticorpo primario anti-GFP (1:100), come descritto in precedenza^12,16. Misurare l'intensità di GFP per immunofluorescenza quantitativa nel farmaco trattato con Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP MEFs, come descritto in precedenza¹⁸.

6. dimostrare la riattivazione farmacologica di XI nel cervello del Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP modello del mouse

1. Preparare i farmaci e il controllo del veicolo.
   1. Preparare una soluzione fresca e sterile di veicolo (0,9% NaCl, 0,5% metilcellulosa, 4,5% dimetilsolfossido [DMSO]) per iniezioni cerebrali.
   2. Preparare gli inibitori chimici tra cui 1,5 mM LDN193189 (piccolo inibitore di molecola di ACVR1) e 1,6 mM GSK650394 (piccolo inibitore di molecola di SGK1, un Effettuatore a valle di PDPK1) risospeso nel veicolo (0,9% NaCl, 0,5% metilcellulosa, 4,5% DMSO), o veicolo soltanto. Il volume totale di inibitori chimici o di veicoli iniettati è di 10 μL per dose per animale.
2. Preparare l'animale per iniezioni di cervello.
   1. Preparare l'area chirurgica asciugando il banco e il tampone riscaldante con disinfettante (soluzione di ipoclorito di sodio al 10%).
   2. Anestetizzare il topo di 4 settimane con un'iniezione intraperitoneale della miscela di chetamina/xylazina alla dose di 140 mg/kg e 10 mg/kg, rispettivamente. Utilizzare il riflesso di prelievo del pedale per determinare il livello di anestesia.
   3. Applicare unguento oftalmico agli occhi dopo induzione di anestesia per prevenire l'essiccazione corneale.
   4. Rasare la pelliccia dal collo alla parte superiore della testa del mouse.
   5. Posizionare il mouse nella piattaforma stereotassica agganciando i denti incisivi del mouse nella barra del morso del blocco del muso e stringendo il morsetto del naso sopra il muso, assicurando che la testa del mouse sia su un piano di livello.
   6. Regolare l'altezza delle barre dell'orecchio, se necessario, per raggiungere la porzione caudale del canale uditivo, assicurandole tale che la testa del mouse sia in un piano di livello e immobilizzata sul tocco delle dita.
   7. Disinfettare la testa del topo con salviette alterne di un antisettico d'attualità, come povidone-iodio e 70% etanolo.
3. Somministrare farmaci.
   1. Utilizzando un bisturi sterile, fare un'incisione orizzontale di 0,75 cm nella metà del cuoio capelluto.
   2. Utilizzando una bava da 0,45 mm, praticare due fori simmetrici sopra gli emisferi corticali destro e sinistro (2 mm dalla sutura sagittale e 2 mm dalla sutura lambdoide, approssimativamente la metà dell'osso parietale).
   3. Fissare saldamente una siringa da 10 μL alla piattaforma stereotassica.
   4. Miscelare la soluzione di inibitori chimici e aspirare 10 μL di soluzione nella siringa. Evitare eventuali bolle d'aria nella siringa.
   5. Far avanzare l'ago della siringa nel buco del Burr mantenendo l'ago perpendicolare (90 °) al cranio. Quando l'ago attraversa il cranio, azzerare le coordinate sul display digitale stereotassico e poi avanzare la punta dell'ago fino a raggiungere una profondità di 2,5 mm.
   6. Prelevare l'ago 0,5 mm alla profondità per 2 mm.
   7. Iniettare lentamente 10 μL di soluzione (~ 1 min). Dopo l'iniezione è completa, lasciare l'ago nel cervello per ~ 1 min e quindi prelevare l'ago.
   8. Ripetere l'iniezione per il secondo emisfero (controllo solo veicolo).
   9. Utilizzando suture o "colla cutanea" chiudere la pelle del topo (se la ferita è > 0.5 cm devono essere usate entrambe le suture e "colla cutanea").
   10. Allentare le barre auricolari e rimuovere il mouse dall'apparato stereotassivo.
   11. Somministrare analgesici (buprenorfina SR 0,5 mg/kg IP) e posizionare il mouse su un tampone riscaldante impostato a 37 ° c fino a quando l'animale riprende coscienza.
   12. Una volta che il mouse è vigile e reattivo, trasferire l'animale torna alla sua gabbia originale.
   13. Ripetere la procedura ogni 2 giorni per 20 giorni. La foratura ripetuta dell'area non è necessaria per le successive iniezioni.
4. Isolare il cervello del topo.
   1. Una volta completato il regime posologico, eutanasia il topo in una camera co₂ .
   2. Immobilizzare il mouse su una superficie utilizzando aghi.
   3. Fare un'incisione laterale attraverso l'tegumento e la parete addominale appena sotto la gabbia toracica utilizzando forbici e pinze. Separare accuratamente il fegato dal diaframma.
   4. Utilizzando le forbici, tagliare il diaframma e continuare a tagliare lungo l'intera lunghezza della gabbia toracica per esporre la cavità pleurica.
   5. Usando le forbici, fai un'incisione all'estremità posteriore del ventricolo sinistro.
   6. Immediatamente, iniziare a iniettare la camera cardiaca a destra con ~ 15 mL di PBS oltre ~ 2 min. il cambiamento di colore del fegato dal rosso al rosa pallido è indicativo di una buona perfusione.
   7. Iniettare la camera giusta del cuore del topo con ~ 10 mL di 4% paraformaldeide in PBS su ~ 2 min.
   8. Decapitate il mouse e usate le forbici per fare un'incisione della linea mediana del cuoio capelluto per esporre il cranio.
   9. Posiziona una punta delle forbici nel foramen magnum e tagliale lateralmente nel cranio verso l'occhio. Ripeti per l'altro lato. Cercate di mantenere la fine delle forbici il più superficiale possibile per evitare lesioni del cervello.
   10. Utilizzare le forbici per tagliare la regione tra gli occhi e sopra il naso del mouse.
   11. Utilizzare pinze per sbucciare delicatamente le ossa craniali dagli emisferi cerebrali.
   12. Sollevare il cervello con una spatola, e utilizzare le forbici per sezionare attentamente le fibre nervose craniali che fissano al cranio.
   13. Posiziona il cervello su un piatto di plastica, Ritaglia il cervelletto e le lampadine olfattive e posiziona il cervello in un tubo da 15 mL riempito con il 4% di PFA è PBS.
5. CRIO-sezione il cervello del topo.
   1. Fissare il cervello in 4% paraformaldeide in PBS a 4 ° c durante la notte.
   2. Sciacquare il cervello con PBS a 4 ° c almeno 3x per 5 min ciascuno.
   3. Etichettare gli stampi monouso per la criopreservazione dei tessuti.
   4. Tagliare la parte anteriore del cervello utilizzando forbici e pinze (iniziare a fare ~ sezioni di 5 mm da siti di iniezione).
   5. Trasferire il cervello al criomantico con la parte anteriore del cervello rivolta verso il basso per ottenere sezioni coronali. Immergere lo stampo contenente il cervello nel composto di temperatura di taglio ottimale (OCT).
   6. Versare l'azoto liquido in una capsula di Petri in plastica da 10 mm e collocare il cervello nel crio-stampo nell'azoto.
      Nota: È importante orientare il tessuto come descritto nel passo 6.5.5 per guidare il sezionamento del cervello.
   7. Quando il OCT è bianco fisso, posizionare il cervello congelato in un congelatore-80 ° c per la conservazione.
   8. Equilibrare il cervello a-20 ° c per almeno 30 minuti prima del sezionamento con criostato e criosezione (spessore 5 − 6 μm) del cervello, montaggio 2 − 3 sezioni per diapositiva. I vetrini possono essere conservati a-80 ° c per un uso successivo.
6. Determinare la riattivazione di XI utilizzando un approccio basato su immunofluorescenza.
   1. Prima di iniziare la procedura di colorazione, asciugare le sezioni cerebrali durante la notte a 4 ° c.
   2. Immergere i vetrini nella soluzione di recupero dell'antigene (0,1 acido citrico M, 0,1 M Tris-base, pH = 6,0) su un blocco di calore di 100 ° c per 5 min.
   3. Lavare i vetrini 4x con 1x PBS per 5 min ciascuno a temperatura ambiente.
   4. Immergere i vetrini nella soluzione di bloccaggio (0,1 M NH₄CL/PBS/0,2% gelatina/0,05% tensioattivo non ionico) per 20 minuti a temperatura ambiente.
   5. Lavare i vetrini 3x con tampone di lavaggio (PBS/0,2% gelatina) a temperatura ambiente per 5 min ciascuno.
   6. Sezioni del cervello macchia con anticorpi anti-GFP-AlexaFluor647 (1:100) e anti-MAP2 (1:1000) nel mezzo di incubazione (PBS/0,2% gelatina/1% BSA) e incubare a 4 ° c durante la notte.
   7. Raccogliere gli anticorpi primari (possono essere riutilizzati). Lavare i vetrini 4x con tampone di lavaggio per un totale di 30 min a temperatura ambiente.
   8. Incubare sezioni cerebrali con capra anti-pollo fluoresceina isotiocianato (FITC)-etichettato anticorpo secondario (1:1000) in incubazione di mezzo e incubare 1 − 2 h a temperatura ambiente al buio.
   9. Lavare i vetrini 4x con tampone di lavaggio per un totale di 30 min a temperatura ambiente.
   10. Posizionare una goccia di supporto di montaggio con 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) su un coprioggetti da 22 mm x 50 mm, quindi invertire il coprioggetti sul vetrino, coprendo tutte le sezioni di tessuto.
   11. Immagine al microscopio e regolare le immagini per contrasto e luminosità. Cattura le immagini e quantifica il numero di cellule positive di GFP sia per il trattamento farmacologico che per il veicolo trattato con Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP emisferi cerebrali del topo.

Risultati

Per dimostrare la fattibilità del modello di mouse Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP per gli studi di riattivazione XI, la riattivazione xcif inibitore-mediata di XI-Linked MECP2-GFP è stata testata nei fibroblasti embrionali di topo (MEFs). I MEF femminili sono stati isolati dal giorno 15,5 Xistδ: MECP2/XIST: MECP2-GFP embrioni come descritto nella sezione 3 (Figura 1a). I genotipi di Xistδ femminile: MECP2/XIST: MECP2-GFP MEFs sono st...

Discussione

In precedenza, gli Xcif che sono selettivamente necessari per il silenziamento dei geni collegati a Xi nelle cellule femminili di mammiferi sono stati identificati¹². Abbiamo ulteriormente ottimizzato potenti inibitori di piccole molecole per indirizzare gli Xcif, come ACVR1 e gli effettori a valle di PDPK1, che riattivano in modo efficiente i MECP2 collegati a Xi nelle linee cellulari di fibroblasti del topo, i neuroni corticali del topo e una cellula fibroblastica umana una linea deriva...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICE
Mecp2tm3.1Bird	The Jackson Laboratory	#014610
B6;129-Xist (tm5Sado)	provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle
REAGENTS
22x22 mm coverslip	FISHERfinest (Fisher Scientific)	125488
32% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S
50 ml syringe	Medline Industries	NPMJD50LZ
60mm culture dish	CellStar	628160
7-AAD	BioLegend	420403
ammonium chloride (NH4Cl)	Fisher Chemical	A661-3
anti-GFP-AlexaFluor647	Invitrogen	A-31852
anti-MAP2	Aves Labs	MAP
BSA	Promega	R396D
Buprenorphine SR	Zoopharm
citric acid	Sigma	C-1857
DMSO	Fisher Bioreagents	BP231-100
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Ethanol	Decon Labs	2701
fetal bovine serum (FBS)	VWR Life Science	89510-198
gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
glass slides	Fisherbrand	22-034-486
goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody	Aves Labs	F-1005
GSK650394	ApexBio	B1051
hamilton 10μl syringe	Hamilton Sigma-Aldrich	28615-U
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14025-092
Ketamine	Ketaset	NDC 0856-2013-01
Large blunt/blunt curved scissors	Fine Science Tools	14519-14
LDN193189	Cayman Chemicals	11802
lodixanol	Sigma	1343517
magnesium chloride (MgCl2)	Fisher Chemical	M35-212
Methylcelulose	Sigma	M0262-100G
mounting medium with DAPI	Vectashield	H-1200
Needle tip, 26 GA x 1.25"	PrecisionGlide	305111
ophthalmic ointment	Refresh Lacri-Lube	93468
optimal cutting temperature (O.C.T.)	ThermoFisher
PCR mix
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Corning	30-002-Cl
Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS)	Corning Cellgro	46-103-CM
Potassium chloride (KCl)	Fisher Scientific	P330-500
scalpel blades
Shallow glass or plastic tray
skin glue/tissue adhesive	3M Vetbond	1469SB
sodium azide	Fisher Scientific	CAS 26628-22-8
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Chemical	S642-212
standard hemostat forceps	Fine Science Tools	13013-14
Standard tweezers	Fine Science Tools	11027-12
Straight iris scissors	Fine Science Tools	14058-11
sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
Tris-base	Fisher Bioreagents	BP152-5
Triton X-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
Xylazine	Akorn	NDC: 59399-111-50
EQUIPMENT
Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope	Zeiss	Zeiss AxioObserver
0.45mm burr	IDEAL MicroDrill	67-1000
BD FACScalibur
centrifuge
glass homogenizer
cell culture incubator	Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i	13-998-213
Leica 3050S research cryostat
stereotactic platform
thermocycler
Timer
ultracentrifuge	Beckman Coulter Optima L-100 XP
Water bath (37 ºC)	Fisher Scientific Isotemp 2239