Un método de congelación y descongelación para preparar hidrogeles de chitosan-poly (alcohol de vinilo) sin agentes reticulantes y estudios de liberación difluídor

Resumen

El método de congelación y descongelación se utiliza para producir hidrogeles de quitosano-polisino (alcohol de vinilo) sin agentes reticulantes. Para este método, es importante tener en cuenta las condiciones de congelación (temperatura, número de ciclos) y la relación polímero, que pueden afectar a las propiedades y aplicaciones de los hidrogeles obtenidos.

Resumen

Los hidrogeles de chitosan-poli (alcohol de vinilo) se pueden producir mediante el método de congelación de sin necesidad de reticulación. Las aplicaciones de estos sistemas están limitadas por sus características (por ejemplo, porosidad, flexibilidad, capacidad de hinchazón, carga de fármacos y capacidad de liberación de fármacos), que dependen de las condiciones de congelación y del tipo y la proporción de polímeros. Este protocolo describe cómo preparar hidrogeles a partir de quitosano y poli(alcohol de vinilo) a 50/50 p/p % de la composición del polímero y variar la temperatura de congelación (-4 oC, -20 oC, -80 oC) y ciclos de congelación (4, 5, 6 ciclos de congelación). Se obtuvieron espectros FT-IR, micrografía SEM y datos de porosimetría de hidrogeles. Además, se evaluó la capacidad de hinchazón y la carga y liberación de fármacos. Los resultados de las micrografías SEM y la porosimetría muestran que el tamaño de los poros disminuye, mientras que la porosidad aumenta a temperaturas más bajas. El porcentaje de hinchazón fue mayor a la temperatura de congelación menor. Se ha estudiado la liberación de difluunisal de los hidrogeles. Todas las redes mantienen la liberación de fármacos durante 30 h y se ha observado que un simple mecanismo de difusión regula la liberación difluunista según los modelos Korsmeyer-Peppas e Higuchi.

Introducción

Recientemente, los hidrogeles han atraído gran interés en el campo biomédico porque son redes tridimensionales con alto contenido de agua y son suaves y flexibles, por lo que pueden imitar los tejidos naturales fácilmente¹. Además, no se disuelven en medio acuoso a temperatura fisiológica y pH, pero presentan una gran hinchazón². Los hidrogeles pueden actuar como andamios de ingeniería de tejidos, productos de higiene, lentes de contacto y vendajes para heridas; porque pueden atrapar y liberar compuestos activos y drogas, se utilizan como sistemas de administración de medicamentos³. Dependiendo de su aplicación, los hidrogeles pueden estar hechos de polímeros naturales o sintéticos, o una combinación de ambos, con el fin de obtener las mejores características⁴.

Las propiedades de los hidrogeles son consecuencia de muchos factores físicos y químicos. A nivel físico, su estructura y morfología dependen de su porosidad, tamaño de poro y distribución de poros^5. A nivel químico y molecular, el tipo de polímero, el contenido del grupo hidrófilo en la cadena de polímeros, el tipo de punto de reticulación y la densidad de reticulación son los factores que determinan la capacidad de hinchazón y las propiedades mecánicas^6,7.

Según el tipo de agente reticulante utilizado para formar la red, los hidrogeles se clasifican como hidrogeles químicos o hidrogeles físicos. Los hidrogeles químicos se unen a las interacciones covalentes entre sus cadenas, que se forman a través de la irradiación UV y gamma o utilizando un agente reticulante^7,8. Los hidrogeles químicos suelen ser fuertes y resistentes pero, generalmente, el agente reticulante es tóxico para las células y su eliminación es difícil, por lo que su aplicación es limitada. Por otro lado, los hidrogeles físicos se forman por la conexión de las cadenas de polímeros a través de interacciones no covalentes, evitando el uso de agentes reticulantes^4,9. Las principales interacciones no covalentes en la red son las interacciones hidrofóbicas, las fuerzas electrostáticas, los límites complementarios e hidrógeno⁷.

Poly(alcohol vinílico) (PVA, Figura 1a) es un polímero sintético y soluble en agua con excelente rendimiento mecánico y biocompatibilidad que puede de los hidrogeles libres de agentes de reticulación a través del método de congelación^10,11. Este polímero tiene la capacidad de formar zonas concentradas de enlaces de hidrógeno entre grupos -OH de sus cadenas (zonas cristalinas) cuando se están congelando¹². Estas zonas cristalinas actúan como puntos de reticulación en la red, y son promovidas por dos eventos: el acercamiento de las cadenas de polímeros cuando el agua cristalina se expande y la conformación del PVA cambia de isotáctica a sindiotáctica PVA durante la congelación¹³. Debido al liofilizador, los cristales de agua se subliman, dejando espacios vacíos que son los poros en el hidrogel¹⁴. Para obtener hidrogeles con mejores propiedades, PVA se puede combinar fácilmente con otros polímeros.

En ese sentido, el quitosano constituye una opción, ya que es el único biopolímero de fuentes naturales con cargas positivas. Se obtiene mediante la deacetilación de la quitina y se compone de combinaciones aleatorias de D-glucosamina (unidad deacetilada) y N-acetil-D-glucosamina (unidad acetilada)^15,16 (Figura 1b). El quitosano es biodegradable por las enzimas humanas y es biocompatible. Además, por su naturaleza catiónica, puede interactuar con la carga negativa de la superficie celular, y esta propiedad se ha asociado con su actividad antimicrobiana¹⁷. Este polímero es fácil de procesar; sin embargo, sus propiedades mecánicas no son suficientes y se han añadido algunos materiales para formar complejos con mejores características.

Teniendo en cuenta las características específicas de chitosan y PVA, la fabricación exitosa de hidrogeles ha sido alcanzada por el método de congelación-descongelación^2,18 para evitar el uso de agentes reticulantes tóxicos. En los hidrogeles de quitosano-PVA, también se forman las zonas cristalinas de PVA, y las cadenas de quitosano se interpenetran y forman simples enlaces de hidrógeno con grupos -NH₂ y grupos -OH en PVA. El hidrogel chitosan-PVA final es mecánicamente estable, con altas tasas de hinchazón y baja toxicidad, y con efecto antibacteriano¹⁸. Sin embargo, dependiendo de las condiciones de congelación utilizadas en la preparación (temperatura, tiempo y número de ciclos), las características finales pueden cambiar. Algunos estudios informan que aumentar el número de ciclos de congelación disminuye el grado de hinchazón y aumenta la resistencia a la tracción^19,20. Con el fin de fortalecer la red, otros agentes como la radiación gamma y UV y los retiticores químicos se han utilizado adicionalmente después de la preparación congelada^21,22,23. Los hidrogeles con una mayor proporción de quitosano tienen una red más porosa y una alta capacidad de hinchazón, pero menos resistencia y estabilidad térmica. En este contexto, es importante tener en cuenta las condiciones de preparación para obtener hidrogeles adecuados para su aplicación objetivo.

El objetivo de este trabajo es presentar en detalle cómo las condiciones de congelación (temperatura de congelación y número de ciclos) afectan a las características finales de los hidrogeles CS-PVA. Se evaluaron los espectros FT-IR, las características morfológicas y de porosidad y la capacidad de hinchazón, así como la capacidad de carga y liberación de fármacos. En los estudios de liberación, diflunisal(Figura 1c) se utilizó como fármaco modelo, debido a su tamaño adecuado a la estructura de hidrogel.

Protocolo

1. Preparación de hidrogeles de quitosano-PVA

1. Prepare 2% (p/p) de chitosano y 10% (p/w) soluciones de PVA. Disolver 0,2 g de quitosano en 10 ml de solución COOH de 0,1 M CH₃(previamente filtrada) a temperatura ambiente y mantener la agitación mecánica continua durante la noche. Disolver 1 g de PVA en 10 ml de agua destilada y remover a 80oC durante 1 h.
2. Mezclar ambas soluciones 1:1 utilizando un agitador magnético hasta que sean homogéneos a temperatura ambiente, y verter las mezclas en los platos de Petri. Deje las muestras durante 2 h a presión atmosférica a desgasificación.
3. Congelar los hidrogeles a -4 oC, -20 oC o -80 oC durante 20 h y 4 ciclos (muestras CP4-4, CP4-20 y CP4-80, respectivamente). Congele otro hidrogel a -80 oC durante 20 h utilizando 5 o 6 ciclos de congelación (muestras CP5-80 y CP6-80). Después del tercer ciclo de congelación, lave los hidrogeles con agua desionizada. Al final, secar los hidrogeles a -46oC durante 48 h y almacenarlos para su posterior caracterización (metodología adaptada a partir de^2).

2. Caracterización FT-IR

1. Coloque una pequeña pieza (1 mm x 2 mm) de hidrogel en el espectrómetro FT-IR en modo ATR. Tome los espectros FT-IR de 4000 a 600 cm^-1 (2 cm^-1 de resolución y promedio de 32 escaneos).

3. Ensayos de hinchazón

1. Corte los discos (13 mm de diámetro y 10 mm de altura) del hidrogel y pesínlos. Incubar los discos en 50 ml de agua desionizada con agitación a 25oC. Repita tres veces.
2. Cada 30 minutos retire la muestra del medio, blotter para eliminar el exceso de agua, y pesar. Calcular el grado de hinchazón utilizando la ecuación 1 y calcular el estado de equilibrio de la hinchazón, , a 24 h utilizando la ecuación 2.
   )
   ¿Dónde está el peso del hidrogel seco y es el peso del hidrogel húmedo.
   

4. Microscopía electrónica

1. Cubra un pequeño trozo de hidrogel con una fina capa de oro (30 s y 10 mA) en una capa de esputo.
2. Coloque la muestra en un microscopio electrónico de barrido (SEM). Analice las muestras en vacío a 20 kV y tome las imágenes con un aumento de 500x y 1500x.

5. Porosimetría

1. Coloque discos de 15 mm de diámetro con un peso aproximado de 0,26 g en el penetrómetro (un penetrómetro sólido, con un volumen a granel de 0,3660 ml y 5,7831 ml de volumen del vástago). Analice la porosidad y el tamaño de los poros por Mercury Intrusion Porosimetry (MIP).
2. Lleve a cabo el experimento en el modo histéresis (intrusión-extrusión). Mida el volumen total de intrusión (mL/g), el área total de los poros (m²/g), el diámetro de los poros (m), la porosidad (%), la permeabilidad (mDarcy) y la tortuosidad. Repita dos veces.

6. Carga y liberación de medicamentos

1. Antes de cargar, prepare 4 L de 15 mg/L de solución diflundía y revuelva durante la noche. Confirmar la concentración de la solución mediante espectroscopia UV-Vis (concentración inicial). De hecho, se hinchan 400 mg de muestras liofilizadas de hidrogel en 6 ml de agua destilada durante 24 h.
2. Para la carga, llenar un matraz con 50 ml de solución diflunisal y mantener a 25oC con agitación constante. Sumerja cada hidrogel hinchado en el matraz.
   1. Tomar alícuotas de la solución difluunista restante (2 ml) en diferentes momentos para determinar la región de la meseta de la curva, por ejemplo: 3, 6, 24, 27, 30 y 48 h. Después de 24 h reemplace la solución por una nueva.
3. Mida la absorbancia a 252 nm de cada alícuota y determine la concentración de presente diverunisal en la solución, utilizando una curva de calibración de diflunisal. Calcular la cantidad de diflunisal retenida en el hidrogel a 24 y 48 h, como la diferencia de concentraciones iniciales y finales, teniendo en cuenta el volumen total (56 ml).
   1. Determine la eficiencia de encapsulación (EE) utilizando la ecuación 3.
      
   2. Congele los hidrogeles cargados a -80 oC y liofilícelos a -50 oC.
4. Para la liberación de fármacos, sumerja 300 mg de hidrogeles diflunisales liofunciales en 50 ml de tampón de fosfato (pH 7.4) a 25 oC. Mantenga la agitación constante. Retirar alícuotas de 2 ml en diferentes momentos y reemplazar con medio fresco para mantener un volumen constante.
   1. Determinar el diflusio liberado espectrofotométricamente a 252 nm, de acuerdo con una curva de calibración.
5. Deducir el mecanismo predominante de liberación de fármacos en los hidrogeles ajustando los datos de liberación de fármacos correspondientes al primer 60%, al modelo Korsmeyer-Peppas (Ecuación 4), para obtener las constantes cinéticas (k) y la difusión (n). Los valores n indican el mecanismo de liberación de^{fármacos 24,25}. A continuación, los valores n cercanos a 0,5 están relacionados con la difusión de Fickian, mientras tanto los valores de 0,5-1,0 para el transporte anómalo, donde están implicados cadenas de difusión y relajación, y finalmente, los valores de 1,0 están relacionados con el transporte del caso II.
   
   1. Para confirmar los resultados, utilice los modelos matemáticos Higuchi, First order y Zero order (Ecuaciones 5 a 7) y seleccione el ajuste mejor.
   2. 
      
      
      donde t representa el tiempo de liberación, Mt la cantidad de medicamento entregado en un momento dado, y M_- la cantidad total de medicamento entregado al final del proceso.

Resultados

Preparación de hidrogeles
Los hidrogeles Detosan-PVA se obtuvieron a -4oC, -20oC y -80oC con 4 ciclos de congelación y a -80oC con 5 y 6 ciclos de congelación por el método de congelación previamente notificado². Todos los hidrogeles eran homogéneos, semitransparentes, flexibles y resistentes a la manipulación.

Caracterización FT-IR
Los espectros FT-IR se mu...

Discusión

El método de congelación-descongelación es un proceso adecuado para preparar hidrogeles biocompatibles enfocados en aplicaciones biomédicas, farmacéuticas o cosméticas^34,35,36. La ventaja más importante de este método, en comparación con otros métodos bien conocidos para preparar hidrogeles, es que se evita el uso de agentes reticulantes, que podría causar una respuesta inflamatoria o efectos adversos en el cuerpo hum...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials:
Chitosan medium molecular weight	Sigma-Aldrich	448877	Mw determined by capillary viscometry (637,000 Da) and deacetylation degree of 70%
Diflunisal (2'-4'-difluoro-4-hydroxy-3-biphenyl-carboxylicacid)	Merck
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	1005706
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich	341584	Mw 89,000-98,000, 99+% hydrolyzed
Equipment:
Cressington Sputter Coater 108 auto	TED PELLA INC
Cryodos Lyophilizator	Telstar
Falcon tubes	Thermo Fisher Company
FT-IR spectroscopy	Nicolet iS50	in ATR mode
Lyophilizator	LABCONCO
Micromeritics Autopore IV 9500	Micromeritics
Scanning electron microscope	Pemtron SS-300LV
UV-visible spectrophotometer	Agilent 8453