Um método de congelamento-descongelamento para preparar chitosan-poly (álcool de vinil) hidrogéis sem agentes crosslinking e estudos de liberação diflunisal

Resumo

O método de congelamento-descongelamento é usado para produzir hidrogéis quitosan-poli (álcool de vinil) sem agentes de crosslinking. Para este método, é importante considerar as condições de congelamento (temperatura, número de ciclos) e razão de polímero, que podem afetar as propriedades e aplicações dos hidrogéis obtidos.

Resumo

Os hidrogéis chitosan-poly (álcool de vinil) podem ser produzidos pelo método de congelamento de descongelamento sem o uso de agentes tóxicos de crosslinking. As aplicações desses sistemas são limitadas por suas características (por exemplo, porosidade, flexibilidade, capacidade de inchaço, carregamento de drogas e capacidade de liberação de medicamentos), que dependem das condições de congelamento e do tipo e proporção de polímeros. Este protocolo descreve como preparar hidrogéis a partir de quitosana e poli (álcool de vinil) em 50/50 w/w % da composição do polímero e variando a temperatura de congelamento (-4 °C, -20 °C, -80 °C) e ciclos de congelamento-descongelamento (4, 5, 6 ciclos de congelamento). Foram obtidos espectraFT-IR, micrografia SEM e dados de porosimetria de hidrogéis. Além disso, a capacidade de inchaço e carregamento de drogas e liberação de diflunisal foram avaliados. Os resultados das micrografias sem e porosimetry mostram que o tamanho dos poros diminui, enquanto a porosidade aumenta em temperaturas mais baixas. A porcentagem de inchaço foi maior na temperatura de congelamento menor. A liberação do diflunisal dos hidrogéis foi estudada. Todas as redes mantêm a liberação de drogas por 30 h e observou-se que um mecanismo simples de difusão regula a liberação diflunisal de acordo com os modelos Korsmeyer-Peppas e Higuchi.

Introdução

Recentemente, os hidrogéis têm atraído grande interesse no campo biomédico, porque eles são redes tridimensionais com alto teor de água e são macios e flexíveis, para que eles possam imitar os tecidos naturais facilmente¹. Além disso, eles não se dissolvem em meio aquoso a temperatura fisiológica e pH, mas apresentam um grande inchaço². Hidrogéis podem atuar como andaimes de engenharia de tecidos, produtos de higiene, lentes de contato e curativos; porque eles podem prender e liberar compostos ativos e drogas, eles são usados como sistemas de entrega de drogas³. Dependendo de sua aplicação, hidrogéis podem ser feitos de polímeros naturais ou sintéticos, ou uma combinação de ambos, a fim de obter as melhores características⁴.

As propriedades dos hidrogéis são uma conseqüência de muitos fatores físicos e químicos. No nível físico, sua estrutura e morfologia dependem de sua porosidade, tamanho dos poros e distribuição de poros^5. No nível químico e molecular, o tipo de polímero, o conteúdo do grupo hidrofílico na cadeia de polímeros, o tipo de ponto transversal e a densidade cruzada são os fatores que determinam a capacidade de inchaço e as propriedades mecânicas^6,7.

De acordo com o tipo de agente crosslinking usado para formar a rede, os hidrogéis são classificados como hidrogéis químicos ou hidrogéis físicos. Hidrogéis químicos são unidos por interações covalentes entre suas cadeias, que são formadas através de irradiação UV e gama ou usando um agente crosslinking^7,8. Hidrogéis químicos geralmente são fortes e resistentes, mas, geralmente, o agente crosslinking é tóxico para as células e sua remoção é difícil, por isso a sua aplicação é limitada. Por outro lado, hidrogéis físicos se formam pela conexão das cadeias de polímeros através de interações não covalentes, evitando o uso de agentes crosslinking^4,9. As principais interações não covalentes na rede são interações hidrofóbicas, forças eletrostáticas, limites complementares e de hidrogênio^7.

Poly (álcool de vinil) (PVA, Figura 1a)é um polímero sintético e solúvel em água com excelente desempenho mecânico e biocompatibilidade que pode de hidrogéis livres de agentes crosslink através do método de congelamento-descongelamento^10,11. Este polímero tem a capacidade de formar zonas concentradas de ligações de hidrogênio entre grupos -OH de suas cadeias (zonas cristalinas) quando eles estão congelando¹². Estas zonas cristalinas atuam como pontos de cruzamento na rede, e são promovidas por dois eventos: a aproximação das cadeias de polímeros quando a água cristalina se expande e as mudanças conformais pva de isotática para pva sindicotático durante o congelamento¹³. Por causa da liofilagem, os cristais de água são sublimados, deixando espaços vazios que são os poros no hidrogel^14. Para obter hidrogéis com melhores propriedades, pva pode ser facilmente combinado com outros polímeros.

Nesse sentido, a quitosana constitui uma opção, pois é o único biopolímero de fontes naturais com cargas positivas. É obtido pela deacetilação da citona e é composto por combinações aleatórias de β-1,4 ligada saciedade D (unidade deacetilada) e N-acetil-D-glucosamina (unidade acetilada)^15,16 (Figura 1b). Quitosana é biodegradável por enzimas humanas e é biocompatível. Além disso, por sua natureza cationic, pode interagir com a carga negativa da superfície celular, e esta propriedade tem sido associada com sua atividade antimicrobiana¹⁷. Este polímero é fácil de processar; no entanto, suas propriedades mecânicas não são suficientes e alguns materiais foram adicionados para formar complexos com melhores características.

Considerando características específicas da quitosa na quitarina e da PVA, a fabricação bem-sucedida de hidrogéis foi atingida pelo método^decongelamento-descongelamento^2,18 para evitar o uso de agentes tóxicos de crosslinking. Em hidrogéis chitosan-PVA, as zonas cristalinas do PVA também são formadas, e as cadeias de quitosana são interpenetradas e formam ligações simples de hidrogênio com grupos -NH₂ e grupos -OH no PVA. O hidrogel quitosan-PVA final é mecanicamente estável, com altas taxas de inchaço e baixa toxicidade, e com efeito antibacteriano^18. No entanto, dependendo das condições de congelamento utilizadas na preparação (temperatura, tempo e número de ciclos), as características finais podem mudar. Alguns estudos relatam que aumentar o número de ciclos de congelamento diminui o grau de inchaço e aumenta a força de tração^19,20. A fim de fortalecer a rede, outros agentes, como a radiação gama e UV e crosslinkers químicos têm sido utilizados adicionalmente após a preparação congelado^21,22,23. Hidrogéis com maior proporção de quitosana têm uma rede mais porosa e alta capacidade de inchaço, mas menos força e estabilidade térmica. Neste contexto, é importante considerar as condições de preparação para obter hidrogéis adequados para a sua aplicação alvo.

O objetivo deste trabalho é apresentar em detalhes como as condições de congelamento (temperatura de congelamento e número de ciclos) afetam as características finais dos hidrogéis CS-PVA. Foram avaliadas características de espectros FT-IR, morfológicas e porosidades e capacidade de inchaço, bem como capacidade de carregamento e liberação de medicamentos. Nos estudos de liberação, diflunisal (Figura 1c)foi usado como droga modelo, devido ao seu tamanho adequado à estrutura hidrogel.

Protocolo

1. Preparação de hidrogéis chitosan-PVA

1. Prepare 2% (w/w) chitosan e 10% (w/w) soluções PVA. Dissolva 0,2 g de quitosana em 10 mL de 0,1 M CH₃COOH solução (previamente filtrada) à temperatura ambiente e manter agitação mecânica contínua durante a noite. Dissolva 1 g de PVA em 10 mL de água destilada e mexa a 80 °C por 1 h.
2. Misture ambas as soluções 1:1 usando um agitador magnético até que sejam homogêneas à temperatura ambiente, e despeje as misturas em placas de Petri. Deixe as amostras para 2 h na pressão atmosférica para degas.
3. Congele os hidrogéis em -4 °C, -20 °C ou -80 °C para 20 h e 4 ciclos (amostras CP4-4, CP4-20 e CP4-80, respectivamente). Congele outro hidrogel a -80 °C por 20 h usando 5 ou 6 ciclos de congelamento (amostras CP5-80 e CP6-80). Após o terceiro ciclo de congelamento, lave os hidrogéis com água desionizada. No final, congele os hidrogéis a -46 °C por 48 h e guarde para maior caracterização (metodologia adaptada a partir de^2).

2. Caracterização FT-IR

1. Coloque um pequeno pedaço (1 mm x 2 mm) de hidrogel no espectrômetro FT-IR no modo ATR. Pegue os espectros FT-IR de 4000 a 600 cm^-1 (2 cm^-1 de resolução e média de 32 exames).

3. Ensaios inchaço

1. Corte discos (13 mm de diâmetro e 10 mm de altura) do hidrogel e pesem-nos. Incubar os discos em 50 mL de água desionizada com agitação a 25 °C. Repita três vezes.
2. Cada 30 min remover a amostra do meio, mancha para eliminar o excesso de água, e pesar. Calcule o grau de inchaço usando a equação 1 e calcule o estado de equilíbrio do inchaço, às 24 h usando a equação 2.
   )
   Onde está o peso do hidrogel seco e é o peso do hidrogel molhado.
   

4. Microscopia Eletrônica

1. Cubra um pequeno pedaço de hidrogel com uma fina camada de ouro (30 s e 10 mA) em um coater sputter.
2. Coloque a amostra em um microscópio eletrônico de varredura (SEM). Analise as amostras vácuo a 20 kV e tire as imagens com uma ampliação de 500x e 1500x.

5. Porosimetry 5. Porosimetry

1. Coloque discos de 15 mm de diâmetro pesando cerca de 0,26 g no penetrômetro (um penetrômetro sólido, com um volume maior de 0,3660 mL e 5,7831 mL de volume de caule). Analise o tamanho da porosidade e dos poros por Porosimetry de intrusão de mercúrio (MIP).
2. Conduzir o experimento no modo histerese (intrusão-extrusão). Medir o volume total de intrusão (mL/g), área total de poros (m^2/g),diâmetro dos poros (μm), porosidade (%), permeabilidade (mDarcy) e tortuosidade. Repita duas vezes.

6. Carregamento e liberação da droga

1. Antes de carregar, prepare 4 L de 15 mg/L solução diflunisal e mexa durante a noite. Confirme a concentração da solução pela espectroscopia UV-Vis (concentração inicial). Na verdade, inchar 400 mg de amostras liofilizadas de hidrogel em 6 mL de água destilada para 24 h.
2. Para carregar, encha um frasco com 50 mL de solução diflunisal e mantenha a 25 °C com agitação constante. Submergir cada hidrogel inchado no frasco.
   1. Tome alíquotas de solução diflunisal restante (2 mL) em momentos diferentes, a fim de determinar a região do planalto da curva, por exemplo: 3, 6, 24, 27, 30 e 48 h. Após 24 h substituir a solução com um fresco.
3. Medir a absorção em 252 nm de cada alibado, e determinar a concentração de diflunisal presente na solução, usando uma curva de calibração de diflunisal. Calcule a quantidade de diflunisal retida no hidrogel às 24 e 48 h, como a diferença de concentrações iniciais e finais, levando em conta o volume total (56 mL).
   1. Determine a eficiência de encapsulamento (EE) usando a equação 3.
      
   2. Congele os hidrogéis carregados a -80 °C e liofilize-os a -50 °C.
4. Para a liberação de drogas, submergir 300 mg de hidrogéis liofilizados diflunisal carregado em 50 mL de tampão de fosfato (pH 7,4) a 25 °C. Mantenha a agitação constante. Retire alíquotas de 2 mL em momentos diferentes e substituir por meio fresco para manter um volume constante.
   1. Determinou o diflunisal liberado espectrophotometricamente em 252 nm, de acordo com uma curva de calibração.
5. Deduza o mecanismo predominante de liberação de drogas nos hidrogéis ajustando os dados de liberação de drogas correspondentes aos primeiros 60%, ao modelo Korsmeyer-Peppas (Equação 4), para obter as constantes cinéticas(k)e a difusão(n). Os valores n indicam o mecanismo de liberação de drogas^24,25. Em seguida, os valores próximos a 0,5 estão relacionados à difusão fickiana, enquanto os valores de 0,5-1,0 para o transporte anômalo, onde estão envolvidos difusão e cadeias de relaxamento, e, finalmente, os valores de 1,0 estão relacionados ao transporte caso II.
   
   1. Para confirmar os resultados, use os modelos matemáticos de Higuchi, Primeira ordem e Ordem Zero (Equações 5 a 7) e selecione o melhor ajuste.
   2. 
      
      
      onde t representa o tempo de liberação, Mt a quantidade de droga entregue em um determinado momento, e M_a quantidade total de drogas entregues no final do processo.

Resultados

Preparação de hidrogéis
Hidrogéis Chitosan-PVA foram obtidos a -4 °C, -20 °C e -80 °C com 4 ciclos de congelamento e a -80 °C com 5 e 6 ciclos de congelamento pelo método de congelamento-descongelamento relatado anteriormente^2. Todos os hidrogéis eram homogêneos, semitransparentes, flexíveis e resistentes à manipulação.

Caracterização FT-IR
Os espec...

Discussão

O método de congelamento-descongelamento é um processo adequado para preparar hidrogéis biocompatíveis focados em aplicações biomédicas, farmacêuticas ou cosméticas^34,35,36. A vantagem mais importante deste método, em comparação com outros métodos bem conhecidos para preparar hidrogéis, é que o uso de agentes crosslinking é evitado, o que poderia causar uma resposta inflamatória ou efeitos adversos no corpo huma...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials:
Chitosan medium molecular weight	Sigma-Aldrich	448877	Mw determined by capillary viscometry (637,000 Da) and deacetylation degree of 70%
Diflunisal (2'-4'-difluoro-4-hydroxy-3-biphenyl-carboxylicacid)	Merck
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	1005706
Poly(vinyl alcohol)	Sigma-Aldrich	341584	Mw 89,000-98,000, 99+% hydrolyzed
Equipment:
Cressington Sputter Coater 108 auto	TED PELLA INC
Cryodos Lyophilizator	Telstar
Falcon tubes	Thermo Fisher Company
FT-IR spectroscopy	Nicolet iS50	in ATR mode
Lyophilizator	LABCONCO
Micromeritics Autopore IV 9500	Micromeritics
Scanning electron microscope	Pemtron SS-300LV
UV-visible spectrophotometer	Agilent 8453