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Resumen

En este artículo, presentamos un conjunto de métodos prácticos y factibles para caracterizar mutantes relacionados con enfermedades de quinasas familiares de la RAF, que incluyen el ensayo de quinasa in vitro, el ensayo de coactivación de la RAF y el ensayo complementario de luciferasa dividida.

Resumen

Las quinasas familiares de fibrosarcoma (RAF) aceleradas rápidamente desempeñan un papel central en la biología celular y su disfunción conduce a cánceres y trastornos del desarrollo. Una caracterización de los mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad nos ayudará a seleccionar estrategias terapéuticas adecuadas para el tratamiento de estas enfermedades. Estudios recientes han demostrado que las quinasas familiares de la RAF tienen actividades catalíticas y alostéricas, que están estrictamente reguladas por la dmerización. Aquí, construimos un conjunto de métodos prácticos y factibles para determinar las actividades catalíticas y alostéricas y la relativa afinidad/estabilidad de la familia de la RAF y sus mutantes. En primer lugar, modificamos el ensayo clásico de quinasa in vitro reduciendo la concentración de detergente en tampones, utilizando un procedimiento de lavado rápido suave y empleando una fusión de glutatión S-transferasa (GST) para evitar que los dimers de la RAF se disocieran durante Purificación. Esto nos permite medir la actividad catalítica de los mutantes constitutivamente activos de la RAF apropiadamente. En segundo lugar, desarrollamos un nuevo ensayo de coactivación de la RAF para evaluar la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa mediante el uso de proteínas de la RAF truncadas en Terminal N, eliminando el requisito de Ras activo en los protocolos actuales y logrando así un mayor Sensibilidad. Por último, generamos un ensayo complementario único de luciferasa dividida para medir cuantitativamente la afinidad/estabilidad relativa de dimer de varios mutantes de la RAF, que es más confiable y sensible en comparación con el ensayo tradicional de coinmunoprecipitación. En resumen, estos métodos tienen las siguientes ventajas: (1) fácil de usar; 2) capaz de llevar a cabo eficazmente sin equipos avanzados; 3) rentable; (4) altamente sensible y reproducible.

Introducción

Las quinasas de la familia RAF son un componente clave de la cascada de señalización RAS/RAF/MEK/ERK, que transmiten una señal de RAS para activar la proteína quinasa activada por mitogeno (MEK)1,2,3,4. Esta familia de quinasas juega un papel crucial en el crecimiento celular, supervivencia ydiferenciación, y sus alteraciones inducen muchas enfermedades, en particular el cáncer 5,6,7,8. Recientemente, las secuenciaciones genómicas han identificado muchos mutantes de la RAF relacionados con enfermedades que exhiben diferentes propiedades en la transmisión de señal de LA cascada RAS/RAF/MEK/ERK9,10,11. Una caracterización cuidadosa de los mutantes de la RAF nos ayudará a entender los mecanismos moleculares de cómo los mutantes de la RAF alteran la salida de señal de la cascada RAS/RAF/MEK/ERK, eventualmente seleccionar enfoques apropiados para tratar varias enfermedades impulsadas por mutantes de la RAF.

Las quinasas de la familia RAF incluyen tres miembros, CRAF, BRAF y ARAF, que tienen estructuras moleculares similares pero diferentes capacidades para activar la señalización aguas abajo1,2,3,4. Entre estos paralogs, BRAF tiene la actividad más alta en virtud de su constitutivamente fosforilado NtA (N-terminal a cidic) motivo12,13,14, mientras que ARAF tiene el más bajo actividad derivada de su motivo APE no canónico15. Esto puede explicar las diferentes frecuencias de mutación de los paralogos de la RAF en enfermedades: BRAF>CRAF>ARAF. Además, dentro del mismo paralog de la RAF, las mutaciones en diferentes sitios pueden desencadenar la señalización aguas abajo de maneras distintas, lo que añade otra capa de complejidad a la regulación de las quinasas familiares de la RAF. Estudios recientes han demostrado que todas las quinasas de la RAF tienen actividades catalíticas y alostéricas13,14,16,17,18. Los mutantes de la RAF constitutivamente activos activan la señalización aguas abajo directamente mediante el fósforo MEK, mientras que los mutantes de la RAF muertos de quinasa pueden transactivar sus contrapartes de tipo salvaje a través de la dimerización de lado a lado y activar la señalización MEK-ERK16 ,19,20. La afinidad/estabilidad dimer es un parámetro clave que no sólo determina la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa, sino que también afecta a la actividad catalítica de los mutantes constitutivamente activos de la RAF15,21, 22. Los mutantes de la RAF muertos de quinasa con alta afinidad/estabilidad dimer pueden transactivar los RAF endógenos directamente15,mientras que aquellos con afinidad/estabilidad dimer intermedia requiere una coordinación de Ras activo o un nivel elevado de moléculas de tipo salvaje de la RAF para funcionar13,15,20,21,23. Del mismo modo, los mutantes constitutivamente activos de la RAF fosforilan MEK de una manera dimer-dependiente, y aquellos con baja afinidad/estabilidad dimer pierden su actividad catalítica in vitro tras la inmunoprecipitación que rompe los débiles atenuadores de la RAF15, 21,22. La afinidad/estabilidad dimer también determina la sensibilidad de los mutantes de la RAF a sus inhibidores, y se correlaciona positivamente con la resistencia de los inhibidores de la RAF24. Por lo tanto, para caracterizar a los mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad, es necesario medir sus actividades catalíticas y alostéricas, y la afinidad/estabilidad del dimer.

En los últimos años, nuestro laboratorio y otros han desarrollado varios métodos para caracterizar a las quinasas familiares de la RAF y sus mutantes. Según nuestro laboratorio y la experiencia de otros, creemos que los siguientes tres ensayos tienen ventajas en la definición de mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad: (1) el ensayo de quinasa in vitro que se puede llevar a cabo con facilidad para detectar la actividad catalítica de la mutantes activos de la RAF15; (2) el ensayo de coactivación de la RAF que es un método fiable y conveniente para medir la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos de quinasa13,15,21,22,23, 25; (3) el ensayo gratuito de luciferasa dividida que tiene una sensibilidad mucho mayor en la medición de la afinidad/estabilidad relativa de los mutantes de la RAF en contraste con el ensayo tradicional de coinmunoprecipitación, y es capaz de llevar a cabo sin equipo avanzado en en contraste con los métodos analíticoscuantitativos como el análisis SPR (S urface Plasmon Resonance)15,22. Combinando estos tres ensayos, podemos entender fácilmente cómo un mutante de la RAF relacionado con la enfermedad altera la señalización aguas abajo y así utilizar una estrategia terapéutica apropiada para tratar la enfermedad causada por esta mutación de la RAF.

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Protocolo

1. Ensayo In Vitro Kinase para medir la actividad catalítica de los mutantes de la RAF

  1. Construir vectores que codifican mutantes de la RAF (Figura1A) con la etiqueta FLAG(DYKDDDDK) en C-terminus mediante el uso de Gibson Assembly o métodos tradicionales de clonación molecular.
    1. Introducir la etiqueta FLAG y las mutaciones en las secuencias de codificación de la RAF por PCRs, y luego insertar secuencias enteras en el vector pCDNA3.1(+) utilizando el ensamblaje Gibson o la ligadura de ADN T4 y siguiendo los protocolos de la fabricación. Utilice las siguientes condiciones para las reacciones de PCR: (1) 95 oC, 2 min; (2) 95 oC, 30 s; (3) 59 oC, 30 s; (4) 68 oC, 3 min; (5) 20 ciclos de (2 a 4); (6) Retención de 4 oC.
      NOTA: Las imprimaciones PCR para clonación: 5- AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 y 5-CAGCGGGTTTAAACGCCCTCTA-3.
    2. Inserte la secuencia de codificación GST aguas arriba de las secuencias de codificación mutantes de la RAF para generar vectores que codifican mutantes de la RAF fusionados con GST utilizando los mismos métodos que se describen en el paso 1.1.1.
    3. Validar todos los vectores mediante secuenciaciones de ADN antes de la transfección.
  2. Placa 293T células en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 x 105 células / bien un día antes de la transfección. Cuando la densidad celular alcanza una confluencia del 80-90% en el segundo día, transfect con vectores que codifican las quinasas RAF etiquetadas por FLAG o sus mutantes desde el paso 1.1 en las celdas siguiendo el protocolo de reactivación de la transfección de la fabricación (Tabla de materiales).
  3. Reemplace el medio de cultivo 24 h después de la transfección.
  4. Aspirar el medio de cultivo 48 h después de la transfección y añadir 400 l/pozo de tampón de lisis (25 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1 mM ácido etilendiaminetetraacético (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) complementado con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa a las células de la lepíza en el hielo.
    NOTA: La concentración de NP-40 en el tampón de lisis es fundamental para detectar la actividad catalítica de los mutantes de la RAF con afinidad/estabilidad de dimer moderada in vitro. Una alta concentración de detergente o un detergente fuerte en el tampón de lisis puede romper los dimers de la RAF y así matar la actividad catalítica de las quinasas de la RAF o sus mutantes.
  5. Transfiera los lysates celulares a un tubo de 1,5 ml, y gire hacia abajo por 12.000 x g durante 10 minutos a 4 oC para agotar los desechos celulares.
  6. Transfiera 300 ml por muestra de lyalatos de células enteras limpias a tubos de 1,5 ml, agregue 20 ml por muestra de perlas de afinidad anti-FLAG y gire en una cámara fría (4 oC) durante 1 h. También tome a un lado 40 l por muestra de isladez de células enteras limpias para detectar la expresión y la actividad (fosfo-ERK1-2) de los mutantes de la RAF por inmunoblots como se describe a continuación.
  7. Lavar las perlas anti-FLAG una vez con tampón de lisis, luego una vez con tampón de reacción quinasa (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 mM Na3VO4, 0,5 mM dTT, pH 7.2), y añadir 20 s de mezcla de reacción quinasa (2 g de MEK1(K97A) y 100M de ATP en 20 buffer de acción) por muestra.
    NOTA: El lavado de cuentas debe completarse suavemente y rápidamente, el tampón residual debe aspirarse completamente antes de añadir la mezcla de reacción quinasa, y todas las operaciones en este paso deben llevarse a cabo a 4 oC en una cámara fría.
  8. Incubar las reacciones de la quinasa a temperatura ambiente (25 oC) durante 10 minutos, y voltear los tubos que contienen reacciones de quinasa con los dedos cada dos minutos durante la incubación.
  9. Añadir 5 l de búfer de muestra SDS de 5x (375 mM Tris HCl, 9% sulfato de dodecilo sódico (SDS), 50% glicerol, 0.03% Bromofenol Blue) por muestra para detener las reacciones de quinasa, y luego calentar las muestras a 90 oC durante 5 min.
  10. Ejecuta las muestras en electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) de 9-12% con 0,1% de SDS, transfiere las proteínas a la membrana de nitrocelulosa y detecta los niveles de fosfo-MEK y mutantes de la RAF en las muestras por inmunoblots.
    NOTA: El fosfo-MEK también se puedecuantificar mediante el uso de la incorporación de P-ATP 32. En resumen, se añaden 10 M a32P-ATP al búfer de reacción quinasa, y la cantidad de MEK fosforilado se cuantifica después de la separación de PAGE mediante el uso de autoradiografía estándar, fosforfación o técnicas de recuento de centelleo líquido como Apropiado.

2. Ensayo de coactivación de la RAF para evaluar la actividad alostérica de los mutantes de la RAF muertos por Kinase

  1. Construir vectores que codifican el receptor RAF (dominio de quinasa CRAF con motivo NtA no fosforilable, AAFF) o los activadores de la RAF muertos de quinasa (dominio de quinasa de la RAF con motivo NtA imitado por fosforilación, SSDD, DDEE o DGEE) (Figura1A) como descrito en el paso 1.1.
  2. Células 293T transfect con dos vectores que codifican tanto el receptor RAF como el activador RAF muerto de quinasa o un solo vector que codifica una de las proteínas como se describe en los pasos 1.2 y 1.3.
  3. Reemplazar el medio de cultivo a las 24 h después de la fecundidad, y cosechar 293T transfectantes a 48 h para preparar los lysates de células enteras como se describe en los pasos 1.4 y 1.5.
  4. Mezcle el lisado limpio de células enteras con 5 tampón de muestra SDS rápidamente a temperatura ambiente (25 oC) y luego hierva a 90 oC durante 5 min.
  5. Ejecuta las muestras de lisato de células enteras hervidas en una página de 9 a 12% con 0,1% de SDS, transfiere las proteínas a la membrana de nitrocelulosa y detecta los niveles de fosfo-ERK1/2 y controla las proteínas por inmunofunción.

3. Ensayo de Luciferasse dividido gratuito para medir la afinidad/estabilidad relativa del dimer de los mutantes de la RAF

  1. Construir vectores que codifican mutantes RAF etiquetados con FLAG fusionados con el Término N de Nluc (N-terminus de luciferasa de luciérnaga, aa2-416) o el Término C de Cluc (C-terminus de luciérnaga, aa398-550) como se describe en el paso 1.1.
  2. Células 293T transfectos con un par de vectores que codifican diferentes mutantes Nluc-RAF y mutantes Cluc-RAF como se describe en el paso 1.2.
  3. A las 24 h después de la transfección, replacar 293T transfectan de células en placas de imagen negra Krystal a la densidad celular de 2x105 por pozo con medio libre de color (es decir, DMEM sin rojo fenol).
  4. 24 h más tarde, añadir D-luciferina (0,2 mg/ml) a 293T transeftantes celulares, incubar durante 30 minutos y medir las señales de luciferasa utilizando un sistema de detección múltiple (Tablade materiales).
  5. Después de medir las señales de luciferasa, aspirar los transfectudores medio y de lise 293T con tampón de lisis para preparar los líticos de células enteras como se describe en los pasos 1.4 y 1.5.
  6. Ejecuta las muestras de lisados de células enteras en una página de 9 a 12% con 0,1% de SDS y detecta los niveles de expresión de mutantes Nluc-RAF y mutantes de Cluc-RAF mediante inmunoblot anti-FLAG como se describe en el paso 2.5. Los niveles de expresión relativos del mutante Nluc-RAF y del mutante Cluc-RAF en los transfectudores 293T se cuantifican mediante el uso de la imagen J de sus inmunoblots.
  7. Normalizar las señales de luciferasa de los transefectos celulares 293T de acuerdo con los niveles de expresión de los mutantes Nluc-RAF y Cluc-RAF mutantes. Brevemente, esto se logra dividiendo la señal de luciferasa cruda por los niveles de expresión relativa de los mutantes Nluc-RAF y los mutantes cluc-RAF del paso 3.6.

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Resultados

Las quinasas de la familia RAF tienen actividades catalíticas y alostéricas, que permiten a sus mutantes relacionados con la enfermedad encender la señalización aguas abajo a través de diferentes mecanismos13,14,16,17 ,18. Los mutantes constitutivamente activos de la RAF fosforilan directamente sus sustratos, mientras que los mutantes de la RAF muertos d...

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Discusión

En este artículo, presentamos tres métodos para caracterizar mutantes de la RAF relacionados con la enfermedad, que incluyen el ensayo de quinasa in vitro, el ensayo de coactivación de la RAF y el ensayo de luciferasa dividida de cortesía. Dado que las quinasas de la RAF tienen actividad catalítica y actividad alostérica, varios mutantes de la RAF pueden activar la señalización aguas abajo a través de dos mecanismos distintos13,14,

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

A los autores les gustaría reconocer la Beca de Leucemia de Células Peludas por el apoyo de Yuan Jimin. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Asia Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), Beca de Investigación (AM/TP011/2018).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-phosphoERK1/2Cell Signaling Technologies4370
anti-phosphoMEK1/2Cell Signaling Technologies9154
anti-ERK1/2AB clonalA0229
anti-MEK1/2Cell Signaling Technologies9124
anti-FLAG(mouse)Sigma-AldrichF3165
anti-HANovus BiologicalsMAB6875
anti-FLAG(Rabbit)Cell Signaling Technologies14793
anti-β-actinSigma-AldrichA2228
anti-FLAG beads(M2)Sigma-AldrichA4596
HRP-conjugated anti-mouse IgGJackson Laboratories115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgGJackson Laboratories111-035-144
pcDNA3.1(+)In vitrogenV79020
Gibson Assembly Cloning  KitNew England BiolabsE5510
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
Fugene 6Roche11 814 443 001
DMEM w/o phenol redInvitrogen21063-029
D-luciferin GoldBioLUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A) prepared in our previous studiesN.A.Reference 15.
GloMax-Multi Detection System.PromegaE7041

Referencias

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