JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье мы представили набор практических и осуществимых методов для характеристики связанных с болезнями мутантов семейных киназ RAF, которые включают в себя анализ in vitro киназы, анализ совместной активации RAF и дополнительный анализ сплит-люциферазы.

Аннотация

Быстро ускоренная фиброзаркома (RAF) семейные киназы играют центральную роль в клеточной биологии и их дисфункция приводит к раку и нарушениям развития. Характеристика связанных с болезнями мутантов RAF поможет нам выбрать соответствующие терапевтические стратегии для лечения этих заболеваний. Недавние исследования показали, что семейные киназы RAF имеют как каталитическую, так и аллостерную деятельность, которая жестко регулируется димеризацией. Здесь мы построили набор практических и осуществимых методов для определения каталитической и аллостерической деятельности и относительной сродства/стабильности киназов семейства RAF и их мутантов. Во-первых, мы внесли изменения в классический анализ in vitro kinase, снизив концентрацию моющего средства в буферах, используя нежную процедуру быстрой стирки и используя фьюжн-передатчик (GST) для предотвращения разъединения RAF димеров во время Очистки. Это позволяет адекватно измерять каталитическую активность constitutively активных мутантов RAF. Во-вторых, мы разработали новый RAF совместной активации анализ для оценки аллостерической активности киназы мертвых мутантов RAF с помощью N-терминала усеченных белков RAF, устраняя требование активного Раса в текущих протоколах и тем самым достигая более высокого Чувствительность. Наконец, мы создали уникальный дополнительный анализ разделенной люциферазы для количественного измерения относительной сродства/стабильности различных мутантов RAF, которая является более надежной и чувствительной по сравнению с традиционным анализом совместного иммунопреципиции. Таким образом, эти методы имеют следующие преимущества: (1) удобный для пользователя; (2) в состоянии эффективно осуществлять без современного оборудования; (3) рентабельно; (4) очень чувствительны и воспроизводимы.

Введение

Семейные киназы RAF являются ключевым компонентом каскада сигнализации RAS/RAF/MEK/ERK, которые передают сигнал от РАН для активации митоген-активированного протеина киназы (MEK)1,2,3,4. Это семейство киназ играет решающую роль в росте клеток, выживании и дифференциации, и их изменения вызывают многие заболевания, в частности, рак5,6,7,8. В последнее время геномные секвенирования выявили много связанных с болезнью мутантов RAF, которые обладают различными свойствами в передаче сигнала RAS/RAF/MEK/ERK каскад9,10,11. Тщательная характеристика мутантов RAF поможет нам понять молекулярные механизмы того, как мутанты RAF изменяют сигнальный выход каскада RAS/RAF/MEK/ERK, в конечном итоге выбирая подходящие подходы для лечения различных мутантов, управляемых RAF.

Семьи киназы RAF включают в себя три члена, CRAF, BRAF, и ARAF, которые имеют аналогичные молекулярные структуры, но различные способности, чтобы активировать вниз по течению сигнализации1,2,3,4. Среди этих паралогов, BRAF имеет самую высокую активность в силу своей составно фосфорилированной NtA (N-тerminal cidic) мотив12,13 ,14, в то время как ARAF имеет самый низкий деятельность, вытекающая из его неканонического мотива APE15. Это может объяснить различные частоты мутаций паралогов RAF при заболеваниях: BRAF-gt;CRAF-gt;ARAF. Кроме того, в рамках одного и того же паралога RAF мутации на разных участках могут вызывать сигнализацию вниз по течению в различных манерах, что добавляет еще один уровень сложности к регулированию семейных киназ RAF. Недавние исследования показали, что все киназы RAF имеют как каталитическую, так и аллостерную деятельность13,14,16,17,18. В соответствии с действующими мутантами RAF включить вниз по течению сигнализацию непосредственно фосфорилирование МЭК, в то время как киназы мертвых мутантов RAF могут трансактивировать свои аналоги дикого типа через боковую-стороннюю димеризацию и активировать MEK-ERK сигнализации16 ,19,20. Димер сродство / стабильность является ключевым параметром, который не только определяет аллостерную активность киназы мертвых мутантов RAF, но и влияет на каталитическую активность constitutively активных мутантов RAF15,21, 22. Киназа-мертвые мутанты RAF с высоким dimer сродством/стабильностью могут transactivate endogenous wild-type RAFs сразу15, пока те с промежуточными dimer сродством/стабильностью требует координации активного Ras или повышенный уровень молекул RAF дикого типа для функции13,15,20,21,23. Аналогичным образом, в совокупности активных raf мутантов фосфорилат MEK в димер-зависимым образом, и те, с низким димер омрачитель близость / стабильность теряют свою каталитическую активность в пробирке на иммунопрециптом, что перерывы слабых RAF dimers15, 21,22. Димер сродство / стабильность также определяет чувствительность raf мутантов к их ингибиторы, и положительно коррелирует с сопротивлением ингибиторов RAF24. Поэтому, чтобы охарактеризовать связанные с болезнями мутанты RAF, необходимо измерить их каталитическую и аллостерную деятельность, а также димерную сродство/стабильность.

В последние годы наша лаборатория и другие разработали различные методы для характеристики семейства киназов RAF и их мутантов. Согласно нашему опыту лаборатории и другим, мы считаем, что следующие три анализа имеют преимущества в определении связанных с болезнью мутантов RAF: (1) анализ in vitro киназы, который может быть проведен с легкостью для обнаружения каталитическая активность составно активные мутанты RAF15; (2) RAF совместноактивации ассс, который является надежным и удобным методом для измерения аллостерической активности киназы мертвых мутантов RAF13,15,21,22,23, 25; (3) бесплатный анализ разделенной люциферазы, который имеет гораздо более высокую чувствительность в измерении относительной сродства димера/стабильности мутантов RAF в отличие от традиционного совместного иммунопреципции, и способен осуществлять без передового оборудования в в отличие от количественных аналитических методов, таких как SPR (Surface Plasmon Resonance) анализ15,22. Сочетая эти три анализа, мы можем легко понять, как связанные с болезнью RAF мутант изменяет вниз по течению сигнализации и тем самым использовать соответствующую терапевтическую стратегию для лечения болезни, вызванной этой мутации RAF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. In Vitro Kinase Assay для измерения каталитическая активность мутантов RAF

  1. Построить векторы, кодируя мутантов RAF(рисунок 1A) с тегом FLAG (DYKDDDDK) на C-terminus с помощью Gibson Assembly или традиционных методов молекулярного клонирования.
    1. Введите тег FLAG и мутации в последовательности кодирования RAF по ПЦП, а затем вставьте целые последовательности в вектор pCDNA3.1 () с помощью гибсонской сборки или перевязки ДНК T4 и следуя протоколам производства. Используйте следующие условия для реакций ПЦР: (1) 95 градусов по Цельсию, 2 мин; (2) 95 градусов по Цельсию, 30 с; (3) 59 градусов по Цельсию, 30 с; (4) 68 кв.к., 3 мин; (5) 20 циклов (от 2 до 4); (6) 4 градуса по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР праймеры для клонирования: 5- AAATTAATACGACTACTACTAGAGGAGACCC-3 и 5-CAGCGGGGGTTAACGGGTCTA-3.
    2. Вставьте последовательность кодирования GST вверх по течению последовательности кодирования мутантов RAF для генерации векторов, кодирующих мутации RAF, скоторыми GST, используя те же методы, что описаны в шаге 1.1.1.
    3. Проверка всех векторов по секвенированию ДНК перед трансфекцией.
  2. Плита 293T клетки в 6-колодных пластин при плотности 5 х 105 клеток / хорошо за один день до трансфекции. Когда плотность клеток достигает 80-90% слияния на второй день, трансфект с переносчиками, кодируя ФЛАГМАН-тегами RAF киназы или их мутантов от шага 1.1 в клетки, следуя протоколу производства трансфекционных реагентов (Таблица материалов).
  3. Замените культуру среды 24 ч после трансфекции.
  4. Аспирировать культуру среды 48 ч после трансфекции и добавить 400 л/ну буфера лисиса (25 мм Трис) HCl, 150 мМ NaCl, 1 мМ этиленденеамитететраацетической кислоты (ЭДТА), 0,25% NP-40, рН 7,2) дополнены протеазой и ингибиторами фосфатазы для лизиклетой на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация NP-40 в буфере лизиса имеет решающее значение для обнаружения каталитическая активность мутантов RAF с умеренной димерной сродством/стабильностью в пробирке. Высокая концентрация моющего средства или сильного моющего средства в буфере лизиса может сломать DIMers RAF и тем самым убить каталитической активности киназы RAF или их мутантов.
  5. Перенесите щелочи клетки в трубку 1,5 мл и снесите вниз на 12 000 х г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия, чтобы истощить клеточный мусор.
  6. Перенесите 300 л/л на образец чистых цельных клеточных лисатов в 1,5 мл трубок, добавьте 20 л на образец бусинса сродства против FLAG и поверните в холодной комнате (4 кВ) на 1 ч. Также возьмите 40 qL на образец чистого цельного клеточного лисата в сторону для обнаружения экспрессии и активности (фосфо-ERK1/2) из raf мутантов иммуноблотов, как описано ниже.
  7. Вымойте анти-FLAG бусы один раз с буфером лисиса, затем один раз с буфером реакции киназы (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0.5 mM Na3VO4, 0.5 mM DTT, pH 7.2), и добавить 20 qL смеси реакции киназы (2 мкг MEK1 (K97A) и 100M буфер действия) на выборку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мытье бисера должно быть завершено мягко и быстро, остаточный буфер должен быть аспирирован полностью перед добавлением смеси реакции киназы, и все операции на этом этапе должны быть выполнены при 4 градусах По цельсию в холодной комнате.
  8. Инкубировать реакции киназы при комнатной температуре (25 градусов по Цельсию) в течение 10 минут, и переверните трубки, содержащие реакции киназы пальцами каждую минуту во время инкубации.
  9. Добавить 5 л 5x sDS образец буфера (375 мм Трис HCl, 9% сульфат натрия dodecyl (SDS), 50% Глицерол, 0.03% Бромофенол синий) на образец, чтобы остановить киназы реакций, а затем тепло образцов на 90 градусов по Цельсию в течение 5 мин.
  10. Запустите образцы в 9-12% полиакриламида геля электрофорез (PAGE) с 0,1% SDS, передать белки мембраны нитроцеллюлозы, и обнаружить уровни фосфо-MEK и RAF мутантов в образцах иммуноблотов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фосфо-MEK также может быть количественно спомощью 32 P-ATP включения. Кратко, 10 ЗМNo 32P-ATP добавляется в буфер реакции киназы, и количество фосфорилированного MEK затем количественно после разделения PAGE с помощью стандартной ауторадиографии, фосфорографии, или жидких методов подсчета сцинтилляции как Соответствующие.

2. RAF Со-активации Асса для оценки Аллостерической деятельности Кинасе мертвых RAF мутантов

  1. Конструкция векторов кодирования приемника RAF (CRAF киназы домена с нефосфорилируемым мотивом NTA, AAFF) или киназы мертвых RAF активаторов (RAF киназы домен с фосфорилированием-мимикрированный мотив NTA, SSDD, DDEE или DGEE) (Рисунок 1A) как описано в шаге 1.1.
  2. Transfect 293T-клетки с двумя векторами, кодирующие как приемник RAF, так и активатор RAF, умерший от киназы, или единый вектор, кодируя один из белков, как описано в шагах 1.2 и 1.3.
  3. Замените среду культуры на 24 ч после трансфекции, и урожай 293T трансфектантов на 48 ч, чтобы подготовить всю клетку lysates, как описано в шагах 1.4 и 1.5.
  4. Смешайте чистый образец всей клетки с 5x SDS образец буфера быстро при комнатной температуре (25 градусов по Цельсию), а затем кипятить при температуре 90 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
  5. Запустите вареные образцы целую клетку лизата в 9'12% PAGE с 0,1% SDS, перенесите белки в мембрану нитроцеллюлозы, и определить уровни фосфо-ERK1/2 и контролировать белки иммуноблотами.

3. Комплиментарный Сплит Luciferase Асссая для измерения относительного Dimer Affinity / Стабильность RAF мутантов

  1. Построить векторы кодирования FLAG помечены RAF мутантов сливается с N-терминов Nluc (N-терминф из светлячок luciferase, aa2-416) или C-терминов Cluc (C-терминус светлячка luciferase, aa398-550), как описано в шаге 1.1.
  2. Transfect 293T ячейки с парой векторов кодирования различных nluc-RAF мутантов и Cluc-RAF мутантов, как описано в шаге 1.2.
  3. На 24 ч после трансфекции, replate 293T клеточных трансфектонов в Krystal черные пластины изображения при плотности клеток 2x105 в хорошо с цветом среды (т.е., DMEM без фенола красный).
  4. 24 ч спустя, добавить D-люциферин (0,2 мг/мл) до 293T клеточных трансфектонов, инкубировать в течение 30 минут, и измерить сигналы люциферазы с помощью многофункциональная система обнаружения (Таблица материалов).
  5. После измерения сигналов люциферазы, аспирировать средние и лиза 293T трансфектантов с буфером излишеств асис подготовить всю клетку lysates, как описано в шагах 1.4 и 1.5.
  6. Запустите все образцы клеточного лисата в 9-12% PAGE с 0,1% SDS и обнаружить уровни экспрессии nluc-RAF мутантов и Cluc-RAF мутантов анти-FLAG иммуноблот, как описано в шаге 2.5. Относительные уровни экспрессии как мутантов Nluc-RAF, так и мутанта Cluc-RAF в 293T трансфектонах количественно оцениваются с помощью изображения J с их иммуноблотов.
  7. Нормализация люциферазы сигналов 293T клеточных трансфектонов в соответствии с уровнем экспрессии мутантов Nluc-RAF и Cluc-RAF мутантов. Короче говоря, это достигается путем деления необработанного сигнала люциферазы на относительные уровни экспрессии мутантов Nluc-RAF и Cluc-RAF с 3,6 ступени.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Семьи киназы RAF имеют как каталитические, так и аллостерные виды деятельности, которые позволяют их связанных с болезнью мутантов, чтобы включить вниз по течению сигнализации через различные механизмы13,14,16,17 ,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этой статье мы представили три метода для характеристики связанных с болезнями мутантов RAF, которые включают в пробирке киназы анализ, RAF совместной активации анализа, и бесплатный анализ раскола luciferase. Так как киназы RAF имеют как каталитическую активность, так и аллостерическую актив...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы отметить волосатые клетки лейкемии стипендий для поддержки Yuan Jimin. Эта работа была поддержана Азиатского фонда онкологических исследований (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Мост Финансирование премии (Дюк-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF преодоление гранта (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF пилотный грант (NCCRF-YR2017-PG- Исследовательский грант (AM/TP011/2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-phosphoERK1/2Cell Signaling Technologies4370
anti-phosphoMEK1/2Cell Signaling Technologies9154
anti-ERK1/2AB clonalA0229
anti-MEK1/2Cell Signaling Technologies9124
anti-FLAG(mouse)Sigma-AldrichF3165
anti-HANovus BiologicalsMAB6875
anti-FLAG(Rabbit)Cell Signaling Technologies14793
anti-β-actinSigma-AldrichA2228
anti-FLAG beads(M2)Sigma-AldrichA4596
HRP-conjugated anti-mouse IgGJackson Laboratories115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgGJackson Laboratories111-035-144
pcDNA3.1(+)In vitrogenV79020
Gibson Assembly Cloning  KitNew England BiolabsE5510
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
Fugene 6Roche11 814 443 001
DMEM w/o phenol redInvitrogen21063-029
D-luciferin GoldBioLUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A) prepared in our previous studiesN.A.Reference 15.
GloMax-Multi Detection System.PromegaE7041

Ссылки

  1. Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
  2. Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
  3. Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase". FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).
  4. Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).
  5. Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).
  6. Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).
  7. McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).
  8. Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).
  9. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
  10. Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).
  11. Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).
  12. Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).
  13. Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).
  14. Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161 (5), 967-970 (2015).
  15. Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).
  16. Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116 (6), 855-867 (2004).
  17. Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).
  18. Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).
  19. Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).
  20. Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140 (2), 209-221 (2010).
  21. Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11 (554), 6795(2018).
  22. Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).
  23. Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).
  24. Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).
  25. Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).
  26. Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).
  27. Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  28. Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).
  29. Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).
  30. Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).
  31. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
  32. Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).
  33. Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).
  34. Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. "RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).
  35. García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).
  36. Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).
  37. Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).
  38. Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

149RAFRAFRAF MEK ERKRAF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены