אפיון מוטציות הקשורות למחלות של חיל המשפחה באמצעות קבוצה של שיטות מעשיות ושימושיות

Summary

במאמר זה, הצגנו מערכת של שיטות מעשיות ושימושיות לאפיון מוטציות הקשורות למחלות של משפחת חיל-החוץ, הכוללים בתוך שיטת ההפעלה המבחנה, שיתוף הפעולה של החיל המלכותי הבריטי, ובחינה משלימה של פיצול לוציפראז.

Abstract

במהירות מואצת פיברוסרקומה (חיל הים) המשפחה משחק תפקיד מרכזי בביולוגיה התא ותפקוד שלהם מוביל סרטן הפרעות התפתחותיות. אפיון של מוטציות הקשורות למחלות, יסייעו לנו לבחור אסטרטגיות טיפוליות מתאימות לטיפול במחלות אלה. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי משפחת החיל המלכותי מקיימים פעילויות קטליטי ו אלוסטריה, אשר מוסדרים באופן הדוק על ידי דימרזציה. כאן, בנינו קבוצה של שיטות מעשיות ובעלות הבנה כדי לקבוע את הפעילויות הקטליטיות והאלוסטרואיות והאהדה היחסית/יציבות של משפחת חיל-החוץ והמוטציות שלהם. ראשית, תוקנו הקלאסי בתוך שיטת החוץ מבחנה על ידי הפחתת הריכוז של חומרי ניקוי במאגרים, ניצול הליך שטיפה עדין מהיר, ושימוש בפיוז של גלוטתיון S-transferase (GT) כדי למנוע מהחיל המלכותי לנתק במהלך טיהור. הדבר מאפשר לנו למדוד את הפעילות הקטליטית של מוטציות באופן מכונן, הפועלים כראוי. שנית, פיתחנו רומן הפעלה שיתוף הספר של חיל הם כדי להעריך את הפעילות אלוסטריה של המוטציות המלח מתים של קינאז באמצעות N-terminal החלבונים מעוגלים, ביטול הדרישה של ראס פעיל בפרוטוקולים הנוכחיים ובכך להשיג גבוה יותר רגישות. לבסוף, יצרנו ייחודי מפוצל לוציפראז המשלים למדוד את היחס היחסי דיימר/יציבות של המוטציות השונות של חיל ההים, אשר אמין יותר ורגיש לעומת הimmunoprecipitation המסורתית שיתוף. לסיכום, לשיטות אלה יש את היתרונות הבאים: (1) ידידותי למשתמש; (2) מסוגל לבצע ביעילות ללא ציוד מתקדם; (3) חסכוני; (4) מאוד רגיש ומלא הבחנה.

Introduction

משפחת חיל-ההים הבריטי מהווה רכיב מרכזי בדירוג של ras/מק מ, אשר משדרים אות מראס כדי להפעיל את מיאוגן-פרוטאין קינאז (מק ג)^1,2,3,4. משפחה זו של קינסים משחק תפקיד מכריע צמיחת תאים, הישרדות ובידול, ושינויים שלהם לגרום למחלות רבות, בעיקר סרטן^5,6,7,8. לאחרונה, הסקוויה גנומית זיהה מוטציות רבות הקשורות למחלות חיל הים המוצג מאפיינים שונים בשידורי האות של ראס/מט/מק/שמונה מדורגת^9,10,11. אפיון קפדני של מוטציות החיל הרחב יעזור לנו להבין את המנגנונים המולקולריים של כיצד מוטציות חיל הדרכים לשנות את תפוקת האות של RAS/הפלא/מק/לבין המפל, בסופו של דבר לבחור גישות מתאימות לטיפול במחלות שונות בעלי מוטציות של חיל הים.

כולל שלושה חברים, craf, braf, ו araf, אשר יש מבנים מולקולריים דומים אבל יכולות שונות כדי להפעיל את הזרם איתות^1,2,3,4. בקרב הפראלוגים הללו, בראב יש את הפעילות הגבוהה ביותר בזכות המוסריות החוקתית של נ. ת. ע. (N-tמ acidic)^12,13,¹⁴, בעוד araf יש את הנמוך ביותר פעילות הנובעת מוטיב APE לא קאנוני¹⁵. זה עשוי להסביר את תדרי מוטציה שונים של חיל הים paralogs במחלות: BRAF > CRAF > ARAF. יתר על כן, בתוך אותו paralog החיל המלכותי הבריטי, מוטציות באתרים שונים עלולים לעורר אותות במורד הזרם באופן מובהק, אשר מוסיף שכבת מורכבות נוספת לוויסות משפחת חיל-החוץ. מחקרים שנעשו לאחרונה הוכיחו כי כל מדעי החיל יש הן קטליטי ו אלוסטריה פעילויות^{13,14,16,17,18}. מוטציות של חיל-הקצה הפעיל מבחינה חוקתית מפעילים את המטה איתות ישירות על-ידי מק זרחנית, בעוד שמוטציות מסוג קינאז-מתים מסוגלים להפעיל את עמיתיהם הפראיים באמצעות הדימריזציה מצד לצד ולהפעיל איתות של מק-טיפשה באורך^{16 ,19,20}. האהדה והיציבות של דימר הוא פרמטר מפתח שלא רק קובע את הפעילות האלומית של המוטציות המתות-מוות של קינאז, אלא גם משפיע על הפעילות הקטליטית של מוטציות מוטאיות באופן קונסטיטואליות^{15,21, 22}. המוטנטים בעלי החיים המתים בקינאז עם זיקה דימר גבוהה/יציבות יכולים להפעיל את הרדוגני בעלי סוג פראי באופן ישיר¹⁵, בעוד אלה עם זיקה דיימר ביניים/יציבות דורש תיאום של ראס פעיל או מ רמה גבוהה של מולקולות חיל הפרא מסוג פראי לתפקד^{13,15,20,21,23}. באופן דומה, המוטנטים הפעילים ביותר של חיל-החוץ הינם בעלי התלות העצמית של המאה התשעים, ואלה עם אהדה מזיקה נמוכה/יציבות מאבדים את פעילות הקטליטית שלהם בimmunoprecipitation שוברת את החלשים של חיל הה14^{, 21,22}. הזיקה הדימאר/יציבות קובעת גם את רגישות המוטציות של חיל ה, המוטאנטים, ומהווה באופן חיובי את העמידות של מעכבי החיל המלכותי²⁴. לכן, כדי לאפיין את המוטציות הקשורות במחלות, יש למדוד את פעילותם הקטליטית והאלוסטרואית, ואהדה ויציבות.

בשנים האחרונות, המעבדה שלנו ואחרים פיתחו שיטות שונות כדי לאפיין את הקינטיות של משפחת חיל הו ואת המוטציות שלהם. על-פי המעבדה שלנו והניסיון של אחרים, אנו סבורים ששלושת הנושאים הבאים מחייבים יתרונות בהגדרת מוטציות של חיל-החוץ הבריטי: (1) בשיטת הספז שניתן לבצע בקלות כדי לזהות את הפעילות הקטליטית של החוקה המוטנטים הפעילים בחיל המלכותי¹⁵; (2) הפעלה משותפת שיתוף הפעולה הינה שיטה אמינה ונוחה כדי למדוד את הפעילות אלוסטריה של המוטנטים המתים של קינאז,^{13,15,21,22,23, עשרים וחמש}; (3) מפוצל לוציפראז מפוצלת שהוא בעל רגישות גבוהה הרבה יותר במדידת אהדה דיימר יחסי/יציבות של מוטציות חיל ההים הבריטי בניגוד לimmunoprecipitation המסורתית שיתוף, והוא מסוגל לבצע ללא ציוד מתקדם ב בניגוד לשיטות אנליטיות כמותיים כגון spr (Surface Pלזניה Resonance) ניתוח^15,22. שילוב שלושת הנושאים האלה, אנו יכולים להבין בקלות כיצד מוטציה הקשורות במחלות חיל הזרם משנה את איתות במורד ובכך לנצל את האסטרטגיה הטיפולית המתאימה לטיפול במחלה הנגרמת על ידי המוטציה הזאת חיל הים.

Protocol

1. מתוך שיטת חוץ גופית קינאז למדידת הפעילות הקטליטית של מוטציות חיל הים

1. בניית וקטורים קידוד מוטציות חיל הו (איור 1א) עם דגל (DYKDDDDK) תג ב C-טרמינוס על ידי שימוש בעצרת גיבסון או שיבוט המולקולרי המסורתי שיטות.
   1. הציגו את תג הדגל והמוטציות לתוך רצפי הקידוד של חיל הבדיקות, ולאחר מכן הכניסו רצפים שלמים לתוך pCDNA 3.1 (+) וקטור באמצעות הרכבת גיבסון או ליטל ה-DNA של T4 ובעקבות פרוטוקולי הייצור. השתמש בתנאים הבאים לתגובות ה-PCR: (1) 95 ° c, 2 דקות; (2) 95 ° c, 30 ס מ; (3) 59 ° c, 30 ס מ; (4) 68 ° c, 3 דקות; (5) 20 מחזורים של (2 עד 4); (6) החזקת 4 ° c.
      הערה: ה-PCR התחל לשכפול: 5-העתק של מרכז המידע-3 ו-5-4-שלושה מתוך שלוש שלוש.
   2. הכנס את רצף הקידוד של GT במעלה רצפים של קוד מוטציה של חיל ה, כדי ליצור וקטורים קידוד מוטציות התמזגו GT-מותע על ידי שימוש בשיטות אותן כמתואר בשלב 1.1.1.
   3. אמת את כל הווקטורים באמצעות הזגים של דנ א לפני ההעברה.
2. הלוח 293T תאים ב 6-היטב צלחות בצפיפות של 5 x 10⁵ תאים/גם יום אחד לפני הזיהום. כאשר צפיפות התא מגיע 80 ~ 90% המפגש ביום השני, transfect עם וקטורים קידוד דגל מתויג חיל השמש או המוטנטים שלהם משלב 1.1 לתוך התאים על ידי ביצוע הפרוטוקול של הייצור של ריאגנטים החצייה (טבלת חומרים).
3. החליפו את מדיום התרבות 24 שעות לאחר החצייה.
4. מנושף את התרבות בינונית 48 h לאחר הגידול ולהוסיף 400 μL/הבאר של מאגר לפירוק (25 מ"מ טריס · HCl, 150 מ"מ היום, 1 מ"מ מילימטר (EDTA), 0.25% NP-40, pH 7.2) שיושלם עם פרוטאז ו פוספספטאז מעכבי כדי lyse תאים על הקרח.
   הערה: הריכוז של NP-40 במאגר הליזה הוא קריטי לגילוי הפעילות הקטליטית של מוטציות חיל-הים הבריטי עם זיקה מתונה של דימר/יציבות בתוך מבחנה. ריכוז גבוה של חומרי ניקוי או חומר ניקוי חזק במאגר הליזה עשוי לשבור את הדימרס ובכך להרוג את הפעילות הקטליטית של החיל המלכותי או המוטציות שלהם.
5. העבר את lysates תא לצינור 1.5 mL, ספין למטה על ידי 12,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' כדי פסולת תא מרוקן.
6. העברת 300 μL לכל מדגם של ליטים תאים שלמים נקיים לצינורות mL, 1.5 להוסיף 20 μL לכל מדגם של חרוזי אהדה נגד דגל, ולסובב בחדר קר (4 ° c) עבור 1 h. גם לקחת 40 μL לכל מדגם של התאים השלם נקי מחוץ לזיהוי הביטוי והפעילות (פוספאו-ERK1/2) של המוטציות המלכותי על ידי חיסוני כמתואר להלן.
7. לשטוף את החרוזים נגד הדגל פעם אחת עם מאגר הליזה, ואז פעם עם מאגר התגובה קינאז (20 מ"מ HEPES, 10 מ"מ MgCl₂, 0.5 mm Na₃VO₄, 0.5 mm dtt, pH 7.2), ולהוסיף 20 μl של תערובת התגובה קינאז (2 μg של MEK1 (K97A) ו100 μm ATP ב 20 מאגר פעולה) לכל מדגם.
   הערה: יש להשלים את שטיפת החרוזים בעדינות ובמהירות, החוצץ השיורי צריך להיות מוקשה לחלוטין לפני הוספת תערובת התגובה של קינאז, וכל הפעולות בשלב זה אמורות להתבצע ב -4 ° c בחדר קר.
8. להטיל את התגובות קינאז בטמפרטורת החדר (25 ° c) עבור 10 דקות, ולהפוך את הצינורות המכילים התגובות קינאז עם אצבעות בכל דקה אחרת במהלך הדגירה.
9. הוסף 5 μL של מאגר לדוגמה של 5x SDS (375 mM טריס · HCl, 9% נתרן dodecyl סולפט (SDS), 50% גליצרול, 0.03% ברומרופנול כחול) לכל מדגם כדי להפסיק את התגובות קינאז, ולאחר מכן לחמם את הדגימות ב 90 ° c עבור 5 דקות.
10. הפעל את הדגימות ב 9 ~ 12% פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) עם 0.1% SDS, להעביר את החלבונים כדי ניטרוגליצרין הקרום התאית, ולזהות את רמות של פוספהו-מק ו חיל המוטציות המלכותי בדגימות על ידי חיסוני.
    הערה: פוספהו-מק יכול גם להיות כימות באמצעות γ³²P-ATP התאגדות. בקצרה, 10 μm γ³²P-ATP מתווסף למאגר התגובות קינאז, וכמות ה-מק זרחנית מכמת לאחר הפרדת העמוד באמצעות האדיגרפיה האוטומטית הסטנדרטית, הפוספורימטר, או הקלוריות הנוזלית שיטות הספירה כ מתאים.

2. הפעלת שיתוף הפעולה של החברה להערכת פעילות האלוסטריה של קינאז-חיל המוטציות המת

1. בניית וקטורים קידוד המקלט של חיל הנחתים המלכותי (מתחם craf קינאז עם מוטיב של נ. ת. ע בלתי ניתן לתרגום) או מפעילי החיל המלכותי המלח קינאז (חיל הנחתים קינאז, הקמת מוטיב של ת. ד. נ. ד. פ.,האיור 1א) כ מתואר בשלב 1.1.
2. Transfect 293T תאים עם שני וקטורים קידוד הן המקלט המלכותי ואת הראשון קינאז-המלח המלכותי activator או קידוד וקטורי יחיד אחד של חלבונים כמתואר בשלבים 1.2 ו 1.3.
3. החלף את בינונית התרבות ב 24 שעות לאחר החצייה, ו 293T הקציר הטרנספלרים ב 48 h כדי להכין את כל lysates תא כמתואר בשלבים 1.4 ו 1.5.
4. מערבבים את התאים הנקיים שלמים עם מאגר המדגם 5x SDS במהירות בטמפרטורת החדר (25 ° c) ולאחר מכן מרתיחים ב 90 ° c עבור 5 דקות.
5. הפעל את הדגימות תא שלם מבושל בשנת 9 ~ 12% עמוד עם 0.1% SDS, להעביר את החלבונים כדי ניטרוצלולוזה קרום, ולזהות את רמות של פוספאו-ERK1/2 וחלבונים לשלוט על ידי חיסוני.

3. בחינם מפוצל לוציפראז שיטת למדידת אהדה Dimer היחסי/יציבות של חיל המוטציות

1. בניית וקטורים קידוד דגל-מתויג חיל המוטאס מוטציות התמזגו N-טרמינוס של Nluc (N-טרמינוס של גחלילית לוציפראז, aa2-416) או C-טרמינוס של Cluc (C-טרמינוס של גחלילית לוציפראז, aa398-550) כמתואר בשלב 1.1.
2. Transfect 293T תאים עם זוג וקטורים קידוד שונים Nluc-המוטנטים מוטציות ו Cluc-חיל המוטציות כמתואר בשלב 1.2.
3. ב -24 שעות לאחר החצייה, replate 293T מעבר תאים לתוך לוחות תמונה שחורה שחור בצפיפות התא של 2x10⁵ לכל טוב עם בינונית ללא צבע (כלומר, DMEM גברת ללא פנול אדום).
4. 24 שעות מאוחר יותר, להוסיף D-לluciferin (0.2 mg/mL) 293T הטרנספררים תא, מודטה עבור 30 דקות, ולמדוד את האותות לוציפראז באמצעות מערכת זיהוי רב (טבלת חומרים).
5. לאחר מדידת אותות לוציפראז, מתיף את המדיום ואת lyse 293T הטרנספררים עם מאגר לפירוק להכין את כל lysates תא כמתואר בשלבים 1.4 ו 1.5.
6. הפעל את כל הדגימות של התא בתוך 9 ~ 12% עמוד עם 0.1% SDS ולזהות את רמות הביטוי של מוטציות Nluc-חיל ה, מוטציות Cluc-חיל ידי אנטי דגל כמתואר בשלב 2.5. רמות הביטוי היחסיות הן של המוטציות Nluc-סי והן של המוטציות ה-Cluc-293T מוטצות באמצעות התמונה J מתוך הכתמים האימונוגנטים שלהם.
7. לנרמל את האותות לוציפראז של 293T תא הטרנספררים על פי רמות הביטוי של המוטציות Nluc-חיל ו מוטציות Cluc-. בקצרה, זה מושגת על ידי חלוקת האות הלוציפראז raw על ידי רמות הביטוי היחסי של מוטציות Nluc-חיל ה, מוטציות Cluc-חיל משלב 3.6.

תוצאות

משפחת חיל-ההים הבריטי הינם בעלי פעילויות קטליטי ו-אלוסטריה, המאפשרות למוטציות הקשורות במחלות שלהם להפעיל את איתות הזרם דרך מנגנונים שונים^13,14,^{16,17 ,18}. המוטנטים הפעילים מבחינה חוקתית באופן ישיר מזטים א?...

Discussion

במאמר זה, הצגנו שלוש שיטות לאפיון מוטציות הקשורות למחלות, אשר כוללות את שיטת הפעולה הבין-גופית, שיתוף הפעולה של החיל המלכותי הבריטי ושיטת לוציפראז מפוצלת בחינם. מאז חיל הים הבריטי יש גם פעילות קטליטית ו אלוסטריה פעילות, מוטציות מסוגים שונים של חיל הים יכול להפעיל את הזרם איתות דרך שני מנגנ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-phosphoERK1/2	Cell Signaling Technologies	4370
anti-phosphoMEK1/2	Cell Signaling Technologies	9154
anti-ERK1/2	AB clonal	A0229
anti-MEK1/2	Cell Signaling Technologies	9124
anti-FLAG(mouse)	Sigma-Aldrich	F3165
anti-HA	Novus Biologicals	MAB6875
anti-FLAG(Rabbit)	Cell Signaling Technologies	14793
anti-β-actin	Sigma-Aldrich	A2228
anti-FLAG beads(M2)	Sigma-Aldrich	A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG	Jackson Laboratories	115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG	Jackson Laboratories	111-035-144
pcDNA3.1(+)	In vitrogen	V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit	New England Biolabs	E5510
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668019
Fugene 6	Roche	11 814 443 001
DMEM w/o phenol red	Invitrogen	21063-029
D-luciferin	GoldBio	LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)	prepared in our previous studies	N.A.	Reference 15.
GloMax-Multi Detection System.	Promega	E7041