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  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo demuestra cómo utilizar un sistema electrofisiológico para la estimulación de bucle cerrado desencadenada por patrones de actividad neuronal. También se proporciona código Matlab de ejemplo que se puede modificar fácilmente para diferentes dispositivos de estimulación.

Resumen

Los sistemas neurofisiológicos de bucle cerrado utilizan patrones de actividad neuronal para desencadenar estímulos, que a su vez afectan la actividad cerebral. Estos sistemas de bucle cerrado ya se encuentran en aplicaciones clínicas, y son herramientas importantes para la investigación cerebral básica. Un desarrollo reciente particularmente interesante es la integración de enfoques de bucle cerrado con optogenética, de modo que patrones específicos de actividad neuronal pueden desencadenar la estimulación óptica de grupos neuronales seleccionados. Sin embargo, la creación de un sistema electrofisiológico para experimentos de bucle cerrado puede ser difícil. Aquí, se proporciona un código Matlab listo para aplicar para activar estímulos basados en la actividad de una o varias neuronas. Este código de ejemplo se puede modificar fácilmente en función de las necesidades individuales. Por ejemplo, muestra cómo activar estímulos de sonido y cómo cambiarlo para activar un dispositivo externo conectado a un puerto serie de PC. El protocolo presentado está diseñado para trabajar con un popular sistema de grabación neuronal para estudios en animales (Neuralynx). La implementación de la estimulación de bucle cerrado se demuestra en una rata despierta.

Introducción

El objetivo de este protocolo es demostrar cómo implementar la estimulación de bucle cerrado en experimentos neurofisiológicos. La configuración típica para experimentos de bucle cerrado en neurociencia implica desencadenar estímulos basados en la lectura en línea de la actividad neuronal. Esto, a su vez, causa modificaciones en la actividad cerebral, cerrando así el bucle de retroalimentación1,2. Estos experimentos de bucle cerrado proporcionan múltiples beneficios sobre las configuraciones estándar de bucle abierto, especialmente cuando se combina con optogenética, lo que permite a los investigadores apuntar a un subconjunto específico de neuronas. Por ejemplo, Siegle y Wilson utilizaron manipulaciones de bucle cerrado para estudiar el papel de las oscilaciones theta en el procesamiento de información3. Demostraron que estimular las neuronas del hipocampo en la fase descendente de las oscilaciones de la theta tenía efectos diferentes en el comportamiento que aplicar la misma estimulación en la fase ascendente. Los experimentos de bucle cerrado también son cada vez más importantes en los estudios preclínicos. Por ejemplo, estudios múltiples de epilepsia han demostrado que la estimulación neuronal desencadenada al inicio de convulsiones es un enfoque eficaz para reducir la gravedad de las convulsiones4,5,6. Además, los sistemas de detección automatizada de convulsiones y la administración contingente de terapia7,8 mostraron beneficios significativos en pacientes con epilepsia9,10,11,12. Otro área de aplicación con rápido avance de metodologías de bucle cerrado es el control de neuroprótesis con interfaces corticales cerebro-máquina. Esto se debe a que proporcionar retroalimentación instantánea a los usuarios de dispositivos protésicos mejora significativamente la precisión y la capacidad13.

En los últimos años, varios laboratorios han desarrollado sistemas personalizados para el registro eléctrico simultáneo de la actividad neuronal y la entrega de estímulos en un sistema de bucle cerrado14,15,16,17,18. Aunque muchas de esas configuraciones tienen características impresionantes, no siempre es fácil implementarlas en otros laboratorios. Esto se debe a que los sistemas a menudo exigen técnicos experimentados para ensamblar la electrónica necesaria y otros componentes de hardware y software necesarios.

Por lo tanto, con el fin de facilitar la adopción de experimentos de bucle cerrado en la investigación de neurociencia, este documento proporciona un protocolo y código Matlab para convertir una configuración de grabación electrofisiológica de bucle abierto19,20,21,22 en un sistema de bucle cerrado2,6,23. Este protocolo está diseñado para trabajar con el hardware de grabación Digital Lynx, un popular sistema de laboratorio para grabaciones de población neuronal. Un experimento típico consiste en lo siguiente: 1) Grabación de 5-20 minutos de datos de pico; 2) Clasificación de picos para crear plantillas neuronales; 3) Uso de estas plantillas para realizar la detección en línea de patrones de actividad neuronal; y 4) Activación de estimulación o eventos experimentales cuando se detectan patrones especificados por el usuario.

Protocolo

Todos los procedimientos descritos aquí se realizaron bajo un Protocolo de Investigación Animal aprobado por el Comité de Bienestar Animal de la Universidad de Lethbridge.

1. Cirugía

NOTA: Los procedimientos de cirugía utilizados para implantar sondas para grabaciones neurofisiológicas se han presentado en otras publicaciones24,25,26. Los detalles exactos de la cirugía para la estimulación de bucle cerrado dependen del tipo de sondas de grabación utilizadas y de las áreas cerebrales objetivo. En la mayoría de los casos, sin embargo, una cirugía típica consistirá en los siguientes pasos.

  1. Llevar a la sala de cirugía una jaula con una rata para ser implantada con una sonda de silicona o una matriz de electrodos para registrar la actividad neuronal.
  2. Anestetiza el roedor con 2-2.5% de isoflurano y fija la cabeza en un marco estereono. Asegúrese de que el animal esté inconsciente durante la cirugía observando cualquier reacción motora a los estímulos táctiles leves25.
  3. Aplique una pomada para los ojos para minimizar la sequedad durante la cirugía.
  4. Afeitar el área quirúrgica y desinfectar la piel con 2% solución de clorhexidina y 70% alcohol isopropílico.
  5. Inyecte lidocaína (5 mg/kg) debajo del cuero cabelludo sobre el área del cerebro donde se implantarán electrodos.
  6. Hacer una incisión del cuero cabelludo sobre el área del implante futuro, y utilizar un bisturí y un hisopo de algodón para eliminar el periosteum del cráneo expuesto25.
  7. Taladre 4-8 orificios en el cráneo para la implantación de tornillos de anclaje (0,5 mm) como soporte estructural para el implante25. Fije los tornillos al cráneo insertándolos en los orificios y asegúrese de que se mantengan firmemente en su lugar.
  8. Taladre la craneotomía en las coordenadas especificadas e incoe el implante de micromotor/sonda.
    NOTA: El protocolo descrito para la estimulación de bucle cerrado funcionará para cualquier región cerebral en la que se inserten los electrodos.
  9. Fije la microunidad/sonda y cualquier conector de interfaz eléctrica necesario al cráneo usando acrílico dental. La cantidad de acrílico dental debe ser suficiente para fijar firmemente el implante, pero no debe entrar en contacto con el tejido blando circundante25.
  10. Después de la cirugía, controlar de cerca al animal hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la recumbencia esternal25. Durante los 3 días siguientes, administrar por vía subcutánea un analgésico (por ejemplo, Metacam, 1 mg/kg) y un antibiótico para prevenir la infección (por ejemplo, enrofloxacino, 10 mg/kg).
    NOTA: Por lo general, los animales se recuperan de la cirugía durante una semana antes de cualquier prueba o grabación.

2. Instalación de software

NOTA: Esto se ha probado en Windows 10, versión de 64 bits.

  1. Instale el software de adquisición y procesamiento de datos.
    1. Instale el sistema de adquisición de datos Cheetah 6.4 (https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control), que incluye bibliotecas para interactuar con el Sistema de Adquisición de Cheetah.
    2. Instale SpikeSort3D (https://neuralynx.com/software/spikesort-3d) o cualquier otro software que utilice KlustaKwik27 para la clasificación de picos. El software de detección en línea utiliza las definiciones de clúster del motor KlustaKwik. Este software puede ejecutarse en el mismo equipo, o puede ejecutarse en equipos independientes que están en la misma red.
    3. Instale el NetComDevelopmentPackage (https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0), que también se puede descargar desde https://neuralynx.com/software/netcom-development-package.
  2. Instale Matlab (https://www.mathworks.com/downloads/; el código se probó en la versión R2018a de Matlab). Asegúrese de que Matlab está habilitado en el firewall de Windows. Normalmente aparecerá una ventana emergente durante la primera conexión.
    1. Inicie sesión en una cuenta de Matlab. Elija la licencia. Elija la versión. Elija el sistema operativo.
  3. Descargue la siguiente biblioteca para el desencadenamiento de eventos en línea desde: https://github.com/leomol/cheetah-interface y extraiga archivos en la carpeta 'Documents/Matlab' del equipo. Se proporciona una copia del código en los Materiales Suplementarios adjuntos.

3. Adquisición inicial de datos

  1. Inicie la adquisición de datos con el software Cheetah.
  2. Registre unos minutos de datos de sppiking para rellenar formas de onda de plantilla.
  3. Detenga la adquisición de datos y realice la ordenación de picos en los datos registrados.
    1. Abra SpikeSort3D, haga clic en Archivo . Menú de la casa de la zona de Cargar archivo de espigay seleccione un archivo de pico de la carpeta con los datos grabados.
    2. Haga clic en Menú de clúster y, a continuación, en Autocluster con KlustaKwik, dejando la configuración predeterminada y haga clic en Ejecutar.

4. Experimento de bucle cerrado

  1. Reanudar la adquisición de datos en Cheetah.
  2. Abra Matlab.
    1. Abra ClosedLoop.m y haga clic en Ejecutar. Como alternativa, en la ventana de comandos de Matlab, ejecute ClosedLoop(). Asegúrese de que ClosedLoop.m está en la ruta de acceso de Matlab. Si el usuario desea emplear una función personalizada para llamar a cada desencadenador, ejecute ClosedLoop('-callback', customFunction) en su lugar, donde customFunction es un identificador de esa función.
    2. Cargue la información de pico definida en la grabación inicial haciendo clic en Cargar, navegando a la carpeta de grabación y seleccionando uno de los archivos de datos de sppiking (.ntt, .nse).
    3. Seleccione una o varias neuronas que desencadenarán la estimulación haciendo clic en la casilla de verificación debajo de las formas de onda trazadas.
    4. Defina el número mínimo de neuronas que desencadenarán la estimulación escribiendo un entero en el cuadro de texto "min matches"; y definir la ventana de tiempo en la que los picos que coinciden con diferentes formas de onda se consideran coactivos escribiendo un número en el cuadro de texto "ventana".
    5. Haga clic en Enviar para iniciar. Esto comenzará la activación en línea de eventos (tonos por defecto) basado en la actividad de pico de las neuronas seleccionadas.

Resultados

Las ratas Fisher-Brown Noruega nacidas y criadas in situ fueron habituadas a la manipulación durante dos semanas antes del experimento. Se implantó quirúrgicamente una unidad de grabación, similar a los métodos descritos anteriormente28,29,30,31,32,33,34. Las señales neuronales se regi...

Discusión

El protocolo descrito aquí, muestra cómo utilizar un sistema de grabación neurofisiológica estándar para realizar la estimulación de bucle cerrado. Este protocolo permite a los neurocientíficos con experiencia limitada en ciencias de la computación implementar rápidamente una variedad de experimentos de bucle cerrado con poco costo. Tales experimentos son a menudo necesarios para estudiar las interacciones causales en el cerebro.

Después de preparar un animal e instalar el software (...

Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses relacionados con esta obra.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de NSERC Discovery a AL y AG.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
BaytrilBayer, Mississauga, CADIN 02169428antibiotic; 50 mg/mL
Cheetah 6.4NeuraLynx, Tucson, AZ6.4.0.betaSoftware interfaces for data acquisition 
Digital Lynx 4SXNeuraLynx, Tucson, AZ4SXrecording equipment
Headstage transmitterTBSIB10-3163-GKtransmits the neural signal to the receiver
IsofluraneFresenius Kabi, Toronto, CADIN 02237518inhalation anesthetic
Jet Denture Powder & LiqudLang Dental, Wheeling, US1230dental acrylic
Lacri-LubeAllergan, Markham, CADIN 00210889eye ointment
Lido-2Rafter 8, CalgaryDIN 00654639local anesthetic; 20 mg/mL
MatlabMathworksR2018bsoftware for signal processing and triggering external events
MetacamBoehringer, Ingelheim, DEDIN 02240463analgesic; 5 mg/mL
NetcomNeuraLynxv1Application Programming Interface (API) that communicates with Cheetah
Silicone probeCambridge NeurotechASSY-156-DBC2implanted device
SpikeSort 3D NeuraLynx, Tucson, AZSS3Dspike waveform-to-cell classification tools
Wireless Radio ReceiverTBSI911-1062-00transmits the neural signal to the Digital Lynx

Referencias

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  3. Siegle, J. H., Wilson, M. A. Enhancement of encoding and retrieval functions through theta phase-specific manipulation of hippocampus. Elife. 3, 03061 (2014).
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