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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt, wie ein elektrophysiologisches System zur geschlossenen Stimulation verwendet wird, das durch neuronale Aktivitätsmuster ausgelöst wird. Beispiel-Matlab-Code, der leicht für verschiedene Stimulationsgeräte geändert werden kann, wird ebenfalls bereitgestellt.

Zusammenfassung

Geschlossene neurophysiologische Systeme verwenden Muster neuronaler Aktivität, um Reize auszulösen, die wiederum die Gehirnaktivität beeinflussen. Solche Closed-Loop-Systeme sind bereits in klinischen Anwendungen zu finden und sind wichtige Werkzeuge für die grundlegende Hirnforschung. Eine besonders interessante jüngste Entwicklung ist die Integration von Closed-Loop-Ansätzen mit der Optogenetik, so dass spezifische Muster neuronaler Aktivität eine optische Stimulation ausgewählter neuronaler Gruppen auslösen können. Die Einrichtung eines elektrophysiologischen Systems für geschlossene Experimente kann jedoch schwierig sein. Hier wird ein gebrauchsfertiger Matlab-Code zur Auslösung von Reizen bereitgestellt, die auf der Aktivität einzelner oder mehrerer Neuronen basieren. Dieser Beispielcode kann leicht auf der Grundlage individueller Bedürfnisse geändert werden. Zum Beispiel zeigt es, wie Man Soundreize auslöst und wie man es ändert, um ein externes Gerät auszulösen, das an einen seriellen PC-Anschluss angeschlossen ist. Das vorgestellte Protokoll soll mit einem beliebten neuronalen Aufzeichnungssystem für Tierstudien (Neuralynx) arbeiten. Die Umsetzung der Closed-Loop-Stimulation wird in einer wachen Ratte demonstriert.

Einleitung

Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie in neurophysiologischen Experimenten eine geschlossene Stimulation implementiert wird. Das typische Setup für Closed-Loop-Experimente in der Neurowissenschaft beinhaltet das Auslösen von Reizen basierend auf der Online-Auslesung neuronaler Aktivität. Dies wiederum bewirkt Veränderungen in der Hirnaktivität und schließt so die Rückkopplungsschleife1,2. Solche Closed-Loop-Experimente bieten mehrere Vorteile gegenüber Standard-Open-Loop-Setups, insbesondere in Kombination mit Optogenetik, die es Forschern ermöglicht, eine bestimmte Teilmenge von Neuronen anzusprechen. Siegle und Wilson verwendeten beispielsweise geschlossene Schleifenmanipulationen, um die Rolle der Theta-Oszillationen in der Informationsverarbeitung zu untersuchen3. Sie zeigten, dass die Stimulierung von Hippocampus-Neuronen in der fallende Phase der Theta-Oszillationen andere Auswirkungen auf das Verhalten hatte als die Anwendung der gleichen Stimulation auf die aufsteigende Phase. Auch in präklinischen Studien werden geschlossene Experimente immer wichtiger. Zum Beispiel haben mehrere Epilepsie-Studien gezeigt, dass neuronale Stimulation ausgelöst bei Anfall-Beginn ist ein effektiver Ansatz, um die Schwere der Anfälle zu reduzieren4,5,6. Darüber hinaus zeigten Systeme zur automatisierten Anfallserkennung und die bedingte Durchführung der Therapie7,8 signifikante Vorteile bei Epilepsiepatienten9,10,11,12. Ein weiterer Anwendungsbereich mit der schnellen Weiterentwicklung von Closed-Loop-Methoden ist die Steuerung der Neuroprothetik mit kortikalen Gehirn-Maschine-Schnittstellen. Dies liegt daran, dass die sofortige Rückmeldung an Benutzer von Prothesen deutlich verbessert Genauigkeit und Fähigkeit13.

In den letzten Jahren haben mehrere Labore kundenspezifische Systeme für die gleichzeitige elektrische Aufzeichnung der neuronalen Aktivität und die Abgabe von Reizen in einem geschlossenen Kreislaufsystem14,15,16,17,18entwickelt. Obwohl viele dieser Setups beeindruckende Eigenschaften aufweisen, ist es nicht immer einfach, sie in anderen Labors zu implementieren. Dies liegt daran, dass die Systeme oft erfahrene Techniker benötigen, um die benötigte Elektronik und andere notwendige Hardware- und Softwarekomponenten zu montieren.

Um die Annahme von geschlossenen Experimenten in der neurowissenschaftlichen Forschung zu erleichtern, bietet dieses Papier daher ein Protokoll und Matlab-Code, um ein open-loop elektrophysiologisches Aufzeichnungs-Setup19,20,21,22 in ein Closed-Loop-System2,6,23umzuwandeln. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um mit der Digital Lynx Aufnahmehardware zu arbeiten, einem beliebten Laborsystem für neuronale Bevölkerungsaufzeichnungen. Ein typisches Experiment besteht aus den folgenden: 1) Aufzeichnung von 5-20 Minuten Spiking-Daten; 2) Spike-Sortierung, um neuronale Vorlagen zu erstellen; 3) Verwendung dieser Vorlagen zur Online-Erkennung von neuronalen Aktivitätsmustern; und 4) Auslösen von Stimulations- oder experimentellen Ereignissen, wenn benutzerspezifische Muster erkannt werden.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Verfahren wurden im Rahmen eines Tierforschungsprotokolls durchgeführt, das vom Tierschutzausschuss der Universität Lethbridge genehmigt wurde.

1. Chirurgie

HINWEIS: Die chirurgischen Verfahren zur Implantation von Sonden für neurophysiologische Aufzeichnungen wurden in anderen Publikationen24,25,26vorgestellt. Die genauen Details der Operation zur geschlossenen Stimulation hängen von der Art der verwendeten Aufnahmesonden und den zielgerichteten Hirnbereichen ab. In den meisten Fällen besteht jedoch eine typische Operation aus den folgenden Schritten.

  1. Bringen Sie einen Käfig mit einer Ratte in den Operationssaal, um mit einer Silikonsonde oder einem Elektrodenarray implantiert zu werden, um die neuronale Aktivität aufzuzeichnen.
  2. Anästhetisieren Sie das Nagetier mit 2-2,5% Isofluran und fixieren Sie den Kopf in einem stereotaxic Rahmen. Stellen Sie sicher, dass das Tier während der Operation bewusstlos ist, indem Sie jede motorische Reaktion auf leichte taktile Reizebeobachten 25.
  3. Tragen Sie eine Augensalbe auf, um die Trockenheit während der Operation zu minimieren.
  4. Rasieren Sie den operationsfolgenden Bereich und desinfizieren Sie die Haut mit 2% Chlorhexidinlösung und 70% Isopropylalkohol.
  5. Injizieren Sie Lidocain (5 mg/kg) unter die Kopfhaut über den Hirnbereich, wo Elektroden implantiert werden.
  6. Machen Sie einen Schnitt der Kopfhaut über den Bereich des zukünftigen Implantats, und verwenden Sie ein Skalpell und Wattestäbchen, um das Periost efeld vom exponierten Schädel25zu löschen.
  7. Bohren Sie 4-8 Löcher in den Schädel für die Implantation von Ankerschrauben (ca. 0,5 mm) als Strukturelle Unterstützung für das Implantat25. Befestigen Sie die Schrauben am Schädel, indem Sie sie in die Löcher einsetzen und sicherstellen, dass sie fest an Ort und Stelle gehalten werden.
  8. Bohren Sie die Kraniotomie an den angegebenen Koordinaten, und setzen Sie das Mikroantriebs-/Sondenimplantat ein.
    HINWEIS: Das beschriebene Protokoll für die Closed-Loop-Stimulation funktioniert für jede Hirnregion, in die die Elektroden eingesetzt werden.
  9. Befestigen Sie den Microdrive/Sonden und alle erforderlichen elektrischen Schnittstellenstecker mit Zahnacryl am Schädel. Die Menge an Zahnacryl sollte ausreichen, um das Implantat fest zu befestigen, aber es sollte nicht in Kontakt mit dem umgebenden Weichgewebekommen 25.
  10. Nach der Operation, genau überwachen Sie das Tier, bis es wieder genügend Bewusstsein, um Brustbein recumbency25zu erhalten. Für die folgenden 3 Tage subkutan ein Schmerzmittel (z. B. Metacam, 1 mg/kg) und ein Antibiotikum zur Vorbeugung einer Infektion (z. B. Enrofloxacin, 10 mg/kg) verabreichen.
    HINWEIS: Tiere werden in der Regel eine Woche vor tests oder Aufzeichnungen von einer Operation erholt.

2. Softwareinstallation

HINWEIS: Dies wurde unter Windows 10, 64-Bit-Version getestet.

  1. Installieren Sie Datenerfassungs- und -verarbeitungssoftware.
    1. Installieren Sie das Datenerfassungssystem Cheetah 6.4 (https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control), das Bibliotheken zur Interaktion mit dem Cheetah Acquisition System enthält.
    2. Installieren Sie SpikeSort3D (https://neuralynx.com/software/spikesort-3d) oder jede andere Software, die KlustaKwik27 für die Spike-Sortierung verwendet. Die Online-Erkennungssoftware verwendet die Clusterdefinitionen der KlustaKwik-Engine. Diese Software kann auf demselben Computer oder auf separaten Computern ausgeführt werden, die sich im selben Netzwerk befinden.
    3. Installieren Sie das NetComDevelopmentPackage (https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0), das auch von https://neuralynx.com/software/netcom-development-package heruntergeladen werden kann.
  2. Installieren Sie Matlab (https://www.mathworks.com/downloads/; Code wurde auf Matlab Version R2018a getestet). Stellen Sie sicher, dass Matlab in der Windows-Firewall aktiviert ist. Normalerweise wird während der ersten Verbindung ein Pop-up angezeigt.
    1. Melden Sie sich bei einem Matlab-Konto an. Wählen Sie die Lizenz. Wählen Sie die Version aus. Wählen Sie das Betriebssystem aus.
  3. Laden Sie die folgende Bibliothek für die Auslösung von Online-Events herunter aus: https://github.com/leomol/cheetah-interface und extrahieren Sie Dateien in den Ordner "Documents/Matlab" des Computers. Eine Kopie des Codes finden Sie in den begleitenden Ergänzenden Materialien.

3. Erste Datenerfassung

  1. Starten Sie die Datenerfassung mit der Cheetah-Software.
  2. Zeichnen Sie ein paar Minuten Spiking-Daten auf, um Vorlagenwellenformen aufzufüllen.
  3. Beenden Sie die Datenerfassung, und führen Sie die Spike-Sortierung der aufgezeichneten Daten durch.
    1. Öffnen SpikeSort3D, klicken Sie auf Datei | Menü | Laden Sie Spike File, und wählen Sie eine Spike-Datei aus dem Ordner mit aufgezeichneten Daten aus.
    2. Klicken Sie auf Clustermenü und dann auf Autocluster mit KlustaKwik, sodass die Standardeinstellungen beibehalten werden, und klicken Sie auf Ausführen.

4. Closed-Loop-Experiment

  1. Nehmen Sie die Datenerfassung in Cheetah fort.
  2. Öffnen Sie Matlab.
    1. Öffnen Sie ClosedLoop.m und klicken Sie auf Ausführen. Alternativ führen Sie im Matlab-Befehlsfenster ClosedLoop() aus. Stellen Sie sicher, dass sich ClosedLoop.m auf dem Matlab-Pfad befindet. Wenn der Benutzer eine benutzerdefinierte Funktion verwenden möchte, um jeden Trigger aufzurufen, führen Sie stattdessen ClosedLoop('-callback', customFunction) aus, wobei customFunction ein Handle für diese Funktion ist.
    2. Laden Sie die spike-Informationen, die bei der ersten Aufzeichnung definiert sind, indem Sie auf Ladenklicken, in den Aufzeichnungsordner navigieren und eine der spiking-Datendateien auswählen (.ntt, .nse).
    3. Wählen Sie eine oder mehrere Neuronen aus, die eine Stimulation auslösen, indem Sie auf das Kontrollkästchen unter den geplotteten Wellenformen klicken.
    4. Definieren Sie die minimale Anzahl von Neuronen, die die Stimulation auslösen, indem Sie eine ganze Zahl in das Textfeld"min matches" eingeben. und definieren Sie das Zeitfenster, in dem Spitzen, die verschiedenen Wellenformen entsprechen, als co-aktiv betrachtet werden, indem Sie eine Zahl in das Textfeld "Fenster" eingeben.
    5. Klicken Sie auf Senden, um zu starten. Dies beginnt das Online-Auslösen von Ereignissen (Töne als Standard) basierend auf der Spiking-Aktivität ausgewählter Neuronen.

Ergebnisse

Fisher-Brown Norwegen Ratten geboren und aufgewachsen vor Ort wurden für den Umgang für zwei Wochen vor dem Experiment gewöhnt. Ein Aufnahmelaufwerk wurde chirurgisch implantiert, ähnlich wie zuvorbeschriebeneMethoden 28,29,30,31,32,33,34. Die neuronalen Signale wurden bei 32 kHz mit ein...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll zeigt, wie ein standardneurophysiologisches Aufzeichnungssystem verwendet wird, um eine geschlossene Stimulation durchzuführen. Dieses Protokoll ermöglicht es Neurowissenschaftlern mit begrenztem Fachwissen in der Informatik, schnell eine Vielzahl von geschlossenen Experimenten mit geringen Kosten durchzuführen. Solche Experimente sind oft notwendig, um kausale Wechselwirkungen im Gehirn zu untersuchen.

Nach der Vorbereitung eines Tieres und der Installation ...

Offenlegungen

Autoren haben keinen Interessenkonflikt im Zusammenhang mit dieser Arbeit.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch NSERC Discovery-Stipendien an AL und AG unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
BaytrilBayer, Mississauga, CADIN 02169428antibiotic; 50 mg/mL
Cheetah 6.4NeuraLynx, Tucson, AZ6.4.0.betaSoftware interfaces for data acquisition 
Digital Lynx 4SXNeuraLynx, Tucson, AZ4SXrecording equipment
Headstage transmitterTBSIB10-3163-GKtransmits the neural signal to the receiver
IsofluraneFresenius Kabi, Toronto, CADIN 02237518inhalation anesthetic
Jet Denture Powder & LiqudLang Dental, Wheeling, US1230dental acrylic
Lacri-LubeAllergan, Markham, CADIN 00210889eye ointment
Lido-2Rafter 8, CalgaryDIN 00654639local anesthetic; 20 mg/mL
MatlabMathworksR2018bsoftware for signal processing and triggering external events
MetacamBoehringer, Ingelheim, DEDIN 02240463analgesic; 5 mg/mL
NetcomNeuraLynxv1Application Programming Interface (API) that communicates with Cheetah
Silicone probeCambridge NeurotechASSY-156-DBC2implanted device
SpikeSort 3D NeuraLynx, Tucson, AZSS3Dspike waveform-to-cell classification tools
Wireless Radio ReceiverTBSI911-1062-00transmits the neural signal to the Digital Lynx

Referenzen

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