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Resumo

Este protocolo demonstra como usar um sistema eletrofisiológico para estimulação de circuito fechado desencadeada por padrões de atividade neuronal. O código matlab da amostra que pode facilmente ser modificado para dispositivos diferentes da estimulação é fornecido igualmente.

Resumo

Sistemas neurofisiológicos de circuito fechado usam padrões de atividade neuronal para desencadear estímulos, que por sua vez afetam a atividade cerebral. Tais sistemas de circuito fechado já são encontrados em aplicações clínicas, e são ferramentas importantes para a pesquisa básica do cérebro. Um desenvolvimento recente particularmente interessante é a integração de abordagens de circuito fechado com optogenética, de modo que padrões específicos de atividade neuronal podem desencadear estimulação óptica de grupos neuronais selecionados. No entanto, a criação de um sistema eletrofisiológico para experimentos de circuito fechado pode ser difícil. Aqui, um código Matlab pronto para aplicar é fornecido para desencadear estímulos com base na atividade de neurônios individuais ou múltiplos. Este código de amostra pode ser facilmente modificado com base nas necessidades individuais. Por exemplo, ele mostra como acionar estímulos de som e como alterá-lo para acionar um dispositivo externo conectado a uma porta de série de PC. O protocolo apresentado é projetado para trabalhar com um sistema de gravação neuronal popular para estudos com animais (Neuralynx). A implementação da estimulação de circuito fechado é demonstrada em um rato acordado.

Introdução

O objetivo deste protocolo é demonstrar como implementar a estimulação de ciclo fechado em experimentos neursiológicos. A configuração típica para experimentos de circuito fechado em neurociência envolve o desencadeamento de estímulos com base na leitura on-line da atividade neuronal. Isso, por sua vez, provoca modificações na atividade cerebral, fechando assim o loop de feedback1,2. Tais experimentos de circuito fechado fornecem múltiplos benefícios sobre configurações padrão de loop aberto, especialmente quando combinados com optogenética, o que permite aos pesquisadores atingir um subconjunto específico de neurônios. Por exemplo, Siegle e Wilson usaram manipulações de circuito fechado para estudar o papel das oscilações de no processamento de informações3. Eles demonstraram que estimular os neurônios hipocampais na fase de queda das oscilações de teve efeitos diferentes sobre o comportamento do que aplicar a mesma estimulação na fase crescente. Experimentos de circuito fechado também estão se tornando cada vez mais importantes em estudos pré-clínicos. Por exemplo, estudos de epilepsia múltipla têm mostrado que a estimulação neuronal desencadeada no início da convulsão é uma abordagem eficaz para reduzir a gravidade das convulsões4,5,6. Além disso, os sistemas de detecção automatizada de convulsões e a entrega contingente da terapia7,8 apresentaram benefícios significativos em pacientes com epilepsia9,10,11,12. Outra área de aplicação com rápido avanço de metodologias de circuito fechado é o controle de neuropróteses com interfaces corticais cérebro-máquina. Isso ocorre porque fornecer feedback instantâneo aos usuários de dispositivos protéticos melhora significativamente a precisão e a capacidade13.

Nos últimos anos, vários laboratórios desenvolveram sistemas personalizados para o registro elétrico simultâneo da atividade neuronal e entrega de estímulos em um sistema de circuito fechado14,15,16,17,18. Embora muitas dessas configurações tenham características impressionantes, nem sempre é fácil implementá-las em outros laboratórios. Isso ocorre porque os sistemas muitas vezes exigem técnicos experientes para montar a eletrônica necessária e outros componentes de hardware e software necessários.

Portanto, a fim de facilitar a adoção de experimentos de circuito fechado em pesquisa em neurociência, este artigo fornece um protocolo e código Matlab para converter uma configuração de gravação eletrofisiológica de loop aberto19,20,21,22 em um sistema de circuito fechado2,6,23. Este protocolo é projetado para funcionar com o hardware de gravação Digital Lynx, um sistema de laboratório popular para gravações da população neuronal. Um experimento típico consiste no seguinte: 1) Gravação de 5 a 20 minutos de dados de cravagem; 2) Classificação de pico para criar modelos neuronais; 3) Usando esses modelos para executar a detecção on-line de padrões de atividade neural; e 4) Desencadeando estimulação ou eventos experimentais quando padrões especificados pelo usuário são detectados.

Protocolo

Todos os procedimentos descritos aqui foram realizados um Protocolo de Pesquisa Animal aprovado pelo Comitê de Bem-Estar Animal da Universidade de Lethbridge.

1. Cirurgia

NOTA: Os procedimentos cirúrgicos utilizados para implantar sondas para gravações neurofisiológicas foram apresentados em outras publicações24,25,26. Os detalhes exatos da cirurgia para estimulação de circuito fechado dependem do tipo de sondas de gravação usadas e das áreas cerebrais direcionadas. Na maioria dos casos, no entanto, uma cirurgia típica consistirá nas seguintes etapas.

  1. Traga para a sala de cirurgia uma gaiola com um rato para ser implantado com uma sonda de silicone ou matriz de eletrodos para registrar a atividade neuronal.
  2. Anestesie o roedor com isoflurano de 2-2,5% e fixe a cabeça em um quadro estereotaxico. Certifique-se de que o animal está inconsciente durante a cirurgia, observando qualquer reação motora aos estímulos táteis leves25.
  3. Aplique uma pomada ocular para minimizar a secura durante a cirurgia.
  4. Raspar a área cirúrgica e desinfetar a pele com solução de clorexidina de 2% e 70% de álcool iopropyl.
  5. Injetar lidocaína (5 mg/kg) o couro cabeludo sobre a área do cérebro, onde os eletrodos serão implantados.
  6. Faça uma incisão do couro cabeludo sobre a área de implante futuro, e use um bisturi e cotonete para limpar o periosteum do crânio exposto25.
  7. Faça 4-8 furos no crânio para implantação de parafusos de âncora (~0,5 mm) como suporte estrutural para o implante25. Anexar os parafusos para o crânio, inserindo-os nos buracos e garantir que eles são mantidos firmemente no lugar.
  8. Perfurar a craniotomia nas coordenadas especificadas e inserir o implante de microdrive/sonda.
    NOTA: O protocolo descrito para estimulação de circuito fechado funcionará para qualquer região cerebral em que os eletrodos sejam inseridos.
  9. Corrija o microdrive/sonda e qualquer conector de interface elétrica necessário para o crânio usando acrílico dental. A quantidade de acrílico dental deve ser suficiente para anexar firmemente o implante, mas não deve entrar em contato com o tecido mole circundante25.
  10. Após a cirurgia, acompanhar de perto o animal até que tenha recuperado consciência suficiente para manter a recumbency sternal25. Para os 3 dias subsequentes, administrar subcutâneamente um analgésico (por exemplo, Metacam, 1 mg/kg) e um antibiótico para prevenir a infecção (por exemplo, enrofloxacina, 10 mg/kg).
    NOTA: Os animais são normalmente deixados para se recuperar da cirurgia por uma semana antes de qualquer teste ou gravação.

2. Instalação de software

NOTA: Isso foi testado na versão do Windows 10, 64 bits.

  1. Instale software de aquisição e processamento de dados.
    1. Instale o sistema de aquisição de dados Cheetah 6.4 (https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control), que inclui bibliotecas para interagir com o Cheetah Acquisition System.
    2. Instale spikesort3d (https://neuralynx.com/software/spikesort-3d) ou qualquer outro software que usa KlustaKwik27 para classificação de pico. O software de detecção on-line usa as definições de cluster do motor KlustaKwik. Este software pode ser executado no mesmo computador, ou pode ser executado em computadores separados que estão na mesma rede.
    3. Instale o NetComDevelopmentPackage (https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0), que também pode ser baixado de https://neuralynx.com/software/netcom-development-package.
  2. Instale o Matlab (https://www.mathworks.com/downloads/; o código foi testado na versão Matlab R2018a). Certifique-se de que o Matlab está ativado no firewall do Windows. Normalmente, um pop-up virá para cima durante a primeira conexão.
    1. Faça login em uma conta matlab. Escolha a licença. Escolha a versão. Escolha o sistema operacional.
  3. Baixe a biblioteca a seguir para o evento on-line que aciona: https://github.com/leomol/cheetah-interface e extraia arquivos para a pasta 'Documentos/Matlab' do computador. Uma cópia do código é fornecida nos materiais suplementaresque acompanham.

3. Aquisição inicial de dados

  1. Iniciar a aquisição de dados usando o software Cheetah.
  2. Registre alguns minutos de dados de picos para preencher formas de onda de modelos.
  3. Pare a aquisição de dados e execute a classificação de pico nos dados gravados.
    1. Abra SpikeSort3D, clique em Arquivo | Menu | Carregueo Arquivo Spike e selecione um arquivo de pico da pasta com dados gravados.
    2. Clique no Menu Cluster e, em seguida, autocluster usando KlustaKwik,deixando as configurações padrão e clique em Run.

4. Experiência de circuito fechado

  1. Retomar a aquisição de dados em Chita.
  2. Abra matlab.
    1. Abra closedloop.m e clique em run. Alternativamente, na janela de comando matlab, executar ClosedLoop (). Certifique-se de que closedloop.m está no caminho Matlab. Se o usuário quiser empregar uma função personalizada para ligar para cada gatilho, execute o ClosedLoop ('-callback', customFunction) em vez disso, onde o customFunction é uma alça para essa função.
    2. Carregue as informações de pico definidas na gravação inicial clicando no Load,navegando na pasta de gravação e selecionando um dos arquivos de dados de cravo (.ntt, .nse).
    3. Selecione um ou vários neurônios que irão desencadear a estimulação clicando na caixa de verificação as formas de onda traçadas.
    4. Defina o número mínimo de neurônios que irá desencadear a estimulação digitando um inteiro na caixa de texto"min matches"; e defina a janela de tempo em que os picos que correspondem a diferentes formas de onda são considerados co-ativos digitando um número na caixa de texto "janela".
    5. Clique em enviar para começar. Isso começará a desencadear on-line de eventos (tons como padrão) com base na atividade spiking de neurônios selecionados.

Resultados

Os ratos fisher-Brown Noruega nascidos e criados no local foram habituados ao manuseio por duas semanas antes do experimento. Uma movimentação de gravação foi implantada cirurgicamente, semelhante aos métodos descritos anteriormente28,29,30,31,32,33,34. Os sinais neuronais foram registr...

Discussão

O protocolo descrito aqui, mostra como usar um sistema de gravação neurofisiológica padrão para realizar estimulação de ciclo fechado. Este protocolo permite que neurocientistas com experiência limitada em ciência da computação implementem rapidamente uma variedade de experimentos de circuito fechado com pouco custo. Tais experimentos são muitas vezes necessários para estudar interações causais no cérebro.

Depois de preparar um animal e instalar o software (Passos 1 e 2), o expe...

Divulgações

Os autores não têm nenhum conflito de interesses relacionado a este trabalho.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subvenções NSERC Discovery para AL e AG.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
BaytrilBayer, Mississauga, CADIN 02169428antibiotic; 50 mg/mL
Cheetah 6.4NeuraLynx, Tucson, AZ6.4.0.betaSoftware interfaces for data acquisition 
Digital Lynx 4SXNeuraLynx, Tucson, AZ4SXrecording equipment
Headstage transmitterTBSIB10-3163-GKtransmits the neural signal to the receiver
IsofluraneFresenius Kabi, Toronto, CADIN 02237518inhalation anesthetic
Jet Denture Powder & LiqudLang Dental, Wheeling, US1230dental acrylic
Lacri-LubeAllergan, Markham, CADIN 00210889eye ointment
Lido-2Rafter 8, CalgaryDIN 00654639local anesthetic; 20 mg/mL
MatlabMathworksR2018bsoftware for signal processing and triggering external events
MetacamBoehringer, Ingelheim, DEDIN 02240463analgesic; 5 mg/mL
NetcomNeuraLynxv1Application Programming Interface (API) that communicates with Cheetah
Silicone probeCambridge NeurotechASSY-156-DBC2implanted device
SpikeSort 3D NeuraLynx, Tucson, AZSS3Dspike waveform-to-cell classification tools
Wireless Radio ReceiverTBSI911-1062-00transmits the neural signal to the Digital Lynx

Referências

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