Divulgar la colección hemolymph y la inoculación de Metarhizium blastosporos en las garrapatas de rhipicephalus microplus hacia los estudios de patología de invertebrados

Resumen

El análisis de la hemolinfa de garrapata representa una importante fuente de información sobre cómo algunos patógenos causan enfermedades y cómo las garrapatas responden inmunológicamente a esta infección. El presente estudio demuestra cómo inocular propágulos fúngicos y recolectar hemolinfa de las hembras engorgadas de rhipicephalus microplus .

Resumen

Las garrapatas son ectoparásitos hematóviles obligados y rhipicephalus microplus tiene una gran importancia en la medicina veterinaria porque causa anemia, pérdida de peso, depreciación del cuero de los animales y también puede actuar como un vector de varios patógenos. Debido a los costos exorbitantes para controlar estos parásitos, daños al medio ambiente causados por el uso inadecuado de acaricidas químicos, y el aumento de la resistencia contra los parasiticidas tradicionales, control alternativo de las garrapatas, mediante el uso de hongos entomopatógenos, por ejemplo, se ha considerado un enfoque interesante. Sin embargo, pocos estudios han demostrado cómo el sistema inmunológico de la garrapata actúa para luchar contra estos entomopatógenos. Por lo tanto, este protocolo demuestra dos métodos utilizados para la inoculación de entomopatógenos en hembras engorgadas y dos técnicas utilizadas para la recolección de hemológeno y la cosecha de hemocitos. La inoculación de patógenos en la inserción de la pierna en el cuerpo de la hembra de la garrapata permite la evaluación de los parámetros biológicos de las hembras a diferencia de la inoculación entre el Scutum Logistic y el capitulum, que con frecuencia daña el órgano de Genéu. La colección de hemolinfa dorsal produjo una recuperación de mayor volumen que la recogida a través de las piernas. Algunas limitaciones de la recolección y procesamiento de hemolinfa de garrapata incluyen i) altas tasas de alteración de los hemocitos, II) contaminación de la hemolafila con alteraciones en el intestino medio, y III) baja recuperación del volumen de hemolh. Cuando la hemolinfa se recoge a través del corte de la pierna, la hemoléh tarda en acumularse en la abertura de la pierna, favoreciendo el proceso de coagulación. Además, se obtienen menos hemocitos en la colección a través de la pierna en comparación con la colección dorsal, a pesar de que el primer método se considera más fácil de realizar. La comprensión de la respuesta inmune en las garrapatas mediadas por agentes entomopatógenos ayuda a revelar su patogénesis y desarrollar nuevos objetivos para el control de la garrapata. Los procesos de inoculación aquí descritos requieren muy bajos recursos tecnológicos y se pueden utilizar no sólo para exponer las garrapatas a microorganismos patógenos. Del mismo modo, la colección de la hemolafila de garrapata puede representar el primer paso para muchos estudios fisiológicos.

Introducción

La garrapata del ganado, rhipicephalus microplus, es un ectoparásito hematófago con un enorme impacto negativo en el ganado en las zonas tropicales. Esta garrapata es el vector de agentes patógenos como Babesia bovis, Babesia bigemina, y ANAPLASMA MARGINALE que, combinados con el daño de hemofeeding directo, pueden reducir la producción de leche y carne, causar anemia y finalmente la muerte. Las pérdidas causadas por este ectoparásito se calcularon en 3,24 mil millones dólares anualmente en Brasil¹. Se exigen métodos sostenibles y el uso de agentes entomopatógenos se considera una alternativa prometedora para reducir el uso de acaricidas químicos^2,3,4.

Los hongos entomopatógenos, como Metarhizium spp., son enemigos naturales de los artrópodos, incluidas las garrapatas, y algunos aislados pueden utilizarse como biocontroladores. Estos patógenos infectan activamente al huésped a través de la cutícula y colonizan su cuerpo^2,5,6. A medida que la infección se desarrolla, las respuestas celulares y humorales son mediadas por el sistema inmunológico de la garrapata. El análisis de la garrapata hemolinfa se divulga como una herramienta útil para evaluar las respuestas inmunitarias después del reto con patógenos^7,8.

La respuesta inmunitaria de los artrópodos se divide en respuestas humorales y celulares. La respuesta humoral consiste en procesos de hemaglutinación y producción de proteínas/péptidos antimicrobianos, mientras que la respuesta inmunitaria celular se realiza a través de los hemocitos. Estas células están presentes en la hemolinfa de todos los artrópodos y se reportan para desarrollar un papel expresivo en los estudios que implican la respuesta inmune innata⁹, ya que está directamente relacionado con los procesos de phagocitosis y encapsulación. En consecuencia, los estudios sobre los hemocitos pueden ayudar a investigar la vía de la muerte y comprender procesos como la autofagia, la apoptosis y la necrosis. En algunos invertebrados como bivalvos, la colección de los hemocitos se enfrenta a limitaciones como la alteración celular, el volumen bajo de hemolécula obtenida y la baja concentración de células recuperadas¹⁰. Con mucha frecuencia, dependiendo de la metodología aplicada, se obtiene una concentración reducida de células, afectando directamente a la cuantificación y análisis de las células.

El número de hemocitos circulantes en la hemolafila es variable entre los diferentes artrópodos y puede cambiar en la misma especie debido a diferentes etapas fisiológicas como el sexo, la edad, y la etapa de desarrollo del artrópodo¹¹. Los hemocitos también se pueden encontrar adherida a algunos órganos y se liberan en la circulación justo después del proceso de infección¹¹. Sin embargo, la mayoría de los estudios informaron utilizar insectos, mientras que las garrapatas siguen siendo menos exploradas con respecto a su fisiología y patología. A pesar de la inoculación de patógenos y la recolección de hemolinfa en garrapatas son técnicas menos utilizadas, el establecimiento de métodos estándar ayuda al desarrollo de estudios más precisos.

El objetivo del presente estudio fue comparar los métodos más utilizados para la recolección de hemolinfa y la inoculación de patógenos en garrapatas R. microplus , evaluando la eficacia de la adquisición de hemolágenos y la concentración de hemocitos.

Protocolo

Las garrapatas utilizadas en el presente estudio se obtuvieron de una colonia artificial, mantenida en la Universidad Federal rural de Río de Janeiro, que los métodos han sido aprobados por el Comité de ética para el uso de animales vertebrados (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).

1. Marque las hembras engorgadas

1. Después de la recolección de garrapatas, lavar las hembras engorgadas con agua del grifo y sumergir en 0,5% (v/v) solución de hipoclorito sódico durante 3 min en un recipiente de vaso de vidrio 500 mL, para la higiene de cutícula (figura 1), luego secar todas las hembras usando toallas de papel estériles (figura 2).
2. Divida las hembras en grupos ponderados homogéneos (con 20 hembras cada uno): un grupo sin tratamiento, un grupo de control inoculado con 5 μL de 0,1% de solución acuosa de monooleato de polioxietileno sorbitán (v/v), y un grupo infectado inoculado con 5 μL a 1,0 x 10 ⁷ blastosporos ml^-1.
   Nota: solo se utilizaron garrapatas no tratadas para la concentración de volumen y hemocitos. Se realizaron tres réplicas de cada grupo.

2. la inoculación de patógenos entre el Scutum Logistic y el capitulum

Nota: en el presente estudio se utilizaron como ejemplo suspensiones fúngicas entomopatógenas.

1. Suspender las blastosporas fúngicas en 1 mL de una solución acuosa de monooleato de sorbitán de polioxietileno al 0,1% (v/v) y ajustarse a una concentración final de 1,0 x 10⁷ Blastosporos ml^-1. Añadir una alícuota de 5 μL de la suspensión de Metarhizium blastosporos (figura 3) a la superficie de una película plástica de parafina.
   Nota: la suspensión de Metarhizium blastosporos se ajustó utilizando la cámara de Neubauer. Para acelerar el proceso de inoculación, se pueden añadir múltiples burbujas a la superficie de película de parafina plástica, cada burbuja correspondiente a 5 μL.
2. Utilice una jeringa de insulina ultra fina de 1 mL y una aguja de 0,3 mm para tirar de la suspensión e inocularla en la garrapata. Recuerde sacar todo el aire de la jeringa antes de usarlo.
3. Inocular 5 μL de suspensión fúngica en la garrapata hembra entre el Scutum Logistic y el capitulum. Inocular a las hembras del grupo de control con 5 μL de solución acuosa de monooleato de sorbitán de polioxietileno al 0,1% (v/v) sin hongos.
   Nota: un pequeño volumen de hemolinfa puede estar presente en el agujero después de la inserción de la aguja. Tenga cuidado de no vacunar el aire.

3. inoculación de hongos entomopatógenos entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la hembra de la garrapata

1. Inocular las hembras con suspensión fúngica (5 μL a 1,0 x 10⁷ blastosporos ml^-1) entre el Tigh de la pierna y el cuerpo de la hembra, utilizando una jeringa de insulina ultra fina de 1 ml acoplada a una aguja de 0,3 mm. Vacunar a las hembras del grupo de control con 5 μL de solución acuosa de monooleato de sorbitán de polioxietileno al 0,1% (v/v).
   Nota: cuando se realiza la inoculación de Metarhizium blastosporos entre el Tigh de la pierna y el cuerpo de la hembra de la garrapata, puede presentarse un pequeño volumen de hemolinfa en el Tigh después de la inserción de la aguja. Tenga cuidado de no vacunar el aire.

4. colección de hemolinfa dorsal

1. Utilice la parte de goma de un conjunto de infusión alada, un tubo capilar de 0,3 mm y una punta filtrada para realizar la colección de hemolingh.
2. Interrumpir la cutícula dorsal femenina con una aguja de 0,3 mm.
3. Después de la interrupción, aplique una presión suave en la parte anterior del cuerpo de la garrapata. Observe un líquido casi transparente tirando del sitio de interrupción. Recoja la hemolinfa chupando el líquido a través de la punta del filtro acoplado a la parte de goma de un conjunto de infusión alada, y un tubo capilar de 0,3 mm.
   Nota: no presione el cuerpo de la garrapata difícilmente durante su inmovilización porque esto puede interrumpir el intestino medio y contaminar la hemolymph. Espere hasta que la presión suave pueda expulsar el fluido sin contaminar.

5. colección hemolymph de la pata de la garrapata

1. Inmovilizar la garrapata, cortar un trozo de una pata delantera con un par de tijeras.
   Nota: una o más patas se pueden cortar, así como, la misma pierna se puede cortar más de una vez.
2. Aplique una presión suave en la parte posterior del cuerpo de la garrapata. Observar una burbuja líquida transparente que aparece en el sitio de corte y recogerla con el tubo capilar, como se describe en el paso 4,3.
   Nota: no presione el cuerpo de la garrapata difícilmente durante su inmovilización porque esto puede interrumpir el intestino medio y contaminar la hemolymph. Espere hasta que la presión suave pueda expulsar el fluido sin contaminar.

6. procesamiento de hemolymph

1. Tras la recolección de hemolinfa, deposite en microtubos de 1,5 ml previamente rellenos con 30 μl de Cóctel proteasa y 82 μl de tampón salino. Mantenga los microtubos en hielo a lo largo de la colección de hemolinfa.
2. Centrifugadora de muestras (500 x g durante 3 min a 4 ° c). Se formará un pellet blando de hemocitos después de la centrifugación de hemolafila.
   Nota: para la cuantificación de la hemolésica, cuantificar el volumen hemolúh obtenido contando el volumen total dentro del microtubo y descontando el volumen de Cóctel de proteasa y tampón salino.
3. Retire con cuidado el sobrenadante (hemolymph libre de células). Resuspende suavemente las células en, por ejemplo, la cultura L-15 de Leibovitz ajustada a pH 7,0-7.2. Cuantificar los hemocitos colocando 10 μL de hemocitos resuspendido en una cámara Neubauer.

7. preparación de la diapositiva de muestreo de hemocitos

1. Corta la pata delantera de la garrapata con un par de tijeras.
2. Aplique una presión suave en la parte posterior del cuerpo de la garrapata. Observe una burbuja líquida transparente que aparece en el sitio de corte.
3. Aplicar las gotas de hemolinfa directamente en las diapositivas de microscopio limpias, después de eso, utilizar métodos apropiados para manchar las células.
   1. Para manchar los hemocitos con Giemsa, secar al aire la hemolésica en la corredera durante 30 min, fijarla a temperatura ambiente con metanol durante 3 min, y mancha en la solución de Giemsa (relación 1:9 de la solución tampón de Sorensen, pH 7,2) durante 30 min a temperatura ambiente. Lave las diapositivas con agua corriente para eliminar el exceso de tinte, secar al aire la diapositiva y evaluar las células a 400x en un microscopio óptico.

Resultados

En este artículo se aborda la inoculación y los métodos de recolección de hemolinfa aplicados a las garrapatas. Después de la inoculación entre el muslo de la pierna y el cuerpo de la hembra de la garrapata, un poco de líquido (hemolymph) puede ser secretada durante el proceso; sin embargo, es importante notar que cuando la inoculación está terminada, no hay líquido o tejidos presentes en la punta de la aguja o en el sitio de inoculación, asegurando que la suspensión fúngica ...

Discusión

La inoculación de patógenos es útil cuando el estudio tiene como objetivo investigar la acción in vivo de microorganismos en modelos de artrópodos experimentales porque asegura que el patógeno está dentro del huésped. La técnica también se puede aplicar para inocular moléculas como la interferencia de ARN (ARNi). La inoculación entre el Scutum Logistic y el capitulum se considera más fácil de llevar a cabo, pero con frecuencia daña el órgano de Genée deteriorar la viabilidad de los óvulos

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkaline Hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	A1727
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
EDTA	Synth	2706
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000036
Flexible rubber	BD
Giemsa stain	Sigma-Aldrich	48900-500ML-F
Glass capillary	CTechGlass	CT95-02
Insulin syringe (needle)	BD	SKU: 324910
KH2PO4	Vetec	60REAVET014512
Leibovitz's L-15 culture medium	Gibco	11415-064
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
Microscope slides	Kasvi	K5-7105
Microtubes	BRAND	Z336769-1PAK
Na2HPO4	Vetec	60REAVET014593
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0111
Penicillin	Gibco	15140163
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Tween 80	Vetec	60REAVET003662