Раскрытие гемолимфы сбор и прививка Metarhizium блапопоры в Рипикцефалия Microplus клещей по направлению к патологии беспозвоночных исследований

Резюме

Анализ тик гемолимфа представляет собой важный источник информации о том, как некоторые возбудители вызывают болезни и как клещей иммунологически реагировать на эту инфекцию. Настоящее исследование демонстрирует, как прививать грибковые пропагаты и собирать гемолимфы из Рипицефалии МикроПлюс самок.

Аннотация

Клещи являются облигатными гематофазных эктопаразитов и Рипикцефалия microplus имеет большое значение в ветеринарной медицине, потому что это вызывает анемию, потеря веса, обесценение кожи животных, а также может выступать в качестве вектора нескольких патогенов. Из-за непомерных затрат на управление этими паразитами, повреждение окружающей среды, вызванное ненадлежащим использованием химических акарицидов, и усиление резистентности к традиционным паразитам, альтернативный контроль клещей, путем использования Энтомопатогенные грибы, например, считается интересным подходом. Тем не менее, несколько исследований показали, как иммунная система клеща действует для борьбы с этими энтомопатогенами. Таким образом, этот протокол демонстрирует два метода, используемых для энтомопатогена инокуляции в наполненный женщин и двух методов, используемых для гемолимфы сбора и гемоцитов сбора. Прививка патогенных микроорганизмов при вставке ноги в клещевого женского тела позволяет оценить биологические параметры самок в отличие от прививки между потертой и капителями, которые часто повреждает орган Генэ. Спинной гемолимфы коллекции дали более высокий объем восстановления, чем сбор через ноги. Некоторые ограничения на галочку гемолимфы сбора и обработки включают i) высокий уровень нарушения гепатоцитов, II) гемолимфы загрязнения с нарушениями мидгут, и III) низкий уровень гемолимфы восстановления. Когда гемолимфа собирается через ногу резки, гемолимфы требуется время, чтобы накопить на ногу открытия, в пользу свертывания процесса. Кроме того, меньшее количество гемоцитов получают в сборе через ногу по сравнению с спинной коллекции, хотя первый метод считается легче выполнять. Понимание иммунного ответа в клещах, опосредованных энтомопатогенными агентами, помогает раскрыть их патогенез и развить новые цели для контроля клещей. Описанные здесь процессы вакцинации требуют очень низких технологических ресурсов и могут быть использованы не только для выявления клещей до патогенных микроорганизмов. Аналогичным образом, сбор клещей гемолимфы может представлять собой первый шаг для многих физиологических исследований.

Введение

Скотин тик, рипицефалия microplus, является гематофазного эктопаразит с огромным негативным воздействием на скот в тропических районах. Этот Тик является вектором патогенных агентов, таких как баезия Bovis, баезия бигемина, и Анаплазма маргинал , что, в сочетании с прямым повреждением гемокормления, может уменьшить производство молока и мяса, вызвать анемию и в конечном итоге смерть. Убытки, вызванные этой эктопаразит были оценены в 3 240 000 000 долларов в год в Бразилии¹. Требуются устойчивые методы, а использование энтомопатогенных агентов считается перспективной альтернативой для сокращения использования в качестве аакацидов,^2,3,4.

Энтомопатогенные грибы, такие как Metarhizium СПМ, являются естественными врагами членистоногих в том числе клещей, и некоторые изоляты могут быть использованы в качестве биоконтроллеров. Эти патогены активно заражают хост через кутикулы и колонизировать их тела^2,5,6. Как инфекция развивается, клеточных и гуморального ответы опосредовано тик иммунной системы. Анализ тик гемолимф сообщается в качестве полезного инструмента для оценки иммунных реакций после сложной с патогенами^7,8.

Иммунный ответ членистоногих делится на гуморальный и клеточных реакций. Гуморальный ответ включает процессы гемагглютинации и выработку противомикробных белков/пептидов, в то время как клеточный иммунный ответ выполняется через гемоциты. Эти клетки присутствуют в гемолимфы от всех членистоногих и, как сообщается, развивать выразительную роль в исследованиях с участием врожденного иммунного ответа⁹, как это непосредственно связано с фагоцитоз и инкапсуляции процессов. Соответственно, исследования гемоцитов могут помочь исследовать путь смерти и понять процессы, такие как аутофагия, апоптоз и некроза. В некоторых беспозвоночных, как двустворчатые, геоцитов ' коллекция сталкивается с ограничениями, как разрушение клеток, низкий уровень гемолимфы получены, и низкая концентрация восстановленные клетки¹⁰. Очень часто, в зависимости от применяемых методик, получается уменьшенная концентрация клеток, воздействуя непосредственно на квантификация и анализ клеток.

Количество гематоцитов, циркулирующих в гемолимфы является переменной среди различных членистоногих и это может измениться в том же виде из-за различных физиологических этапов, таких как пол, возраст, и членистоногих стадии развития¹¹. Гемоциты также могут быть найдены привязаны к некоторым органам и быть освобождены в обращение сразу после процесса заражения¹¹. Тем не менее, большинство исследований сообщили использования насекомых, в то время как клещи остаются менее изучены в отношении их физиологии и патологии. Несмотря на прививку патогена и гемолимфы сбора в клещах менее используемые методы, установление стандартных методов помогает развитию более точных исследований.

Цель настоящего исследования заключалась в том, чтобы сравнить наиболее используемые методы для получения гемолимфы и инокуляции патогенов в R. microplus клещей, оценивая эффективность в приобретении гемолимфы и концентрации гемоцитов.

протокол

Клещи, используемые в настоящем исследовании, были получены из искусственных колоний, манавешенных в федеральном сельском университете Рио-де-Жанейро, какие методы были одобрены Комитетом по этике для использования позвоночных животных (ЦЕУА-IV/UFRРЖ #037/2014).

1. Тик нагруженный женщин

1. После тик сбора, мыть наполненный женщин, использующих водопроводную воду и погрузить их в 0,5% (v/v) раствор гипохлорита натрия для 3 мин в 500 мл стеклянный стакан получателя, кутикулы гигиены (рис. 1), то сухие все женщины с использованием стерильных бумажных полотенец (Рисунок 2).
2. Разделите самок в однородных взвешенных группах (по 20 самок каждая): одна группа без какого-либо лечения, одна контрольная группа, прививка с 5 мкл 0,1% полйоксесилене сорбитской моноолеатной раствор (v/v), и одна инфицированная группа с 5 мкл при 1,0 x 10 ⁷ блапопоры мл^-1.
   Примечание: только необработанные клещи были использованы для объема и концентрации гемоцитов. Было выполнено три реплицирует каждой группы.

2. патогены прививка между потертом и капитулум

Примечание: в настоящем исследовании в качестве примера использовались Энтомопатогенные грибковые суспензии.

1. Приостановить грибковые блапопоры в 1 мл 0,1% полйоксесилене сорбитской моноолеат раствора (v/v) и приспособиться к окончательной концентрации 1,0 х 10⁷ Блапопоры мл^-1. Добавьте Алиготе 5 мкл Metarhizium блапопоры (рис.3) суспензию на поверхность пластикового парафиновых пленки.
   Примечание: суспензия Metarhizium блапопоры была скорректирована с помощью камеры Нойбауэр. Чтобы ускорить процесс прививки, можно добавить несколько пузырьков на поверхность пластикового парафина, каждый пузырь, соответствующий 5 мкл.
2. Используйте 1 мл ультра-тонкий инсулин шприц и 0,3 мм иглы тянуть подвески и прививать его в тик. Не забудьте взять весь воздух из шприца перед его использованием.
3. Прививать 5 мкл грибковых суспензии в галочку женщин между потертом и капитель. Инокуляции самок из контрольной группы с 5 мкл 0,1% полйоксесилене сорбиан моноолеат раствор (v/v) без грибка.
   Примечание: небольшой объем гемолимфы могут присутствовать на forаминь после вставки иглы. Будьте осторожны, чтобы не прививать воздух.

3. прививка энтомопатогенных грибов между ножкой бедра и клещевого женского тела

1. Инокуляции самок с грибковой суспензии (5 мкл на 1,0 х 10⁷ бластопоры мл^-1) между ног Tigh и женского тела, используя 1 мл ультра-тонкий инсулиновый шприц в сочетании с 0,3 мм иглы. Прививать самок из контрольной группы с 5 мкл 0,1% полйоксесилене сорбитан моноолеатного раствора (v/v).
   Примечание: когда проводится прививка от Metarhizium бластопоры между ног Tigh и клеща женского тела, небольшой объем гемолимфы могут присутствовать на Tigh после вставки иглы. Будьте осторожны, чтобы не прививать воздух.

4. спинной гемолимфой коллекции

1. Используйте резиновую часть крылатого набора настоя, трубку для капилляров диаметром 0,3 мм и отфильтрованный наконечник для выполнения коллекции гемолимфы.
2. Сорвать женский спинной кутикулы использованием 0,3 мм иглы.
3. После перерыва Нанесите мягкое давление на переднюю часть тела клеща. Наблюдайте за почти прозрачной жидкостью, вырытой из места разрушения. Соберите гемолимфы, высасывая жидкость через фильтр наконечник, связанный с резиновой части крылатый набор настоя, и 0,3 мм капилляра трубки.
   Примечание: не нажимайте на тело клеща вряд ли во время его иммобилизации, поскольку это может нарушить мидгут и загрязнять гемолимфы. Подождите, пока мягкое давление может изгнать жидкость без загрязнения.

5. гемолимфа сбора от клеща ногу

1. Обездвижить тик, вырезать часть передней ноги с ножницами.
   Примечание: один или несколько ног могут быть сокращены, а также, одну и ту же ногу можно вырезать более одного раза.
2. Нанесите мягкое давление на заднюю часть клещевого тела. Наблюдайте прозрачный жидкий пузырь, который появляется на месте разреза и собирает его с трубкой капилляра, как описано в шаге 4,3.
   Примечание: не нажимайте на тело клеща вряд ли во время его иммобилизации, поскольку это может нарушить мидгут и загрязнять гемолимфы. Подождите, пока мягкое давление может изгнать жидкость без загрязнения.

6. обработка гемолимфы

1. После сбора гемолимфы, внесите его в микротрубки 1,5 мл, предварительно заполненные 30 мкл протеазы коктейля и 82 мкл солевой буфер. Храните микротрубки на льду во всей коллекции гемолимфы.
2. Образцы центрифуг (500 x g для 3 мин при температуре 4 °c). После центрифугирования гемолимфы образуется мягкая грануляция гемоцитов.
   Примечание: для определения гемолимфы квантифицировать объем гемолимфы, полученный путем подсчета общего объема внутри микротрубки и дисконтирования объема коктейля протеазы и солевого буфера.
3. Аккуратно удалите супернатант (безклеточный гемолимф). Мягко ресуспензируем клетки, например, в культуру Лейбовиц L-15, скорректированной на рН 7-7,2. Количественное определение гемоцитов путем размещения 10 мкл ресуспендирован гемоцитов в камере Нойбауэр.

7. при подготовке к отбору проб гемоцитов

1. Отрежьте переднюю ногу клеща ножницами.
2. Нанесите мягкое давление на заднюю часть клещевого тела. Соблюдайте прозрачный жидкий пузырь, который появляется на месте разреза.
3. Нанесите капли гемолимфы непосредственно на чистые слайды микроскопа, после этого используйте присвоены методы, чтобы испачкать клетки.
   1. Для окрашивания гемоцитов с использованием Giemsa, воздушно-сухой гемолимфы на слайде в течение 30 мин, зафиксировать его при комнатной температуре с метанолом в течение 3 мин, и пятно в Giemsa раствора (1:9 соотношение буферного раствора Соренсена, рН 7,2) в течение 30 минут при комнатной температуре. Вымойте слайды с проточной водой, чтобы удалить избыток красителя, воздушно-сухой слайд и оценить клетки на 400x в оптический микроскоп.

Результаты

Эта статья подходы прививки и гемолимфы методы сбора применительно к клещей. После прививки между ног бедра и клеща женского тела, некоторые жидкости (гемолимфы) могут быть секретируются во время процесса; Однако, важно заметить что когда прививка закончена, никакая ж?...

Обсуждение

Инокуляции патогенов полезно, когда исследование направлено на изучение в естественных условиях действия микроорганизмов в экспериментальных членистоногих моделей, поскольку он уверяет, что патоген находится внутри хозяина. Этот метод также может быть применен к прививать молекулы,...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkaline Hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	A1727
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
EDTA	Synth	2706
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000036
Flexible rubber	BD
Giemsa stain	Sigma-Aldrich	48900-500ML-F
Glass capillary	CTechGlass	CT95-02
Insulin syringe (needle)	BD	SKU: 324910
KH2PO4	Vetec	60REAVET014512
Leibovitz's L-15 culture medium	Gibco	11415-064
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
Microscope slides	Kasvi	K5-7105
Microtubes	BRAND	Z336769-1PAK
Na2HPO4	Vetec	60REAVET014593
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0111
Penicillin	Gibco	15140163
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Tween 80	Vetec	60REAVET003662