Die Sammlung der Häkolymphe und die Inokulation von Metarhizium-Blastospores in Rhipicephalus Microplus Ticks Towards Pathology Studies

Zusammenfassung

Die Analyse der Zeckenhemolymphe stellt eine wichtige Quelle für Informationen darüber dar, wie einige Krankheitserreger verursachen und wie Zecken immunologisch auf diese Infektion reagieren. Die vorliegende Studie zeigt, wie man Pilzpropagiolen impfen und die Hämatymphe von Rhipicephalus microplus verzierten Weibchen sammeln kann.

Zusammenfassung

Zecken sind obligatorische hämatopophagöse Ektoparasiten und Rhipicephalus microplus hat eine große Bedeutung in der Veterinärmedizin, weil es Anämie, Gewichtsverlust, Abwertung des Gelders der Tiere verursacht und auch als Vektor von mehreren Krankheitserregern wirken kann. Aufgrund der exorbitanten Kosten für die Kontrolle dieser Parasiten, der Umweltschäden, die durch den unangemessenen Einsatz chemischer Akarzide verursacht werden, und der erhöhten Resistenz gegen traditionelle Parasitizide, der alternativen Kontrolle von Zecken, durch den Einsatz von Entomopathogene Pilze etwa wurden als interessanter Ansatz angesehen. Dennoch haben nur wenige Studien gezeigt, wie das Immunsystem der Zecke gegen diese Entomopathogene wirkt. Daher zeigt dieses Protokoll zwei Methoden, die zur Entomopathogen-Impfung in engormierte Frauen verwendet werden, und zwei Techniken, die für die Hämatolymphentnahme und die Ernte von Hämozyten verwendet werden. Die Inokulation von Krankheitserregern an der Beineinfügung in den Körper der Zecke ermöglicht die Bewertung von weiblichen biologischen Parametern im Gegensatz zur Impfung zwischen dem Sutum und dem Kapitulum, die häufig das Organ von Gené schädigt. Die Dorsal-Hämatymphe gab eine höhere Erholung als die Sammlung durch die Beine. Einige Einschränkungen der Zeckenhemolymphentnahme und-verarbeitung sind i) hohe Raten der Hämozyten-Störung, ii) Hämatolymphkontamination mit gestörtem Midgut, und iii) niedrige Hämatolymphen-Volumen-Erholung. Wenn die Hämatymphe durch den Beinschnitt gesammelt wird, braucht die Hämatymphe Zeit, um sich an der Beinöffnung zu sammeln, was den Gerinnungsprozess begünstigt. Darüber hinaus werden im Vergleich zur Rückensammlung weniger Hämozyten in der Sammlung durch das Bein gewonnen, obwohl die erste Methode als leichter durchzuführen gilt. Das Verständnis der Immunantwort in Zecken durch entomopathogene Wirkstoffe vermittelt hilft, ihre Pathogenese zu enthüllen und neue Ziele für die Zeckenkontrolle zu entwickeln. Die hier beschriebenen Impfprozesse erfordern sehr geringe technologische Ressourcen und können nicht nur zur Exposition von Zecken für pathogene Mikroorganismen eingesetzt werden. In ähnlicher Weise kann die Sammlung von Zeckenhemolymphe den ersten Schritt für viele physiologische Studien darstellen.

Einleitung

Die Rinderzecke, Rhipicephalus microplus,ist ein Hämatophait-Ektoparasit mit enormen negativen Auswirkungen auf die Tiere in tropischen Gebieten. Diese Zecke ist der Vektor von Krankheitserregern wie Babesiabovis, Babesia bigeminaund Anaplasma marginale , die in Kombination mit den direkten Hämorschäden, die Milch-und Fleischproduktion, Anämie und schließlich den Tod reduzieren können. Die Verluste, die durch diesen Ektoparasiten verursacht^wurden, wurden in Brasilien jährlich auf 3,24 Milliarden Dollar geschätzt. Nachhaltige Methoden werden gefordert und der Einsatz von entomopathogenen Wirkstoffen gilt als vielversprechende Alternative, um den Einsatz von chemischen Akarziden 2^,3,4zu reduzieren.

Entomopathogene Pilze, wie Metarhizium spp., sind natürliche Feinde von Arthropoden einschließlich Zecken, und einige Isolate können als Biocontroller verwendet werden. Diese Erreger infizieren den Wirt aktiv durch die Kutikel und kolonisieren ihren Körper^2,5,6. Im Zuge der Entwicklung der Infektion werden zelluläre und humorale Reaktionen durch das Zeckenimmunsystem vermittelt. Die Analyse der Zecke Hämata wird als ein nützliches Werkzeug zur Bewertung der Immunreaktionen nach der Herausforderung mit Krankheitserregern7,8^berichtet.

Arthropods Immunantwort ist in humorale und zelluläre Reaktionen unterteilt. Die humorale Reaktion beinhaltet Hämoroperationen und die Produktion von antimikrobiellen Proteins-/Peptiden, während die zelluläre Immunantwort durch die Hämozyten erfolgt. Diese Zellen sind in der Hämatymphe von allen Arthropoden vorhanden und werden berichtet, um eine ausdrucksstarke Rolle in Studien mit angeborenen Immunantwort^{9 zu}entwickeln, da es direkt mit der Phagozytose und Verkapselung. Demnach können Studien über Hämozyten helfen, den Todesweg zu untersuchen und Prozesse wie Autophagie, Apoptose und Nekrose zu verstehen. Bei einigen Wirbellosen als Zweiventile sieht sich die Sammlung der Hämozyten mit Einschränkungen konfrontiert, wie Zellstörungen, niedrigem Hemolymphvolumen und geringer Konzentration der wiedergewonnenen Zellen10. Sehr häufig, je nach angewandter Methodik, wird eine reduzierte Konzentration der Zellen erreicht, die sich direkt auf die Quantifizierung und Analyse der Zellen auswirkt.

Die Anzahl der Hämozyten, die in der Hämatymphe zirkulieren, ist unter den verschiedenen Arthropoden variabel und kann sich in der gleichen Art aufgrund verschiedener physiologischer Stadien wie Geschlecht, Alter und Entwicklungsstufe 11 des Arthropods verändern. Hanzyten können auch an einigen Organen haften und kurz nach dem Infektionsprozess 11 in den Kreislauf^entlassenwerden. Dennoch werden die meisten Studien mit Insekten beschäftigt, während Zecken in Bezug auf ihre Physiologie und Pathologie weniger erforscht sind. Trotz der Paarungs-Impfung und Hämatolymphentnahme in Zecken sind weniger verwendet Techniken, die Etablierung von Standardmethoden hilft bei der Entwicklung von genaueren Studien.

Ziel der vorliegenden Studie war es, die am häufigsten verwendeten Methoden zur Hämatolymphentnahme und Impfung von Krankheitserregern in R. Microplus-Zecken zu vergleichen und dabei die Wirksamkeit bei der Hämatolymphenerfassung und der Hämozytenkonzentration zu bewerten.

Protokoll

Zecken, die in der vorliegenden Studie verwendet wurden, stammen aus einer künstlichen Kolonie, die an der Federal Rural University of Rio de Janeiro betrieben wird und deren Methoden vom Ethikausschuss für die Verwendung von Vertebraten-Tieren genehmigt wurden (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).

1. Zick engmaschte Weibchen

1. Nach der Zeckenauflösung, waschen Sie engreibige Weibchen mit Leitungswasser und tauchen Sie sie in 0,5% (v/v) Natriumhypochlorit-Lösung für 3 min in einem 500 ml Glasbecher-Empfänger, für die Kutikelhygiene (Abbildung 1), dann trocknen Sie alle Weibchen mit sterilen Papierhandtüchern (Abbildung Abbildung 2).
2. Teilen Sie die Weibchen in homogenen Gruppen auf (mit je 20 Weibchen): Eine Gruppe ohne jegliche Behandlung, eine Kontrollgruppe geimpft mit 5 μL von 0,1% Polyoxyethylen-Sorbitan Monooleat wässrige Lösung (v/v), und eine Infekt-Gruppe geimpft mit 5 μL bei 1,0 x 10 ⁷ Blastospores mL^-1.
   NOTE: Für die Lautstärke und Hämozytenkonzentration wurden nur unbehandelte Zecken verwendet. Drei Nachbildungen jeder Gruppe wurden durchgeführt.

2. Pathogene Impfung zwischen dem Skutum und dem Kapitulum

NOTE: In der vorliegenden Studie wurden entomopathogene Pilzaufhängungen als Beispiel herangezogen.

1. Suspend Pilzblöcke in 1 mL von 0,1% Polyoxyethylen-Sorbitan wässrige Lösung (v/v) und passen Sie sich auf eine Endkonzentration von 1,0 x 10⁷ Blastospores mL-¹. Fügen Sie einen Aliquot von 5 μL Metarhizium-Blastosporen (Abbildung 3) an die Oberfläche einer Kunststoffparaffinfolie.
   Hinweis: Die Aufhängung von Metarhizium blastospores wurde mit einer Neubauer ́s Kammereingestellt. Um den Impfprozess zu beschleunigen, können mehrere Blasen auf die Kunststoffparaffin-Folienfläche gesetzt werden, die jeweils 5 μL entsprechen.
2. Verwenden Sie eine ultrafeine Insulinspritze von 1 mL und eine 0,3 mm-Nadel, um die Aufhängung zu ziehen und in die Zecke zu impfen. Denken Sie daran, die ganze Luft aus der Spritze zu nehmen, bevor Sie sie verwenden.
3. Enoculate 5 μL der Pilzaufhängung in die Zeckenweibchen zwischen dem Sutum und dem Kapital. Inoculate Weibchen aus der Kontrollgruppe mit 5 μL von 0,1% Polyoxyethylen-Sorbitan monooleat wässrige Lösung (v/v) ohne Pilz.
   Hinweis: Nach dem Einsetzen der Nadel kann auf dem Foramen ein kleines Volumen an Hämatymphe vorhanden sein. Achten Sie darauf, die Luft nicht zu impfen.

3. Inokulation der entomopathogenen Pilze zwischen dem Beinthoch und dem Körper der Zecke

1. Inoculate Weibchen mit Pilzfederung (5 μL bei 1,0 x 10⁷ Blastospores mL^-1) zwischen dem Beinzehen und dem Körper des Weibchens, mit einer 1 mL ultrafeinen Insulinspritze, die mit einer 0,3 mm-Nadel gekoppelt ist. Inoculate Weibchen aus der Kontrollgruppe mit 5 μL von 0,1% Polyoxyethylen-Sorbitan monooleat wässrige Lösung (v/v).
   Hinweis: Wenn die Impfung zwischen dem Beinzehen und dem Körper des Zeckenweibchens durchgeführt wird, kann nach dem Einsetzen der Nadel ein kleines Volumen an Hämatolymphe auf dem Zehen vorhanden sein. Achten Sie darauf, die Luft nicht zu impfen.

4. Dorsal Hämatolymphensammlung

1. Verwenden Sie den Gummiteil eines geflügelten Infusionssets, ein 0,3 mm Kapillarrohr und eine gefilterte Spitze, um die Hämatolymphensammlung durchzuführen.
2. Die Rückenhaut mit einer 0,3 mm-Nadel stören.
3. Nach der Störung, steuern Sie sanften Druck auf den vorderen Teil des Zeckenkörpers. Beobachten Sie ein fast durchsichtiges Ziehen aus der Störungsstelle. Sammeln Sie die Hämatymphe, indem Sie die Flüssigkeit durch die Filterspitze saugen, die mit dem Gummiteil eines geflügelten Infusionssatzes gekoppelt ist, und einem 0,3 mm Kapillarrohr.
   Hinweis: Drücken Sie den Körper der Zecke während der Immobilisierung nicht kaum, da dies den Mittelgut stören und die Hämatymphe verunreinigen kann. Warten Sie, bis sanfter Druck die Flüssigkeit ohne Kontamination ausstoßen kann.

5. Häkolymphensammlung aus dem Zeckenbein

1. Die Zecke spülen, ein Stück von einem Vorderbein mit einer Schere schneiden.
   Hinweis: Ein oder mehrere Beine können geschnitten werden, ebenso wie das gleiche Bein kann mehr als einmal geschnitten werden.
2. Tragen Sie sanften Druck auf das hintere Körperteil der Zecke auf. Beobachten Sie eine durchsichtige Flüssigkeitsblase, die auf der geschnittenen Stelle auftaucht, und sammeln Sie sie mit dem Kapillarrohr, wie in Schritt 4.3 beschrieben.
   Hinweis: Drücken Sie den Körper der Zecke während der Immobilisierung nicht kaum, da dies den Mittelgut stören und die Hämatymphe verunreinigen kann. Warten Sie, bis sanfter Druck die Flüssigkeit ohne Kontamination ausstoßen kann.

6. Häkolymphverarbeitung

1. Nach der Hämatolymphentnahme in 1,5 mL-Mikroröhren, die zuvor mit 30 μL-Protease-Cocktail und 82 μL Salzpuffer gefüllt waren, ablegen. Halten Sie die Mikroröhren auf Eis während der gesamten Hämatolymphensammlung.
2. Zentrifugenproben (500 x g für 3 min bei 4 ° C). Nach der Hämatolymphzentrifugation wird sich ein weiches Pellet von Hämozyten bilden.
   Hinweis: Für die Hämatolymph-Quantifizierung, Quantifizieren Sie das Hämatolymphvolumen, das durch Zählen des Gesamtvolumens innerhalb des Mikrorohrs und Diskontierung des Volumens von Protease-Cocktail und Salzpuffer gewonnen wird.
3. Entfernen Sie vorsichtig den Supernatant (zellfreie Hämomulymphe). Sanft die Zellen in der auf pH 7,0-7,2 angepassten Low-15-Kultur von Leibovitz wiederbeleben. Quantifizieren Sie Hämozyten, indem Sie 10 μL wiederbelebter Hämozyten in einer Neubauer-Kammer platzieren.

7. Hämozyten-Probenahme Diavorbereitung

1. Schneiden Sie das Vorderbein der Zecke mit einer Schere.
2. Tragen Sie sanften Druck auf das hintere Körperteil der Zecke auf. Beobachten Sie eine transparente Flüssigkeitsblase, die auf der geschnittenen Stelle auftaucht.
3. Tragen Sie die Hämatolymphentropfen direkt auf saubere Mikroskop-Dias auf, danach verwenden Sie die entsprechenden Methoden, um die Zellen zu verfärben.
   1. Um die Hämozyten mit Giemsa zu färben, die Hämatymphe auf der Rutsche 30 min lufttrocken zu halten, sie bei Raumtemperatur mit Methanol für 3 min zu fixieren und in der Giemsa-Lösung (1:9 Verhältnis der Pufferlösung von Sorensen, pH 7,2) für 30 min bei Raumtemperatur zu verfärben. Waschen Sie die Dias mit fließendem Wasser, um den Überschuss an Farbstoff zu entfernen, die Rutsche lufttrocknen und die Zellen mit 400x in einem optischen Mikroskop zu bewerten.

Ergebnisse

Dieser Artikel nähert sich der Impfung und Hämatolymphentnahme Methoden, die auf Zecken angewendet. Nach der Impfung zwischen dem BeinthOberschenkel und dem Körper der Zecke kann während des Prozesses etwas Flüssigkeit (Hämatolymphe) ausgeschieden werden; Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass bei Beendigung der Impfung keine Flüssigkeit oder Gewebe in der Nadelspitze oder an der Impfung vorhanden waren, so dass die Pilzfederung vollständig geimpft wurde. Wenn der Impfprozess kor...

Diskussion

Die Nachahmung von Krankheitserregern ist nützlich, wenn die Studie darauf abzielt, die In-vivo-Wirkung von Mikroorganismen in experimentellen Arthropodenmodellen zu untersuchen, da sie sicherstellt, dass sich der Erreger im Inneren des Wirts befindet. Die Technik kann auch auf Impfungen wie RNA-Interferenzen (RNAi) angewendet werden. Die Inokulation zwischen dem Skutum und dem Kapitulum wird als leichter zu erbringen angesehen, schädigt aber häufig das Organ von Gené,^wasdie Lebensfähigkeit

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkaline Hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	A1727
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
EDTA	Synth	2706
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000036
Flexible rubber	BD
Giemsa stain	Sigma-Aldrich	48900-500ML-F
Glass capillary	CTechGlass	CT95-02
Insulin syringe (needle)	BD	SKU: 324910
KH2PO4	Vetec	60REAVET014512
Leibovitz's L-15 culture medium	Gibco	11415-064
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
Microscope slides	Kasvi	K5-7105
Microtubes	BRAND	Z336769-1PAK
Na2HPO4	Vetec	60REAVET014593
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0111
Penicillin	Gibco	15140163
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Tween 80	Vetec	60REAVET003662