在无脊椎动物病理学研究中发现血淋巴收集和接种转移到大黄微加分中

摘要

对滴虫血淋巴的分析是一个重要的信息来源, 说明一些病原体是如何引起疾病的, 以及滴答声对这种感染的免疫反应。本研究旨在说明如何接种真菌繁殖和从根茎微加高的雌性中采集血淋巴。

摘要

滴答声是强制的血食性外寄生虫和犀牛微加子在兽医学中具有重要意义, 因为它导致贫血, 体重减轻, 动物的皮革贬值, 也可以作为几种病原体的载体。由于控制这些寄生虫的费用过高, 不当使用化学杀菌剂对环境造成损害, 以及对传统寄生虫的抵抗力增加, 对滴答声的替代控制, 使用昆虫病原真菌, 例如, 已被认为是一个有趣的方法。然而, 很少有研究表明, 滴答声的免疫系统是如何对抗这些致癌物质的。因此, 该协议演示了两种用于昆虫病原体接种充血的女性和两种技术用于血淋巴收集和血细胞采集。在腿部插入的病原体接种在雌性的身体允许评估女性的生物参数, 不像在阴囊和头状花序之间的接种, 这经常损害 Gené的器官。多侧血淋巴收集产生了更高的体积恢复比收集通过腿。滴虫血淋巴收集和处理的一些局限性包括: (i) 血细胞破坏率高; (二) 血淋巴污染与中肠紊乱; (三) 低血淋巴体积恢复。当血淋巴通过腿部切割收集时, 血淋巴在腿部开口处积累需要时间, 有利于凝血过程。此外, 与背侧收集相比, 通过腿部收集的血细胞较少, 尽管第一种方法被认为更容易实施。了解昆虫病原剂介导的滴答声中的免疫反应有助于揭示其发病机制, 并为滴答声控制制定新的目标。这里描述的接种过程需要非常低的技术资源, 不仅可以用来暴露在病原微生物面前的滴答声。同样, 血淋巴的收集可能是许多生理研究的第一步。

引言

牛是一种对热带地区牲畜有巨大负面影响的对牲畜产生了巨大的负面影响。这种滴答药是病原体的载体, 如巴贝西亚牛、巴贝西亚大代米纳和阿纳苏拉西翁, 再加上直接的血液喂养损伤, 可以减少牛奶和肉类的生产, 导致贫血, 并最终导致死亡。据估计, 这种外生寄生虫每年造成的损失为32.4亿美元.需要可持续的方法, 昆虫病原剂的使用被认为是减少使用化学杀菌剂^2,3,4的一个有希望的替代品。

昆虫病原真菌, 如巨细胞病, 是节肢动物的天敌, 包括滴虫, 一些分离物可用作生物控制器。这些病原体通过角质层主动感染宿主, 并对它们的身体^进行2^,5,⁶的殖民。随着感染的发展, 细胞和体液反应是由滴虫免疫系统介导的。据报道, 在对病原体 7^,8 具有挑战性的情况下, 对滴虫血淋巴的分析是评估免疫反应的有用工具^.

关节的免疫反应分为体液和细胞反应。体液反应涉及血凝过程和抗菌蛋白肽的产生, 而细胞免疫反应是通过血细胞进行的。这些细胞存在于所有节肢动物的血淋巴中, 据报道, 它们在涉及先天免疫反应^的研究中发展出表达作用, 因为它与吞噬和包封过程直接相关。因此, 对血细胞的研究有助于研究死亡途径和了解自体吞噬、凋亡和坏死等过程。在一些无脊椎动物作为双壳体, 血细胞的收集面临的限制, 如细胞破坏, 低血淋巴体积获得, 低浓度的恢复细胞^10.根据所采用的方法, 通常会降低细胞浓度, 直接影响细胞的定量和分析。

血淋巴中循环的血细胞数量在不同节肢动物之间是可变的, 由于性别、年龄和节肢动物发育阶段11等生理阶段不同, 同一物种的血细胞数量^可能发生变化。血细胞也可以被发现粘附在一些器官上, 并在感染过程^{1 1 后}立即释放到循环中。然而, 大多数研究报告使用昆虫, 而滴答声仍然较少探索有关他们的生理和病理。尽管病原体接种和血淋巴收集在滴答声是较少使用的技术, 建立标准的方法有助于发展更准确的研究。

本研究的目的是比较最常用的血淋巴收集方法, 并将病原体接种成r. 微 + 滴答声, 评价血淋巴采集和血细胞浓度的有效性。

研究方案

本研究中使用的滴答声来自里约热内卢联邦农村大学的一个人工群体, 这些方法已得到使用脊椎动物伦理委员会 (CEUA-IV任何 #037) 的批准。

1. 被打勾的女性

1. 在滴度收集后, 用自来水清洗被吞没的雌性, 并将它们浸泡在 0.5% (v/v) 次氯酸钠溶液中 3分钟, 在500毫升玻璃烧杯接受者中保持 3分钟, 以保持角质层卫生 (图 1), 然后用无菌纸巾将所有雌性水浸泡 (图2)。
2. 将雌性分成均匀加权组 (每个有20名女性): 一组没有任何处理, 一个对照组接种 5μl 0.1% 聚氧乙烯基单油酸盐水溶液 (v/v), 一个感染组接种 5μl, 1.0 x 10⁷囊胚 ml-1.
   注: 只有未经处理的滴答声才用于体积和血细胞浓度。对每个组进行了三次复制。

2. 阴囊和头状花序之间的病原体接种

注: 在本研究中, 昆虫病原真菌悬浮液被用作一个例子。

1. 怀疑真菌囊胚在1毫升的0.1% 聚氧乙烯基山梨酸水溶液 (v/v), 并调整到最后浓度 1.0 x 10 7 囊胚 ml-1.在塑料石蜡膜表面加入 5Μl metarhizium 囊胚 (图 3) 悬浮液。
   注:利用Neubauer 的腔体调整了金属化组织囊胚悬浮液.为了加快接种过程, 可以在塑料石蜡薄膜表面添加多个气泡, 每个气泡对应5Μl。
2. 使用1毫升超细胰岛素注射器和0.3 毫米针将悬浮液拉入滴答声中。在使用注射器之前, 记得把所有的空气都取出来。
3. 在阴囊和头状花序之间的滴虫中培养5Μl 真菌悬浮液。对照组的接种女性, 含有 5μl 0.1% 聚氧乙烯基山梨醇单油酸水溶液 (v/v), 无真菌。
   注: 针插入后, 孔上可能会出现少量的血淋巴。注意不要给空气接种疫苗。

3. 腿大腿与虫女性身体之间昆虫病原真菌的接种

1. 接种女性与真菌悬浮液 (5μl 在 1.0 x 10 x¹⁰ 7 囊胚 ml-1) 之间的腿 tigh 和女性的身体, 使用1毫升超细胰岛素注射器结合到0.3 毫米针。从对照组中接种女性, 用 5μl 0.1% 聚氧乙烯基山梨醇单油酸水溶液 (v/v)。
   注: 当在腿部和雌性的身体之间进行Metarhizium囊虫接种时, 插入针头后, 可在 tigh 上出现少量的血淋巴。注意不要给空气接种疫苗。

4. 背侧血淋巴收集

1. 使用有翅膀的输液装置的橡胶部分, 0.3 毫米毛细管, 和过滤尖端进行血淋巴收集。
2. 用0.3 毫米的针破坏女性背性角质层。
3. 中断后, 对滴答声体的前部施加温和的压力。观察从破坏现场抽出的几乎透明的液体。通过将液体通过与有翅输液装置的橡胶部分和 0.3 mm 毛细管耦合的滤嘴吸走液体来收集血淋巴。
   注: 不要按滴答声的身体在其固定过程中, 因为这可能会破坏中肠和污染血淋巴。等待, 直到温和的压力可以排出液体, 而不会受到污染。

5. 从腿收集血淋巴

1. 固定滴答声, 用剪刀剪下一条前腿。
   注: 一个或多个腿可以被切割, 以及, 同一条腿可以被削减一次以上。
2. 对滴答声的后部身体部分施加温和的压力。观察一个透明的液体气泡, 该气泡出现在切割部位, 并将其与毛细管一起收集, 如步骤4.3 所述。
   注: 不要按滴答声的身体在其固定过程中, 因为这可能会破坏中肠和污染血淋巴。等待, 直到温和的压力可以排出液体, 而不会受到污染。

6. 血淋巴加工

1. 血淋巴采集后, 将其存放在 1.5 mL 微管中, 这些微管中含有30μl 蛋白酶鸡尾酒和82μl 盐水缓冲液。在整个血淋巴收集过程中, 将微管放在冰上。
2. 离心机样品 (在 4°C 下, 每次 500xg 3分钟)。血淋巴离心后形成血细胞软颗粒。
   注: 对于血淋巴定量, 通过计算微管内的总体积并扣除蛋白酶鸡尾酒和盐水缓冲液的体积来量化所获得的血淋巴体积。
3. 小心去除上清液 (无细胞血淋巴)。轻轻地重新悬浮细胞, 例如, 莱博维茨的 L-15 培养调整为 pH 7.0-7.2。通过将10μl 的再悬浮血细胞放置在 Neubauer 腔中, 对血细胞进行定量。

7. 血细胞取样幻灯片的制备

1. 用剪刀剪断滴答声的前腿。
2. 对滴答声的后部身体部分施加温和的压力。观察在切割部位显示的透明液体气泡。
3. 将血淋巴滴直接涂在干净的显微镜幻灯片上, 然后用适当的方法对细胞进行染色。
   1. 用 Giemsa 染色血细胞, 在滑块上风干 30分钟, 用甲醇在室温下固定 3分钟, 在 Giemsa 溶液中染色 30分钟, 在室温下染色 30分钟 (索伦森缓冲液的1:9 比, pH 7.2)。用自来水清洗幻灯片, 去除多余的染料, 风干滑块, 并在光学显微镜下评估400x 的细胞。

结果

本文探讨了接种和血淋巴收集方法应用于滴答声。在大腿和女性身体之间接种后, 在此过程中可以分泌一些液体 (血淋巴);但是, 需要注意的是, 当接种完成后, 针尖或接种部位不存在液体或组织, 以确保真菌悬浮液被完全接种。当接种过程正确进行时, 针头插入不会导致滴虫雌性死亡。另一方面, 滴答声在接种昆虫病原真菌约48小时后死亡。大腿与滴虫女性身体之间的接种会?...

讨论

当这项研究旨在研究微生物在实验节肢动物模型中的体内作用时, 病原体的接种是有用的, 因为它确保病原体在宿主体内。该技术也可用于接种 RNA 干扰 (RNAi) 等分子。在阴囊和头状花序之间的接种被认为更容易执行, 但经常损害吉内的器官, 损害鸡蛋的生存能力 12,¹³。Gené的器官在解剖上靠近头盖骨的前部, 它是病毒14的重要器官.因此, ?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkaline Hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	A1727
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
EDTA	Synth	2706
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000036
Flexible rubber	BD
Giemsa stain	Sigma-Aldrich	48900-500ML-F
Glass capillary	CTechGlass	CT95-02
Insulin syringe (needle)	BD	SKU: 324910
KH2PO4	Vetec	60REAVET014512
Leibovitz's L-15 culture medium	Gibco	11415-064
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
Microscope slides	Kasvi	K5-7105
Microtubes	BRAND	Z336769-1PAK
Na2HPO4	Vetec	60REAVET014593
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0111
Penicillin	Gibco	15140163
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Tween 80	Vetec	60REAVET003662