JoVE Logo
Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Un ensayo de rebanada ex vivo permite que el crecimiento del nervio oculomotor se intermiera en tiempo real. Los cortes se generan mediante la incrustación de embriones E10.5 IslMN:GFP en agarosa, cortando en un vibratome, y creciendo en una incubadora de etapa superior. El papel de las vías de orientación de axón se evalúa mediante la adición de inhibidores a los medios de cultivo.

Resumen

Los movimientos oculares precisos son cruciales para la visión, pero el desarrollo del sistema motor ocular, especialmente las vías moleculares que controlan la orientación de axón, no ha sido completamente aclarado. Esto se debe en parte a las limitaciones técnicas de los ensayos tradicionales de orientación de axón. Para identificar señales adicionales de guía de axón que influyen en el nervio oculomotor, se desarrolló un ensayo de rebanada ex vivo para imaginar el nervio oculomotor en tiempo real a medida que crece hacia el ojo. E10.5 Los embriones IslMN-GFP se utilizan para generar rodajas ex vivo incrustándolas en agarosa, cortando en un vibratomo, luego creándolas en una incubadora de microscopio con fotomicroscopía de lapso de tiempo para 24-72 h. Rebanadas de control recapituladas el momento in vivo del crecimiento de los axónes desde el núcleo hasta la órbita. Se pueden añadir inhibidores de moléculas pequeñas o proteínas recombinantes a los medios de cultivo para evaluar el papel de las diferentes vías de orientación de axón. Este método tiene las ventajas de mantener más del microambiente local a través del cual atraviesan los axones, no axotomizar los axons en crecimiento, y evaluar los axons en múltiples puntos a lo largo de su trayectoria. También puede identificar efectos en subconjuntos específicos de axones. Por ejemplo, la inhibición de CXCR4 hace que los axones todavía dentro del cerebro medio crezcan dorsalmente en lugar de ventralmente, pero los axones que ya han salido ventralmente no se ven afectados.

Introducción

El sistema de motor ocular proporciona un sistema elegante para investigar los mecanismos de orientación de axón. Es relativamente sencillo, que consiste en tres nervios craneales que inervian seis músculos extraoculares (EOM) que mueven el ojo, y el levator palpebrae superioris (LPS) que levanta el párpado. El nervio oculomotor incuba el LPS y cuatro EOM - el oblicuo inferior y los músculos medial, inferior, y superior recto. Los otros dos nervios, el trochlear y los abducens, cada uno de ellos sólo inervate un músculo, el músculo oblicuo superior y el músculo recto lateral, respectivamente. Los movimientos oculares proporcionan una lectura fácil, que muestra si la inervación era apropiada, faltaba o era aberrante. Además, hay trastornos del movimiento ocular humano que resultan de déficits en el desarrollo neuronal o guía de axón, colectivamente llamados los trastornos congénitos de disinnervación craneal (CCDD)1.

A pesar de estas ventajas, el sistema motor ocular rara vez se utiliza en los estudios de orientación de axón2,3,4,5,6,7,8, 9 , 10, debido a inconvenientes técnicos. Los ensayos de orientación axón in vitro tienen muchas desventajas11. Los ensayos de cocultivo, en los que los explantes neuronales se cultivan junto con explantas de tejido objetivo12 o células transfectóte13,dependen tanto de la simetría del explantar como del posicionamiento preciso entre el tejido explanteo y el tejido diana. Ensayos de rayas14,15, en los que se establecen dos señales en franjas alternas y los axones se evalúan para un crecimiento preferencial en una franja, sólo indican que un sustrato es preferible al otro, no que cualquiera de los dos sea atractivo repulsivo, o fisiológicamente relevante. Las cámaras de microfluidos pueden formar gradientes químicos precisos, pero sujeto a axones en crecimiento a tensión de cizallamiento16,17,18, que pueden afectar su crecimiento. Además, en cada uno de estos enfoques, la recolección de explantas o células disociadas requiere que los axons de crecimiento superior sean axotomizados y, por lo tanto, estos ensayos examinan realmente la regeneración de axón, en lugar del crecimiento inicial del axón. Por último, estos enfoques in vitro eliminan el microambiente que influye en los axones y sus respuestas a las señales a lo largo de diferentes puntos de su curso, y tradicionalmente sólo prueban una señal de forma aislada. Al componer estas desventajas, el pequeño tamaño de cada núcleo en el sistema motor ocular hace que la disección sea técnicamente difícil para explantas o cultivos disociados. Además, los cultivos primarios de las neuronas motoras oculares suelen ser heterogéneos, tienen muerte celular significativa y dependen de la densidad, lo que requiere la agrupación de células de múltiples embriones (Ryosuki Fujiki, comunicación personal). Los métodos in vivo, sin embargo, incluyendo modelos de ratón knockout, son inapropiados para su uso para la detección, dado el tiempo y los gastos requeridos.

Los métodos desarrollados para cultivar embriones enteros19 permiten el etiquetado de células migratorias20 o bloqueo de moléculas específicas21,pero los cultivos de embriones enteros requieren incubación en botellas de rodillos que impide la toma de imágenes en tiempo real de las etiquetas Estructuras. También son posibles las técnicas quirúrgicas que permiten la manipulación del embrión y luego el posterior desarrollo posterior, ya sea en el útero o en el abdomen de la madre (manteniendo la conexión placentaria)22, pero tampoco permiten lapso de tiempo Imagen.

Para superar los obstáculos de los ensayos in vitro y permitir un cribado rápido de las vías de señalización, se desarrolló una técnica de cultivo de rodajas embrionarias ex vivo23,adaptada de un protocolo previamente publicado para el crecimiento del nervio periférico24. Usando este protocolo, el nervio oculomotor en desarrollo se puede imaginar con el tiempo en presencia de muchas de las estructuras circundantes a lo largo de su trayectoria, incluyendo objetivos de la MOE. Mediante la adición de inhibidores de moléculas pequeñas, factores de crecimiento o señales de orientación a los medios de cultivo, podemos evaluar perturbaciones de orientación en múltiples puntos a lo largo de la trayectoria del axón, permitiendo una evaluación más rápida del crecimiento potencial y los factores de orientación.

Protocolo

Todo el trabajo de animales descrito aquí fue aprobado y realizado de conformidad con los protocolos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Boston Children's Hospital.

1. Apareras cronometradas

  1. Colocar ISLMN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J Stock No: 017952) ratones machos y hembras juntos durante la noche. Pesar las hembras y registrar pesos antes del apareamiento.
    NOTA: ISLMN:GFP etiqueta específicamente las neuronas motoras con un GFP farnesylated que no es citotóxico, localiza a la membrana celular de las neuronas motoras y sus axones, y permite visualizar los nervios durante el desarrollo25. También se podrían utilizar otras líneas etiquetadas fluorescentes.
  2. Compruebe si hay tapones vaginales en la mañana temprano. La fecha en que se identifica un enchufe se designa como E0.5.
  3. Confirme el embarazo con aumento de peso y/o ultrasonido en E10.5. Las presas embarazadas deben haber ganado al menos 1 g. Los embriones se pueden ver en ultrasonido en E10.5.

2. Preparación de reactivos y vibratome para el cultivo de rodajas

  1. Preparar 500 ml de tampón de corte: añadir 5 ml de HEPES y 5 ml de penicilina/estreptomicina a 500 ml de la solución de sal equilibrada (HBSS) de Hank sin Ca2+ y Mg2+.  Enfríe a 4 oC.
    NOTA: El búfer de corte adicional debe almacenarse a 4 oC y se puede utilizar para futuros experimentos de cultivo de sectores.
  2. Preparar 50 ml de medios de cultivo: En una campana estéril, añadir 12,5 ml de HBSS, 12,5 ml de suero bovino fetal, 250 ml de glucosa, 250 ml de L-glutamina, 125 ml de HEPES a 24,4 ml de Fluorobright DMEM. (Concentraciones finales: FlouroBright DMEM con 25% HBSS, 25% FBS, 0.5% glucosa, 1 mM de glutamina y 2,5 mM HEPES.).  Calentar los medios de cultivo a 37 oC en un baño de agua estéril.
    NOTA: Los medios de cultivo se pueden almacenar a 4 oC durante un máximo de 3 semanas.
    1. En una capucha estéril, agregue 1,5 ml de medios de cultivo a cada pocto de un plato de 6 pocillos.  Agregue una inserción de referencia cultural de celda (Tablade materiales)a cada poca.  Colocar en una incubadora estéril de 37oC y 5% de CO2.
  3. Preparar 4% de agarosa de baja temperatura de fusión: disolver 2 g de agarosa de baja temperatura de fusión en 50 ml de PBS estéril. Microondas en intervalos de 30-60 s hasta que se disuelvan por completo. Colocar en un baño de agua a 40 oC para mantener el líquido.
    NOTA: La agarosa adicional se puede almacenar a temperatura ambiente (RT) y derretirse para futuros experimentos de cultivo de rebanadas.
  4. Configurar vibratome: Coloque una nueva hoja en el vibratome. Compruebe los ajustes: espesor 400-450 m. Enfríe previamente la etapa del vibratomo. Coloca hielo en la cámara exterior. Utilice una cámara y un escenario dedicados a las rebanadas en vivo. No utilice la misma cámara de vibratome para el tejido fijo, ya que el fijador residual podría ser perjudicial para las rodajas.
  5. Preparar la incubadora superior de etapa del microscopioa 37 oC y 5% de CO 2.
  6. Prepararse para la disección: Limpie los instrumentos quirúrgicos y rocíe con 70% de etanol. Llene dos platos De Petri con HBSS, colóquelos en hielo. Abra una placa de cultivo de tejido de 12 pocillos y coloque la tapa sobre hielo con la parte inferior hacia arriba. Abra una placa de cultivo de tejido de 6 pozos y coloque las inserciones de membrana de cultivo celular y los medios de cultivo celular de 1,5 ml en cada poca. Precalentar la placa en una incubadora de 37oC y 5% de CO2.

3. Cosecha de embriones E10.5 y preparación de rodajas

NOTA: Todos los pasos a partir de este punto deben realizarse lo más rápido posible. Mantenga los embriones en hielo en todo momento.

  1. Eutanasiar la presa embarazada (E10.5) en una cámara de CO2. Realizar luxación cervical.
  2. Rocíe el abdomen con 70% de etanol. Abra el abdomen con tijeras, retire el útero y colóquelo en un plato de Petri con HBSS helado para lavar rápidamente la sangre. Mueva el útero lavado a un segundo Petri lleno de HBSS helado.
  3. Bajo un alcance de disección, retire los embriones del cuerno uterino y los sacos amnióticos individuales. Coloque los embriones en la parte inferior de la tapa de una placa de 12 pocillos. Manténgase en hielo.
  4. Bajo un endoscopio, utilice papel filtrante para eliminar cualquier líquido que rodee a cada embrión.
    NOTA: Los embriones se pegarán al papel del filtro si se tocan.
  5. Incrustar embriones en agarosa. Verter agarosa derretida sobre cada embrión para cubrirlo. Manténgase en hielo. Tan pronto como la agarosa se haya endurecido, voltee cada embrión y vierta agarosa adicional en el otro lado. Manténgase en hielo.
  6. Usando un visor de diselación fluorescente, recorta la agarosa alrededor de cada embrión para que se oriente correctamente cuando se pegue a la etapa del vibratome. El núcleo oculomotor y el crecimiento temprano del axón son fluorescentes. Alinee el embrión de modo que el núcleo, los axons que crecen y el ojo formen una línea, y recorte la agarosa con una cuchilla de afeitar cortada paralela a esta línea (dorsal al embrión, véase la Figura 1A).
    NOTA: Este será el lado pegado a la etapa del vibratome (el embrión se colocará en su espalda, la cabeza más cercana a la hoja del vibratome). Una línea entre el núcleo oculomotor y el ojo debe ser paralela a la hoja vibratoria.
  7. Llene la cámara de vibratome con tampón de rodajas heladas. Superglue el embrión a la etapa vibratome para que la hoja sea paralela al núcleo oculomotor y los ojos. Una vez que el superpegamento está seco, sumerja la etapa del vibratome para que el embrión esté orientado hacia fuera de la hoja.
  8. Cortar 400-450 m de rodajas.  Recoja cada rebanada con un pipeta de transferencia estéril. Colocar en un búfer de corte en frío.
  9. Bajo el alcance de diselación, elija la rebanada que contiene los núcleos y los ojos oculomotores. Usando un pipeta de transferencia estéril, colóquelo en el inserto de cultivo celular en la placa de 6 pocillos. Vuelva a colocar la placa en la incubadora de 37oC. Alternativamente, pida a una persona que corte y otra colocando las rodajas. Minimice el tiempo entre el corte y la colocación en la incubadora.
    NOTA: Los cortes deben orientarse de manera que la fluorescencia máxima emitida por los núcleos y axones sea más cercana al objetivo del microscopio de imagen. En un microscopio invertido, las rodajas deben colocarse en la membrana con los núcleos y axónes más cercanos al objetivo debajo de la placa.
  10. Retire la agarosa residual de la etapa del vibratome, superencola el siguiente embrión hasta el escenario y repita los pasos 3.7-3.9 hasta que todos los embriones hayan sido cortados y chapados.
  11. Añadir inhibidor o molécula recombinante de elección a los medios en cada pozo para crear una curva dosis-respuesta.  Diluir en disolvente adecuado.
    NOTA: Si utiliza DMSO, utilice solo DMSO de grado de cultivo de tejido. Alternativamente, los granos de elusión de proteínas se pueden colocar en lugares específicos de la rebanada.
  12. Colocar sobre el microscopio en la cámara de 37oC y 5% de CO2.  Ajuste el microscopio para tomar fotografías fluorescentes y de contraste de fase de cada rebanada cada 30 minutos (o más a menudo si lo desea). Las rebanadas se pueden mantener durante 48-72 h.

Resultados

Resultados normales: la figura 1 proporciona un esquema del experimento. A partir de e9.5 en ratón, los primeros axons comienzan a emerger del núcleo oculomotor26. Por E10.5, un nervio oculomotor fasciculado, que contiene las primeras neuronas pioneras, se puede ver en el mesenquima. Hay una variabilidad significativa entre los embriones en E10.5 (incluso dentro de la misma camada) en la distancia a la que el nervio ha progresado hacia la órbita, probablemente debi...

Discusión

Este protocolo de cultivo de rebanadas ex vivo proporciona ventajas significativas sobre los ensayos de orientación de axón tradicionales23. El tamaño de cada núcleo motor craneal no es un factor limitante, y no es necesaria una disección difícil. Se mantiene el microambiente endógeno a través del cual viajan los axones, permitiendo la modificación de una vía de señalización manteniendo otras vías de señalización. Además, los efectos se pueden evaluar en diferentes puntos a lo larg...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Financiación proporcionada por el Instituto Nacional del Ojo [5K08EY027850], Instituto Nacional de Salud y Desarrollo Infantil [U54HD090255], Harvard-Vision Clinical Scientist Development Program [5K12EY016335], Knights Templar Eye Foundation [Career Starter Grant], y la Fundación de Oftalmología del Hospital Infantil [Faculty Discovery Award]. ECE es investigador del Instituto Médico Howard Hughes.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
24-Well Tissue Culture PlateGenesee Scientific25-107
6-Well Tissue Culture PlateGenesee Scientific25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)VWR14672-200
Fine ForcepsFine Science Tools11412-11
Fluorobrite DMEMThermo Fisher ScientificA1896701
Glucose (200 g/L)Thermo Fisher ScientificA2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X)Thermo Fisher Scientific14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicalsS11550H
HEPES Buffer Solution (1M)Thermo Fisher Scientific15630106
L-Glutamine (250 nM)Thermo Fisher Scientific25030081
Loctite SuperglueLoctite
Low Melting Point AgaroseThermo Fisher Scientific16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)Millipore SigmaPICM03050
Moria Mini Perforated SpoonFine Science Tools10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122 
Petri Dish (100 x 15mm)Genesee Scientific32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)Thermo Fisher Scientific10010049
Razor BladesVWR55411-050
Surgical Scissors - BluntFine Science Tools14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRFNikon
Vibratome (VT 1200S)Leica1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)Ted Pella, Inc.121-6

Referencias

  1. Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
  2. Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
  3. Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
  4. Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
  5. Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
  6. Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
  7. Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).
  8. Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
  9. Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
  10. Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
  11. Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
  12. Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
  13. Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
  14. Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
  15. Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
  16. Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
  17. Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
  18. Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
  19. Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).
  20. Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
  21. Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
  22. Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
  23. Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
  24. Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
  25. Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
  26. Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
  27. Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
  28. Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
  29. Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

NeurocienciaN mero 149oculomotortrastorno de disinnervaci n craneal cong nitagu a de ax nmovimientos ocularesim genes de lapso de tiempocultivo de rebanadas

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados