Ex Vivo Okulomotor Slice Culture von embryonalen GFP-ausdrückenden Mäusen für Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Zusammenfassung

Ein ex vivo Slice-Assay ermöglicht es, das okulomotorische Nervenwachstum in Echtzeit abzubilden. Die Scheiben werden durch Einbetten von E10.5 Isl MN:GFP-Embryonen in Agarose erzeugt, auf einem Vibram geschnitten und in einem Bühnen-Top-Inkubator wachsen. Die Rolle der Axon-Beratungswege wird durch Dieminadien zu den Kulturmedien bewertet.

Zusammenfassung

Genaue Augenbewegungen sind entscheidend für das Sehen, aber die Entwicklung des Okularmotoriksystems, insbesondere der molekularen Bahnen, die die Axonführung steuern, wurde noch nicht vollständig aufgeklärt. Dies ist zum Teil auf die technischen Einschränkungen traditioneller Axon-Leitfaden-Assays zurückzuführen. Um zusätzliche Axon-Leitlinien zu identifizieren, die den okulomotorischen Nerv beeinflussen, wurde ein ex vivo-Slice-Assay entwickelt, um den okulomotorischen Nerv in Echtzeit abzubilden, während er zum Auge heranwächst. E10.5 Isl^MN-GFP-Embryonen werden verwendet, um ex vivo Scheiben zu erzeugen, indem sie in Agarose eingebettet werden, auf ein Vibratome schneiden und sie dann in einem Mikroskop-Bühnen-Top-Inkubator mit Zeitraffer-Photomikroskopie für 24-72 h anbauen. das in vivo Timing des Auswachsens von Axonen vom Kern in die Umlaufbahn. Kleine Molekülinhibitoren oder rekombinante Proteine können den Kulturmedien hinzugefügt werden, um die Rolle verschiedener Axon-Führungswege zu bewerten. Diese Methode hat die Vorteile, mehr von der lokalen Mikroumgebung zu erhalten, durch die Axone durchqueren, nicht die wachsenden Axone axotomisieren und die Axone an mehreren Punkten entlang ihrer Flugbahn bewerten. Es kann auch Effekte auf bestimmte Teilmengen von Axonen identifizieren. Zum Beispiel führt die Hemmung von CXCR4 dazu, dass Axone, die sich noch innerhalb des Mittelhirns befinden, eher dorsal als ventral wachsen, aber Axone, die bereits ventral ausgetreten sind, sind nicht betroffen.

Einleitung

Das Augenmotorsystem bietet ein elegantes System zur Untersuchung von Axon-Führungsmechanismen. Es ist relativ unkompliziert, bestehend aus drei Hirnnerven, die sechs extraokulare Muskeln (EOMs) innervieren, die das Auge bewegen, und dem Levator palpebrae superioris (LPS), der das Augenlid hebt. Der okulomotorische Nerv innerviert die LPS und vier EOMs - die unterlegene Schräglage und die mediale, minderwertige und überlegene Rectusmuskulatur. Die anderen beiden Nerven, die Trochlea und abducens, jeder nur innervate einen Muskel, die überlegene schräge und seitliche Rectus-Muskel, jeweils. Augenbewegungen bieten eine einfache Anzeige, zeigt, ob Innervation angemessen, fehlt oder abwegig war. Darüber hinaus gibt es menschliche Augenbewegungsstörungen, die aus Defiziten in der neuronalen Entwicklung oder Axonführung resultieren, kollektiv als die angeborenen Schädel-Disinnervationsstörungen (CCDDs)¹bezeichnet.

Trotz dieser Vorteile wird das Augenmotorsystem selten in Axon-Leitstudien 2 ,^3,4,^{5,6,7,8, 9 , 10}, aufgrund technischer Nachteile. In-vitro-Axon-Leitlinien-Assays haben viele Nachteile¹¹. Co-Kultur-Assays, bei denen neuronale Explanten zusammen mit Explanten des Zielgewebes¹² oder transfizierter Zellen¹³kultiviert werden, hängen sowohl von der Symmetrie des Explantations- als auch der präzisen Positionierung zwischen Explantation und Zielgewebe ab. Streifenassays^14,15, in denen zwei Hinweise in abwechselnden Streifen und Axonen auf bevorzugtes Wachstum auf einem Streifen festgelegt sind, deuten nur darauf hin, dass ein Substrat dem anderen vorzuziehen ist, nicht, dass beide attraktiv sind. abstoßend oder physiologisch relevant. Mikrofluidikkammern können präzise chemische Gradienten bilden, aber wachsende Axone der Scherspannung^16,17,18, unterziehen, die ihr Wachstum beeinflussen können. Darüber hinaus erfordert das Sammeln von Explanten oder dissoziierten Zellen bei jedem dieser Ansätze, dass auswachsende Axone axotomisiert werden, und daher untersuchen diese Assays tatsächlich die Axonregeneration und nicht das anfängliche Axonwachstum. Schließlich entfernen diese In-vitro-Ansätze die Mikroumgebung, die Axone und ihre Reaktionen auf Hinweise entlang verschiedener Punkte ihres Kurses beeinflusst, und testen traditionell nur einen Hinweis isoliert. Zusammen mit diesen Nachteilen stellt die geringe Größe jedes Kerns im Augenmotorsystem die Zerlegung für Explanten oder dissoziierte Kulturen technisch eine Herausforderung dar. Darüber hinaus sind Primärkulturen von okularen motorischen Neuronen in der Regel heterogen, haben einen signifikanten Zelltod und sind dichteabhängig, was eine Zusammenlegung von Zellen aus mehreren Embryonen erfordert (Ryosuki Fujiki, persönliche Kommunikation). In-vivo-Methoden, einschließlich Knockout-Maus-Modelle, sind jedoch angesichts der Zeit und des Erforderlichen für das Screening ungeeignet für das Screening.

Methoden, die entwickelt wurden, um ganze Embryonen zu kultivieren¹⁹ ermöglichen die Kennzeichnung von wandernden Zellen²⁰ oder die Blockade bestimmter Moleküle²¹, aber ganze Embryokulturen erfordern eine Inkubation in Rollenflaschen, was eine Echtzeit-Bildgebung von markierten Strukturen. Chirurgische Techniken, die eine Manipulation des Embryos und anschließende Weiterentwicklung entweder in der Gebärmutter oder im Bauch der Mutter (Aufrechterhaltung der Plazentaverbindung)²² ermöglichen, erlauben aber auch keinen Zeitraffer Imaging.

Um die Hindernisse von In-vitro-Assays zu überwinden und ein schnelles Screening von Signalwegen zu ermöglichen, wurde eine ex vivo embryonale Scheibenkulturtechnik entwickelt²³, angepasst an ein zuvor veröffentlichtes Protokoll für peripheres Nervenwachstum²⁴. Mit diesem Protokoll kann der sich entwickelnde okulomotorische Nerv im Laufe der Zeit in Gegenwart vieler der umgebenden Strukturen entlang seiner Flugbahn abgebildet werden, einschließlich EOM-Ziele. Durch Hinzufügen kleiner Molekülinhibitoren, Wachstumsfaktoren oder Leitfäden zu den Kulturmedien können wir Die Orientierungsstörungen an mehreren Punkten entlang des Axonverlaufs bewerten und so eine schnellere Bewertung potenzieller Wachstums- und Orientierungsfaktoren ermöglichen.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen des Boston Children es Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt und durchgeführt.

1. Zeitzeitliche Paarungen

1. Platz ISL^MN:GFP (Islet Motor Neuron Green Fluorescent Protein; MGI: J:132726; Jax Tg(Isl-EGFP*)1Slp/J Stock Nr.: 017952) männliche und weibliche Mäuse über Nacht zusammen. Wiegen Sie die Weibchen und zeichnen Sie Gewichte vor der Paarung auf.
   HINWEIS: ISL^MN:GFP kenniert speziell motorische Neuronen mit einem farnesylierten GFP, das nicht zytotoxisch ist, lokalisiert sich auf die Zellmembran von motorischen Neuronen und ihren Axonen und ermöglicht es, die Nerven während der Entwicklung zu visualisieren²⁵. Andere fluoreszierend markierte Linien könnten ebenfalls verwendet werden.
2. Überprüfen Sie, ob vaginale Stecker am frühen Morgen. Das Datum, an dem ein Stecker identifiziert wird, wird als E0.5 bezeichnet.
3. Bestätigen Sie die Schwangerschaft mit Gewichtszunahme und/oder Ultraschall bei E10.5. Schwangere Muttern sollten mindestens 1 g gewonnen haben. Embryonen sind auf Ultraschall bei E10.5 zu sehen.

2. Herstellung von Reagenzien und Vibratom für die Scheibenkultur

1. 500 ml Schneidpuffer vorbereiten: 5 ml HEPES und 5 ml Penicillin/Streptomycin auf 500 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Ca²⁺ und Mg²⁺hinzufügen.  Auf 4 °C abkühlen lassen.
   HINWEIS: Der zusätzliche Schneidpuffer sollte bei 4 °C gespeichert werden und kann für zukünftige Slice-Kulturexperimente verwendet werden.
2. 50 ml Kulturmedien vorbereiten: In einer sterilen Haube 12,5 ml HBSS, 12,5 ml Fetales Rinderserum, 250 l Glukose, 250 l L L L-Glutamin, 125 l HEPES zu 24,4 ml Fluorobright DMEM hinzufügen. (Endkonzentrationen: FlouroBright DMEM mit 25% HBSS, 25% FBS, 0,5% Glukose, 1 mM Glutamin und 2,5 mM HEPES.).  Erwärmen Sie die Kulturmedien in einem sterilen Wasserbad auf 37 °C.
   HINWEIS: Kulturmedien können bis zu 3 Wochen bei 4 °C gelagert werden.
   1. In einer sterilen Kapuze, fügen Sie 1,5 ml Kulturmedien zu jedem Brunnen einer 6-Well-Platte.  Fügen Sie jedem Brunnen eine Zellkultureinlage (Materialtabelle) hinzu.  In einen sterilen 37 °C und 5% CO2-Inkubator geben.
3. 4% Niedrigschmelztemperatur-Agarose vorbereiten: 2 g Niedrigschmelztemperatur-Agarose in 50 ml sterilem PBS auflösen. Mikrowelle in 30-60 s Intervallen bis vollständig gelöst. In ein 40 °C-Wasserbad geben, um Flüssigkeit aufzubewahren.
   HINWEIS: Extra-Agarose kann bei Raumtemperatur (RT) gelagert und für zukünftige Scheibenkulturexperimente geschmolzen werden.
4. Vibratom einrichten: Legen Sie eine neue Klinge auf Vibratom. Prüfeinstellungen: Dicke 400-450 m. Vorchillen der Vibratome-Stufe. Legen Sie etwas Eis in die äußere Kammer. Verwenden Sie eine Kammer und Bühne, die Live-Slices gewidmet sind. Verwenden Sie nicht die gleiche Vibramkammer für festes Gewebe als Restfixativ könnte für Scheiben schädlich sein.
5. Bereiten Sie den Mikroskop-Bühnen-Inkubator auf 37 °C und 5%_CO2vor.
6. Vorbereiten der Zerlegung: Chirurgische Instrumente reinigen und mit 70% Ethanol besprühen. Füllen Sie zwei Petrischalen mit HBSS, auf Eis legen. Öffnen Sie eine 12 Brunnengewebe-Kulturplatte und legen Sie den Deckel auf Eis mit der Unterseite nach oben. Öffnen Sie eine 6 Well-Gewebe-Kulturplatte und platzieren Sie Zellkultur-Membraneinsätze und 1,5 ml Zellkulturmedien in jedem Brunnen. Die Platte in einem 37 °C und 5% CO2-Inkubator vorwärmen.

3. Ernte von E10.5-Embryonen und Scheibenaufbereitung

HINWEIS: Alle Schritte von diesem Punkt sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden. Halten Sie die Embryonen jederzeit auf Eis.

1. Euthanisieren Sie die schwangere Mutter (E10.5) in einer CO2-Kammer. Führen Sie zervikale Dislokation durch.
2. Den Bauch mit 70% Ethanol besprühen. Den Bauch mit einer Schere aufschneiden, die Gebärmutter entfernen und in eine Petrischale mit eiskaltem HBSS legen, um blutschnell wegzuwaschen. Bewegen Sie die gewaschene Gebärmutter zu einem zweiten Petri gefüllt mit Teller eiskalt HBSS.
3. Entfernen Sie im Rahmen eines Sezierens die Embryonen aus dem Gebärmutterhorn und einzelnen Fruchtwassersäcken. Legen Sie die Embryonen auf die Unterseite des Deckels einer 12 Brunnenplatte. Auf Eis bleiben.
4. Verwenden Sie unter einem Sezieren den Einzelnen, um alle Flüssigkeiten, die jeden Embryo umgeben, zu entfernen.
   HINWEIS: Embryonen kleben am Filterpapier, wenn sie berührt werden.
5. Einbetten von Embryonen in Agarose. Gießen Sie geschmolzene Agarose über jeden Embryo, um es zu bedecken. Auf Eis bleiben. Sobald die Agarose verhärtet ist, kippen Sie jeden Embryo und gießen Sie zusätzliche Agarose auf der anderen Seite. Auf Eis bleiben.
6. Mit einem fluoreszierenden Sezieren Bereich, trimmen Sie die Agarose um jeden Embryo, so dass es richtig ausgerichtet werden, wenn auf das Vibram-Stadium geklebt. Der okulomotorische Kern und das frühe Axonwachstum sind fluoreszierend. Richten Sie den Embryo so aus, dass der Kern, die auswachsenden Axone und das Auge eine Linie bilden, und trimmen Sie die Agarose mit einer Rasierklinge, die parallel zu dieser Linie geschnitten ist (dorsal zum Embryo, siehe Abbildung 1A).
   HINWEIS: Dies wird die Seite sein, die an das Vibratomstadium geklebt wird (der Embryo wird auf seinem Rücken positioniert, der Kopf am nächsten an der Vibratomklinge). Eine Linie zwischen dem okulomotorischen Kern und dem Auge sollte parallel zur Vibratomklinge sein.
7. Füllen Sie die Vibratomekammer mit eiskaltem Scheibenpuffer. Den Embryo an das Vibratomstadium überlagern, so dass die Klinge parallel zum okulomotorischen Kern und den Augen ist. Sobald der Superkleber trocken ist, tauchen Sie das Vibratomstadium unter, so dass der Embryo nach weg von der Klinge ausgerichtet ist.
8. In scheibenschneiden 400-450 m Scheiben.  Sammeln Sie jede Scheibe mit einer sterilen Transferpipette. In kalten Schneidpuffer geben.
9. Wählen Sie unter dem Sezieren die Scheibe aus, die die okulomotorischen Kerne und Augen enthält. Mit einer sterilen Transferpipette auf den Zellkultureinsatz in die 6 Brunnenplatte legen. Geben Sie die Platte auf den 37 °C-Inkubator zurück. Alternativ können Sie eine Person schneiden und eine andere die Scheiben platzieren. Minimieren Sie die Zeit zwischen dem Schneiden und dem Platzieren in den Inkubator.
   HINWEIS: Scheiben sollten so ausgerichtet sein, dass die maximale Fluoreszenz, die von den Kernen und Axonen emittiert wird, dem objektiven Mikroskop-Objektiv am nächsten kommt. Auf einem invertierten Mikroskop sollten die Scheiben auf die Membran mit den Kernen und Axonen gelegt werden, die dem Objektiv unter der Platte am nächsten sind.
10. Entfernen Sie die Rest-Agarose aus dem Vibratomstadium, überlagern Sie den nächsten Embryo auf die Stufe und wiederholen Sie die Schritte 3.7-3.9, bis alle Embryonen in Scheiben geschnitten und plattiert sind.
11. Fügen Sie Inhibitor oder rekombinantes Molekül der Wahl zu Medien in jedem Brunnen hinzu, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu erstellen.  In geeignetem Lösungsmittel verdünnen.
    HINWEIS: Wenn Sie DMSO verwenden, verwenden Sie nur die Gewebekultur-Klasse DMSO. Alternativ können proteineverdünnende Perlen an bestimmten Stellen auf der Scheibe platziert werden.
12. In der 37 °C und 5% CO2-Kammer auf das Mikroskop stellen.  Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass alle 30 min (oder häufiger, falls gewünscht) Phasenkontrast- und Fluoreszenzfotos von jeder Scheibe aufnehmen. Scheiben können für 48-72 h gepflegt werden.

Ergebnisse

Normale Ergebnisse: Abbildung 1 enthält einen Schaltplan des Experiments. Bereits ab E9.5 in der Maus beginnen die ersten Axone aus dem okulomotorischen Kern²⁶hervorzugehen. Bei E10.5 ist im Mesenchym ein fascikulierter okulomotorischer Nerv zu sehen, der die frühen Pionierneuronen enthält. Es gibt erhebliche Variabilität zwischen Embryonen bei E10.5 (auch innerhalb desselben Wurfs), wie weit der Nerv in Richtung der Umlaufbahn fortgeschritten ist, wahrscheinlich ...

Diskussion

Dieses ex vivo Slice Culture-Protokoll bietet erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Axon-Leitlinien-Assays²³. Die Größe jedes Kranialmotorkerns ist kein begrenzender Faktor, und eine schwierige Zerlegung ist nicht erforderlich. Die endogene Mikroumgebung, durch die die Axone wandern, ermöglicht die Änderung eines Signalwegs unter Beibehaltung anderer Signalwege. Darüber hinaus können Effekte an verschiedenen Punkten entlang der Axonbahn bewertet werden. Da axon guidance mehrere Cues ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Tissue Culture Plate	Genesee Scientific	25-107
6-Well Tissue Culture Plate	Genesee Scientific	25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)	VWR	14672-200
Fine Forceps	Fine Science Tools	11412-11
Fluorobrite DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1896701
Glucose (200 g/L)	Thermo Fisher Scientific	A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X)	Thermo Fisher Scientific	14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550H
HEPES Buffer Solution (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630106
L-Glutamine (250 nM)	Thermo Fisher Scientific	25030081
Loctite Superglue	Loctite
Low Melting Point Agarose	Thermo Fisher Scientific	16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)	Millipore Sigma	PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri Dish (100 x 15mm)	Genesee Scientific	32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010049
Razor Blades	VWR	55411-050
Surgical Scissors - Blunt	Fine Science Tools	14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF	Nikon
Vibratome (VT 1200S)	Leica	1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)	Ted Pella, Inc.	121-6