לשעבר Vivo Oculomotor ניע את התרבות של מעובריים GFP-הביע עכברים עבור זמן הדמיה של מניע העצבי החיצוני

Summary

הvivo לשעבר פרוסה מאפשרת העצב outculמניע העצבים כדי להיות בתמונה בזמן אמת. פרוסות מופקים על ידי הטבעת e 10.5 איי. איי. או. עוברי העוברים ב-agarose, הפרוסות על הרטט, וגדלים בחממה בשלב העליון. התפקיד של מסלולים הדרכה אקסון מוערך על ידי הוספת מעכבי התקשורת התרבות.

Abstract

תנועות עיניים מדויקות הם חיוניים לחזון, אבל הפיתוח של מערכת מנוע עינית, במיוחד מסלולים מולקולריים השליטה אקסון הדרכה, לא הובהר במלואו. הדבר נובע בחלקו ממגבלות טכניות של הנחיות האקסון המסורתיות. כדי לזהות רמזים נוספים הנחיות הדרכה המשפיעים על העצב מניע העיניים, vivo slice לשעבר התמונה לדמות את העצב מניע העיניים בזמן אמת כפי שהוא גדל לקראת העין פותחה. E 10.5 אי אן איי -gfp העוברים משמשים להפקת פרוסות vivo לשעבר על ידי הטבעת אותם בתוך agarose, פרוסות על הרטט, ולאחר מכן גדל אותם בשלב מיקרוסקופ העליון החממה עם הזמן לשגות photomicroscopy עבור 24-72 h. שליטה פרוסות לכידה בעיתוי vivo של צמיחה של אקסונים מן הגרעין אל המסלול. מולקולות קטנות מעכבי או חלבונים רקומביננטי ניתן להוסיף לתקשורת התרבות כדי להעריך את התפקיד של מסלולים הדרכה שונים אקסון. שיטה זו מקבלת את היתרונות של שמירה על יותר של המיקרו-סביבה המקומית שדרכה עוברים האקסונים, לא axotom, ומעריכים את האקסונים בנקודות מרובות לאורך מסלול שלהם. הוא יכול גם לזהות אפקטים בערכות ממשנה ספציפיות של axons. לדוגמה, עיכוב של CXCR4 גורם אקסונים עדיין בתוך המוח האמצע כדי לגדול dorsally ולא ventrally, אבל אקסונים כי כבר יצא ventrally לא מושפעים.

Introduction

מערכת מנוע עינית מספקת מערכת אלגנטית לחקירת מנגנוני הדרכה אקסון. זה מסובך יחסית, המורכב של שלוש עצבי הגולגולת innervating six שרירי העין (eoms) אשר להזיז את העיניים, ואת השריר palpebrae סופרוריס (lps) אשר מרים את העפעף. העצב מניע העיניים innervates LPS וארבעה EOMs-האלכסוני הנחות האמצעי, נחותים, והשרירים rectus מעולה. שני העצבים האחרים, הטרוליר והחוטפים, כל אחד מinnervate רק שריר אחד, השריר האלכסוני והשרירי הצדדי העליון, בהתאמה. תנועות עיניים לספק בדיקה קלה, מראה אם אינבציה היה מתאים, חסר או חריג. בנוסף, קיימות הפרעות בתנועת העין האנושית הנובעות מהליקויים בהתפתחות העצבית או הנחיית האקסון, כינה באופן קולקטיבי את הפרעות הגולגולת הולדות (CCDDs)¹.

למרות יתרונות אלה, מערכת מנוע עינית משמש לעתים נדירות ב אקסון לימודי הדרכה^{2,3,4,5,6,7,8} , מיכל בן ^{10 , 10}, עקב החסרונות הטכניים. באמצעות מבחנה מחוץ לספר ההדרכה יש חסרונות רבים¹¹. שיתוף תרבות שותף, שבו האקסופלאליות מתורבת הם מתורבתים יחד עם explants של רקמת היעד¹² או תאים מזוהמים¹³, תלוי הן בסימטריה של מיקום מדויק והמדויק בין רקמת המטרה. פס מספר^14,15, שבו שני רמזים מונחים בפסים ואקטונים מתחלפים מוערך על גידול מועדף על פס אחד, רק לציין כי מצע אחד עדיף על השני, לא כי או הוא אטרקטיבי או דוחה, או רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. מיקרופלואידיקה צ'יימברס יכול ליצור מעברי צבע כימיים מדויקים, אבל כפופים הגדלים אקסונים כדי להטות את הלחץ^16,17,18, אשר יכול להשפיע על התפתחותם. יתר על כן, בכל הגישות הללו, איסוף האקסוצמחים או תאים הנתק דורש כי אקסונים הגוברת להיות axotom, ולכן אלה בחני למעשה לבחון התחדשות אקסונים, במקום אקסונים הראשונית הצמיחה. לבסוף, בגישות החוץ-גופית מסירים את המיקרו-סביבה המשפיעה על האקסון ועל תגובותיהם לרמזים לאורך נקודות שונות, ובאופן מסורתי בודקים רק אות אחת בבידוד. הרכבה חסרונות אלה, הגודל הקטן של כל גרעין במערכת המנוע העינית מאפשר לקרע מאתגרת מבחינה טכנית עבור הרחבות או תרבויות הנתק. בנוסף, התרבויות הראשיות של נוירונים מוטוריים העינית הם בדרך כלל הטרוגנית, יש מוות תאים משמעותיים, והם תלויים צפיפות, המחייב אגירת תאים מעוברים מרובים (Ryosuki פוג'יקי, תקשורת אישית). עם זאת, בשיטות vivo, לרבות מודלים של עכבר מהממת, אינם מתאימים לשימוש בהקרנה, בהתחשב בזמן ובהוצאות הנדרשות.

שיטות שפותחו לתרבות העוברים שלמים¹⁹ לאפשר תיוג של תאים הגירה²⁰ או מצור של מולקולות ספציפיות²¹, אבל תרבויות העובר השלם דורשים דגירה בבקבוקי רולר אשר מונע הדמיה בזמן אמת של תוויות מבנים. טכניקות כירורגיות המאפשרות מניפולציה של העובר ולאחר מכן לאחר מכן פיתוח נוסף ברחם או בבטן של האם (שמירה על חיבור הסביבה)²² הם גם אפשריים, אבל אלה גם לא לאפשר הזמן לשגות דמיה.

כדי להתגבר על המכשולים של מחוץ לבית הספר ולאפשר הקרנה מהירה של מסלולים איתות, הטכניקה vivo לשעבר התרבות פרוסה מתחלקים התפתחה²³, המותאם מתוך פרוטוקול שפורסם בעבר היקפית היקפיים מוצלח²⁴. באמצעות פרוטוקול זה, את העצב המתפתח מתפתח לאורך זמן בנוכחות רבים של המבנים שמסביב לעבר מסלול, כולל מטרות EOM. על ידי הוספת מעכבי מולקולה קטנה, גורמי גדילה, או רמזים הדרכה לתקשורת התרבות, אנחנו יכולים להעריך הדרכה רטבאליות בנקודות מרובות לאורך מסלול אקסון, המאפשר הערכה מהירה יותר של גורמי צמיחה פוטנציאליים הדרכה.

Protocol

כל העבודה בעלי חיים תיאר כאן אושרה והתבצע בציות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים בבית החולים לילדים והוועדה לשימוש (IACUC) פרוטוקולים.

1. מועד מתוזמן

1. מקום איי. איי. אן : gfp (מוטוריים איון תא העצב חלבון פלורסנט ירוק; MGI: J:132726; ג'אקס Tg (איי-באקס) 1Slp/J מלאי: 017952) עכבר זכר ונקבה ביחד בן לילה. שוקלים את הנקבות. והקליטו משקולות לפני ההזדווגות
   הערה: איי. איי. אם : gfp במיוחד לתוויות נוירונים מוטוריים עם gfp בלתי ממונע, כי הוא לא ציטוטוקסיטים, לשים את קרום התא של נוירונים מוטוריים האקטונים שלהם, ומאפשר את העצבים להיות דמיינו במהלך פיתוח²⁵. ניתן להשתמש בקווים אחרים המסומנים באמצעות פלואורוסקופים.
2. בדוק אם יש אטמי נרתיק בבוקר מוקדם. התאריך בו מזוהה התקע מוגדר כ-E 0.5.
3. לאשר הריון באמצעות עלייה במשקל ו/או אולטרסאונד ב-E 10.5. סכרים הריון צריך להרוויח לפחות 1 g. עוברים ניתן לראות באולטרסאונד ב-E 10.5.

2. הכנת ריאגנטים והרטט לתרבות הפרוסה

1. הכינו 500 mL של מאגר פרוסות: להוסיף 5 מ ל של HEPES ו 5 מ ל של פניצילין/סטרפטומיצין כדי 500 mL של פתרון מלח מאוזן של האנק (HBSS) ללא Ca^{2 +} ו-Mg^{2 +}.  מקררים עד 4 ° c.
   הערה: יש לאחסן את מאגר הפרוסות הנוסף ב-4 ° צ' וניתן להשתמש בו לניסויים עתידיים בתרבות הפרוסה.
2. להכין 50 mL של מדיה התרבות: בשכונה סטרילית, להוסיף 12.5 mL של HBSS, 12.5 mL של סרום שור העוברי, 250 μL של גלוקוז, 250 μL של L-גלוטמין, 125 μL של HEPES כדי 24.4 mL של הגברת Fluorobright. (הריכוזים הסופיים: dourobימניים הגברת עם 25% HBSS, 25% FBS, 0.5% גלוקוז, 1 מ"מ גלוטמין, ו 2.5 מ"מ HEPES.).  חמם את מדיית התרבות עד 37 ° c באמבט מים סטרילי.
   הערה: ניתן לאחסן את מדיית התרבות ב-4 ° צ' עד 3 שבועות.
   1. במכסה סטרילי, להוסיף 1.5 mL של מדיית התרבות לכל טוב של צלחת 6-היטב.  הוסף הוספת תרבות תא (טבלת חומרים) לכל באר.  מניחים ב סטרילי 37 ° c ו 5% חממה₂ .
3. הכינו 4% טמפרטורה נמוכה התכה agarose: לפזר 2 גרם של טמפרטורה נמוכה התכה agarose ב 50 mL של ה-PBS סטרילי. מיקרוגל במרווחי זמן של 30-60 s עד התפרקה לחלוטין. מניחים באמבטיית מים 40 ° c כדי לשמור על הנוזל.
   הערה: ניתן לאחסן תוספת נוספת בטמפרטורת החדר (RT) ומומסת לניסויים בתרבות הפרוסה העתידית.
4. כוונן את הרטט: הצב להב חדש על הרטט. בדוק הגדרות: עובי 400-450 μm. Pre-לצנן את השלב הרטט. . שים קצת קרח בתא החיצוני השתמש בחדר ובבמה המוקדש לפרוסות חיות. אין להשתמש באותו חדר הרטט לרקמות קבועות כמו תיקון שיורית יכול להזיק לפרוסות.
5. הכינו את מיקרוסקופ שלב החממה העליון כדי 37 ° צ' ו 5% CO₂.
6. היכונו לחיתוך: מכשירי ניתוח נקיים וריסוס עם 70% אתנול. מלאו שתי צלחות פטרי עם HBSS, מקום על הקרח. פתחו לוחית 12 של תרבית רקמה והניחו את המכסה על הקרח כשפניו כלפי מעלה. פתח 6 היטב התרבות רקמה לוחית והמקום מוסיף ממברנה התרבות תאים ו 1.5 mL מדיה תרבות התא בכל באר. מחמם את הצלחת מראש ב-37 ° c ו-5% חממה₂ .

3. קצירת E 10.5 עוברים והכנת פרוסות

הערה: יש לבצע את כל השלבים מנקודה זו במהירות האפשרית. שמור על העוברים. על הקרח כל הזמן

1. המתת חסד הסכר ההרה (E 10.5) בחדר CO₂ . . בצע פריקה בצוואר הרחם
2. רסס את הבטן עם 70% אתנול. חותכים את הבטן עם מספריים, להסיר את הרחם ולמקם אותו צלחת פטרי עם HBSS קר קרח כדי לשטוף במהירות דם. להעביר את הרחם שטף ל פטרי שני ממולא צלחת קרח קר HBSS.
3. תחת היקף מבתר, הסר את העוברים מקרן הרחם ומשקי השפיר הבודדים. מניחים את העוברים בצד התחתון של המכסה של 12 צלחת הבאר. . המשיכו לאכול
4. תחת היקף מבתר, השתמש בנייר סינון כדי להסיר כל נוזל המקיף כל עובר.
   הערה: עוברים תיצמד לנייר המסנן אם הוא נגע.
5. הטמע עוברים ב-agarose. יוצקים מומס נמס מעל כל עובר כדי לכסות אותו. . המשיכו לאכול ברגע שהאגקם התקשה, הפוך כל עובר ויוצקים תוספת נוספת בצד השני. . המשיכו לאכול
6. באמצעות ניתוח פלורסנט היקף, לקצץ את agarose סביב כל העובר כך שהוא יהיה מונחה כראוי כאשר מודבק לשלב הרטט. הגרעין האוקולאלי והאקסון המוקדמת. מגדילה את הפלורסנט יישר את העובר כך שהגרעין, האקטונים המגודלים והעין יוצרים קו, וחתוך את הצמח בלהב התער שנחתך במקביל לקו זה (העובר אל העובר, ראה איור 1א).
   הערה: זה יהיה הצד דבוק לשלב הרטט (העובר ימוקם על גבו, ראש הקרוב ביותר ללהב הרטט). קו בין הגרעין והעין האלקטרו-מ, צריך להיות מקביל ללהב הרטט.
7. מלאו את חדר הרטט עם מאגר פרוסה קר-קרח. הדבק את העובר לשלב הרטט, כך שהלהב יהיה מקביל לגרעין ולעיניים של האוקוליום. לאחר שהדבק הסופר יבש, יש לטבול את השלב הרטט, כך שהעובר מכוון אל הלהב.
8. פרוסה 400-450 יקרומטר פרוסות.  לאסוף כל פרוסה עם pipet העברה סטרילית. המקום לתוך מאגר חיתוך קר.
9. תחת היקף הניתוח, בחר את הפרוסה המכילה את הגרעינים והעיניים של מניע הפעולה. באמצעות pipet העברה סטרילית, למקם אותו על הוספת תרבות התא ב 6 צלחת הבאר. החזר את הצלחת לאינקובטור 37 ° c. לחלופין, יש אדם אחד שחותך ואחר מציב את הפרוסות. מזער את הזמן בין חיתוך והצבת החממה.
   הערה: יש לכוון פרוסות באופן שהזריחה המרבית הנפלטת מהגרעינים והאקטונים היא הקרובה ביותר למטרת המיקרוסקופ. במיקרוסקופ הפוך, יש להניח את הפרוסות על הקרום עם הגרעינים והאקונים הקרובים ביותר למטרה שמתחת לצלחת.
10. הסירו את השאריות משלב הרטט, הדבק את העובר הבא אל הבמה וחזור על שלבים 3.7-3.9 עד שכל העוברים היו פרוסים ומצופים.
11. הוסף מולקולה מעכבי או רקומביננטי של בחירה למדיה בכל באר כדי ליצור עקומת תגובה מינון.  דלל את הממס המתאים.
    הערה: אם נעשה שימוש ב-DMSO, השתמש רק ברמת תרבות הרקמה DMSO. לחילופין, חרוזים משחררי חלבונים יכולים להיות ממוקמים במיקומים ספציפיים על הפרוסה.
12. מניחים על המיקרוסקופ ב-37 ° c ו-5% שיתוף₂ .  הגדר את המיקרוסקופ לקחת ניגודיות שלב ותצלומי פלורסנט של כל פרוסה כל 30 דקות (או לעתים קרובות יותר אם הרצוי). פרוסות ניתן לשמור עבור 48-72 h.

תוצאות

תוצאות נורמליות: איור 1 מספק תרשים שרטוט של הניסוי. החל מוקדם ככל E 9.5 בעכבר, האקטונים הראשונים מתחילים לצאת מן הגרעין עושות²⁶. על ידי E 10.5, העצב מניע העיניים, אשר מכיל את הנוירונים חלוץ מוקדם, ניתן לראות את mesenchyme. יש שונות משמעותית בין עוברים ב-E 10.5 (אפילו בתוך אותה ה...

Discussion

זה הפרוטוקול הvivo לשעבר התרבות הפרוסה מספק יתרונות משמעותיים על הנחיית האקסון המסורתית שאומר²³. הגודל של כל גרעין המנוע הגולגולתית אינו גורם מגביל, ואין צורך בניתוח קשה. הסביבה האנדודוגני שדרכה לנסוע אקסונים מתוחזק, מתן אפשרות לשינוי של מסלול איתות אחד תוך שמירה על מסלולים אית...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-Well Tissue Culture Plate	Genesee Scientific	25-107
6-Well Tissue Culture Plate	Genesee Scientific	25-105
Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass)	VWR	14672-200
Fine Forceps	Fine Science Tools	11412-11
Fluorobrite DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1896701
Glucose (200 g/L)	Thermo Fisher Scientific	A2494001
Hank's Balanced Salt Solution (1X)	Thermo Fisher Scientific	14175-095
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11550H
HEPES Buffer Solution (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630106
L-Glutamine (250 nM)	Thermo Fisher Scientific	25030081
Loctite Superglue	Loctite
Low Melting Point Agarose	Thermo Fisher Scientific	16520050
Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um)	Millipore Sigma	PICM03050
Moria Mini Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-19
Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Petri Dish (100 x 15mm)	Genesee Scientific	32-107G
Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010049
Razor Blades	VWR	55411-050
Surgical Scissors - Blunt	Fine Science Tools	14000-12
Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF	Nikon
Vibratome (VT 1200S)	Leica	1491200S001
Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel)	Ted Pella, Inc.	121-6