La detección de 5-Hidroximetilcitosina en células madre neuronales y cerebros de ratones

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para detectar 5-hidroximetilcitosina en células y tejidos cerebrales, utilizando la tinción de inmunofluorescencia y métodos de adn-blot.

Resumen

Se han identificado múltiples modificaciones del ADN en el genoma de los mamíferos. De eso, 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina-mediada mecanismos epigenéticos se han estudiado intensamente. 5-hidroximetilcitosina muestra características dinámicas durante el desarrollo embrionario y postnatal del cerebro, desempeña una función reguladora en la expresión génica, y participa en múltiples trastornos neurológicos. Aquí, describimos los métodos detallados incluyendo la tinción de inmunofluorescencia y la mancha de puntos de ADN para detectar 5-hidroximetilcitosina en células cultivadas y tejidos cerebrales de ratón.

Introducción

Se ha demostrado que las modificaciones epigenéticas, incluidas la modificación del ADN, la modificación de la histona y la modificación del ARN, desempeñan funciones esenciales en diversos procesos biológicos y enfermedades^{1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7}. Durante mucho tiempo, la metilación del ADN (es decir, 5-metilcitosina (5-mC)) se ha visto como un marcador epigenético altamente estable y no puede modificarse más en el genoma. Recientemente, se ha encontrado que 5-mC podría ser oxidado a 5-hidroximetilcitosina(5-hmC) por TET (diez-once translocaciones) proteínas de la familia incluyendo TET1, TET2, y TET3^8,9. Otros estudios muestran que 5-hmC podría servir como un marcador estable y desempeñar funciones biológicas a través de la regulación de la expresión génica^4,10,11,12.

Las pruebas actuales indican que 5-hmC está altamente enriquecido en tejidos/células neuronales en relación con otros tipos de tejidos en mamíferos, y exhibe características dinámicas durante el desarrollo neuronal^13,14. En el sistema neuronal, las modificaciones epigenéticas mediadas por 5 hmC desempeñan un papel importante en la regulación de las células madre neuronales, la actividad neuronal, el aprendizaje y la memoria, y está implicada en múltiples trastornos neurológicos como el síndrome de Rett, el autismo, la enfermedad de Alzheimer enfermedad, enfermedad de Huntington, etc.^{2,13,15,16,17,18,19,20}.

Existen varios enfoques para detectar 5 hmC en células y tejidos^{14,21,22,23,24}. Aquí, describimos dos métodos para detectar la existencia de 5 hmC y cuantificar el nivel global de 5-hmC: la tinción de inmunofluorescencia y el ADN punto-blot. Estos dos métodos son convenientes y sensibles, y se han utilizado con éxito en estudios anteriores^{25,26,27,28,29,30}. Los pasos clave de estos dos métodos son la desnaturalización del ADN. Para la tinción de inmunofluorescencia de 5 hmC, se requiere el pretratamiento de muestras con 1 M HCl. Para la eliminación de puntos de 5 hmC, la desnaturalización del ADN se realiza con la solución NaOH. Estos dos métodos junto con la secuenciación de próxima generación son herramientas muy útiles para investigar la función de 5 hmC.

Protocolo

Todos los procedimientos animales han sido aprobados por el Comité de ética animal de la Universidad de Zhejiang.

1. La cultura de las células madre neuronales adultas y las neuronas

1. Aísle las células madre neurales adultas del antecebrade de un ratón macho adulto (8-10 semanas de edad) C57/BL6 como se describió anteriormente^31,32.
2. Cultivo de células madre neurales adultas en medio DMEM/F-12 que contiene 20 ng/mL FGF-2, 20 ng/mL EGF, 2% B27 suplemento, 1% antibiótico-antimicótico, y 2 mM L-glutamina en una incubadora de 5% CO₂ a 37 oC. Inducir la diferenciación de las células madre neurales adultas con ácido retinoico de 1 M y forskoline de 5 M durante 48 h como se describió anteriormente^31,32.
3. Aísle las neuronas del hipocampo embrionario 17 (E17) del ratón y el cultivo con un medio neurobasal que contenga de 0,25% de L-glutamina, 0,125% glutaMax y 2% suplemento de B27 en una incubadora de 5% de CO₂ a 37 oC como se describió anteriormente³³.

2. Perfusión transcardial del ratón

1. Preparar 10% hidrato cloral, 4% paraformaldehído (PFA) y solución salina tamponada fosfato (PBS) un día antes del experimento, y almacenar a 4 oC.
2. Anestetiza un ratón c57 BL/6J macho o hembra adulto con un 10% de hidrato cloral (50 mg/kg, i.p.), y asegúrate de que el animal sea profundamente anestesiado comprobando la reacción corporal. Fije cada extremidad con cinta adhesiva en una placa de plástico (en posición boca arriba).
3. Cortar la piel y luego el músculo con tijeras de cirugía. Abra la cavidad torácica con una tijera quirúrgica. Exponga el corazón y corte una pequeña parte de la aurícula derecha con una tijera quirúrgica fina.
4. Perfundie el ratón con una jeringa esterilizada desechable de 10 ml del ventrículo izquierdo con PBS frío (alrededor de 30 ml por ratón adulto).
5. Perfundie el ratón con 4% pfa (alrededor de 30 mL en 10 min por ratones adultos) hasta que esté rígido.
6. Abra el cráneo del ratón con fórceps óseos. Retire el cerebro y colóquelo en 5 ml de PFA al 4% en un tubo centrífugo de 15 ml para la post-fijación a 4 oC.
   NOTA: Limpie el área quirúrgica una vez finalizada la cirugía.
7. Al menos 24 h más tarde, transferir las muestras cerebrales en una solución de sacarosa del 30% para una deshidratación completa a 4 oC.

3. Seccionamiento cerebral

1. Incruste las muestras cerebrales en un compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT) en un recipiente pequeño, y enfríe a -20 oC durante al menos 1 h.
2. Secciona muestras cerebrales a un espesor de 20-40 m con un microtome de criostato.
3. Recoger secciones en PBS y almacenar a 4 oC.

4. Mancha de inmunofluorescencia

1. Recoge las secciones con las regiones cerebrales objetivo y colócalas en una placa de 24 pocillos con PBS. Para las células cultivadas en un cubreobjetos, vaya directamente al paso 4.2.
2. Lavar con PBS en la coctelera a temperatura ambiente durante 10 min. Repita esto dos veces más.
3. Retire el PBS y trátelo con 1 M HCl precalentado durante 30 min a 37 oC.
   NOTA: Preparar 1 M HCl añadiendo 1 ml de ácido clorhídrico (36-38%) en 10 ml de agua en una campana química. Precalentar 1 M HCl en la incubadora a 37oC.
4. Lave las muestras con PBS durante 5 min. Repita esto dos veces más.
5. Bloquear las muestras con PBS que contengan 3% de suero normal de cabra y 0,1% de Triton X-100 durante 1 h en la coctelera a temperatura ambiente.
6. Incubar secciones con anticuerpos primarios específicos durante la noche a 4 oC en la coctelera.
   NOTA: Utilice los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpos policlonales de conejo anti-5-hidroximetilcitosina (1:5.000), anticuerpo monoclonal de ratón anti-NeuN (1:500).
7. Saque las muestras e incubar a temperatura ambiente durante 1 h.
8. Lave las muestras con PBS durante 10 min. Repita esto dos veces más.
9. Incubar con anticuerpos secundarios correspondientes a los anticuerpos primarios a temperatura ambiente durante 1 h en la coctelera. Cubra la placa con aluminio.
   NOTA: Utilice los siguientes anticuerpos secundarios: Alexa Fluor 488 cabra anticonejo IgG (1:500), Alexa Fluor 568 cabra anti-ratón IgG (1:500). Núcleos de contrastaína con 4o-6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI).
10. Lave las muestras con PBS durante 10 minutos en la coctelera. Repite esto dos veces más.
11. Monte las secciones del cerebro en las diapositivas, agregue la cantidad adecuada de medio de montaje antidescoloro (alrededor de 100-150 l) y cubra con vidrio de cubierta premium. Selle con esmalte de uñas.
12. Tome imágenes con un microscopio de fluorescencia regular o confocal.

5. Aislamiento genómico del ADN

1. Eutanasia un ratón adulto C57 BL/6J (masculino o femenino) por luxación cervical y extirpa el cerebro.
2. Disecciona los tejidos del hipocampo, la corteza y el cerebelo en un plato refrigerado por hielo. Moler los tejidos con una trituradora de tejido en 1 ml de tampón de lisis de ADN y transferirlos a un tubo de microcentrífuga limpio. Añadir 250 g de proteinasa K por 600 ml de tampón de lisis. Para los pellets celulares, agregue directamente tampón de lisis, proteinasa K, y mezcle bien.
   NOTA: Preparar tampón de lisis de ADN: 5 mM EDTA, 0.2% SDS, 200 mM NaCl en 100 mM Tris-HCl, pH 8.5. Lavar y autoclave la trituradora de tejido antes del experimento.
3. El segundo día, añadir alrededor de 50 g de RNase A por muestra durante al menos 12 h a 37 oC.
4. Añadir un volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol isoamilo (25:24:1) y mezclar completamente.
5. Centrifugar a 20.817 x g durante 15 minutos y remover el sobrenadante en un nuevo tubo de microcentrífuga.
6. Añadir 600 l de cloroformo al sobrenadante para precipitar el ADN, y mezclar a fondo.
7. Centrifugar a 20.817 x g durante 15 minutos, y retirar el sobrenadante en otro tubo nuevo.
8. Añadir 500 l de isopropanol al sobrenadante, y mezclar bien.
9. Centrifugar a 20.817 x g durante 15 min, y retirar el sobrenadante por completo.
10. Lavar la precipitación con 1 ml de 70% de etanol, centrifugar a 20.817 x g durante 1 min, y retirar el sobrenadante por completo. Repita una vez.
11. Seque el pellet de ADN por completo.
12. Disolver el pellet de ADN con tampón Tris-HCl (pH 8.5) a la concentración adecuada.

6. Blot de puntos de ADN

1. Prepare las soluciones: 2 M NaOH, tampón Tris-HCl (pH 8.5), 6x citrato de sodio salino (SSC).
2. Haga la mezcla de muestra como Tabla 1.
3. Desnaturalice las muestras de ADN a 100 oC durante 10 minutos y enfríe en hielo.
4. Corte el tamaño adecuado de la membrana de nylon (por ejemplo, Hybond-N+) y enjuague con 6x SSC.
5. Coloque la membrana en el aparato de punto-blot y conéctela a la bomba de vacío. Detectar 6 l de mezcla por punto en la membrana.
6. Hibrida durante 30 min a 80oC y bloquea la membrana de la muestra con leche sin grasa en solución salina tamponada (TBS) durante 1 h.
7. Incubar con anticuerpo primario a 4oC durante la noche.
   NOTA: el siguiente anticuerpo primario: conejo policlonal anti-5-hidroximetilcitosina (1:5.000).
8. En el segundo día, incubar las membranas de la muestra a temperatura ambiente durante 1 h. Lavar con TBS durante 10 min. Repita este lavado dos veces más.
9. Incubar la membrana con anticuerpo secundario anticonejo (1:5.000) durante 30 min a temperatura ambiente.
10. Lavar con TBS durante 10 min. Repita este lavado dos veces más.
11. Visualice las señales de quimioluminiscencia y cuantifique las intensidades de la señal.

Resultados

Para revelar la distribución de 5 hmC en el hipocampo de ratones adultos, realizamos inmunofluorescencia con anticuerpos contra células neuronales (NeuN) y 5-hmC. En el hipocampo, 5-hmC co-localizado bien con marcador de células neuronales NeuN (Figura 1A-H), lo que sugiere un enriquecimiento de 5-hmC en las neuronas.

Para determinar la dinámica de 5 hmC durante el desarrollo neuronal, primero se realizó un punto-blot con muestras de ADN aisl...

Discusión

Las modificaciones epigenéticas desempeñan un papel esencial durante el desarrollo cerebral, la maduración y la función. Como marcador estable para la modificación del ADN, la dinámica de 5 hmC responde a la adaptación conductual, la actividad neuronal y está correlacionada positivamente con la expresión génica; por lo tanto, está involucrado en la función normal del cerebro y el trastorno neurológico⁴. Para explorar su función en células y tejidos, es necesario detectar la existenc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )	Sigma-Aldrich	D8417
Adobe Photoshop software	Adobe Inc.	/
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher	A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher	A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine	Active Motif	39769
anti-NeuN	Millipore	MAB377
B27 supplement	Gibco	12587-010
B27 supplement	Gibco	12580-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
Cryostat microtome	Leica	CM1950
DMEM/F-12 medium	OmegaScientific	DM25
Epidermal growth factor	PeproTech	100-15
Fibroblast growth factor-basic	PeproTech	100-18B
Forskolin	Sigma-Aldrich	F6886
GlutaMax	Thermo	35050061
L-Glutamine	Gibco	25030-149
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Normal goat serum	Vector Laboratories	Z0325
Nylon membrane (Hybond™-N+ )	Amersham Biosciences	RPN303B
OCT	Leica	14020108926
Pen Strep	Gibco	15140-122
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )	Sigma-Aldrich	516726
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899-10
Proteinase K	VVR	39450-01-6
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Triton X-100	Solarbio	T8210