Обнаружение 5-гидроксиметилцитозин в нейронных стволовых клетках и мозгах мышей

Здесь мы представляем протокол для обнаружения 5-гидроксиметилцитозина в клетках и тканях мозга, используя иммунофлуоресцентное окрашивание и методы точечной пятна ДНК.

Аннотация

В геноме млекопитающих были выявлены множественные модификации ДНК. Из них интенсивно изучены 5-метилцитозин и 5-гидроксиметилцитозин-опосредованные эпигенетические механизмы. 5-гидроксиметилцитозин отображает динамические особенности во время эмбрионального и послеродового развития мозга, играет регулятивную функцию в экспрессии генов и участвует в множественных неврологических расстройствах. Здесь мы описываем подробные методы, включая иммунофлуоресцентное окрашивание и днк-пятна для обнаружения 5-гидроксиметилцитозина в культивированных клетках и тканях мозга мыши.

Введение

Эпигенетические модификации, включая модификацию ДНК, модификацию гистона и модификацию РНК, как было показано, играют важную роль в различных биологических процессах и заболеваниях^1,^2,³^, ⁴ ^, ⁵ ^, ⁶ ^, ⁷. Долгое время метилирование ДНК (т.е. 5-метилцитозина (5-мС)) рассматривалось как высокостабильный эпигенетический маркер и не может быть дополнительно изменено в геноме. Недавно было установлено, что 5-mC может быть окислен до 5-гидроксиметилцитозина (5-хмС) TET (Десять-одиннадцать транслокаций) семейных белков, включая TET1, TET2, и TET3⁸^,⁹. Дальнейшие исследования показывают, что 5-hmC может служить стабильным маркером и играть биологические роли путем регулирования экспрессии генов⁴^,¹⁰^,¹¹^,¹².

Настоящие данные свидетельствуют о том, что 5-хмС высоко обогащен нейронными тканями/клетками по сравнению с другими типами тканей у млекопитающих, и обладает динамическими особенностями во время развития нейронов¹³^,¹⁴. В нейрональной системе, 5-hmC опосредованные эпигенетические модификации играют важную роль в регулировании нервных стволовых клеток, нейронной активности, обучения и памяти, и участвует в нескольких неврологических расстройств, включая синдром Ретт, аутизм, болезнь Альцгеймера болезни, болезнь Гентингтона и др.^2,^13,^15,^16,^17,^18,¹⁹^,²⁰.

Существует несколько подходов к обнаружению 5-хмВ в клетках и тканях^14,^21,^22,^23,^24. Здесь мы описываем два метода обнаружения существования 5-хмИ и количественной оценки глобального уровня 5-хмС: иммунофлуоресцентное окрашивание и точечная поместья ДНК. Эти два метода удобны и чувствительны, и были успешно использованы в предыдущих исследованиях^25,^26,^27,^28,²⁹^,³⁰. Ключевыми шагами этих двух методов являются денатурация ДНК. Для окрашивания иммунофлюоресценции 5-хмС требуется предварительная обработка образцов с 1 М ЛК. Для 5-хмC точечной блохины, денатурация ДНК выполняется с раствором NaOH. Эти два метода вместе с секвенированием следующего поколения являются очень полезными инструментами для исследования функции 5-hmC.

протокол

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по этике животных Университета Чжэцзян.

1. Культура взрослых нейронных стволовых клеток и нейронов

Изолировать взрослых нейронных стволовых клеток из передний мозг взрослого (8-10 недель) C57/BL6 мужской мыши, как описано ранее³¹^,³².
Культура взрослых нервных стволовых клеток в DMEM/F-12 среды, содержащей 20 нг/мЛ FGF-2, 20 нг/мЛ EGF, 2% B27 дополнения, 1% антибиотик-антимикотические, и 2 мМ L-глютамин в 5% CO₂ инкубатор при 37 градусах Цельсия. Побудить дифференциацию взрослых нервных стволовых клеток с 1 ММ ретинойной кислоты и 5 мкм форсколин для 48 ч, как описано ранее³¹^,³².
Изолировать нейроны из эмбрионального дня 17 (E17) гиппокампов мыши и культуры с нейробазальной среды, содержащей 0,25% L-глютамин, 0,125% GlutaMax и 2% B27 дополнения в 5% CO₂ инкубатора на 37 градусов по Цельсию, как ранее описано³³.

2. Транскардиация Перфузия мыши

Приготовьте 10% хлорного гидрата, 4% параформальдегида (PFA) и фосфата буферного солей (PBS) за день до эксперимента, и храните при 4 градусах Цельсия.
Анестезия взрослого мужчины или женщины C57 BL/6J мыши с 10% хлорного гидрата (50 мг/кг, т.п.), и убедитесь, что животное глубоко обезболивается, проверяя реакцию организма. Исправьте каждую конечность липкой лентой на пластиковой доске (в положении лицом вверх).
Вырезать кожу, а затем мышцы с хирургией ножницы. Откройте грудную полость хирургическим ножницами. Выставить сердце и отрезать небольшую часть правого предсердия тонкими хирургическими ножницами.
Пронизыруйте мышь одноразовым стерилизованный шприц из левого желудочка с холодным PBS (около 30 мл на взрослую мышь).
Perfuse мыши с 4% PFA (около 30 мл в 10 минут на взрослых мышей), пока она не является жесткой.
Откройте череп мыши костными щипками. Удалить мозг и положить в 5 мл 4% PFA в 15 мл центрифуги трубки для пост-фиксации при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очистите хирургическую область после завершения операции.
По крайней мере 24 ч позже, передать образцы мозга в 30% сахарозы решение для полного обезвоживания при 4 градусах Цельсия.

3. Секция мозга

Встраивай образец ы головного мозга в оптимальное режущее температурное соединение (OCT) в небольшой контейнер и остыть при температуре -20 градусов по Цельсию, по крайней мере, 1 ч.
Сечение образцов мозга толщиной 20-40 мкм с криостатом микротомом.
Сбор разделов в PBS и хранить при 4 градусах Цельсия.

4. Иммунофлуоресценция окрашивание

Возьмите разделы с целевыми областями мозга и положить их в 24-колодец пластины с PBS. Для культивированных клеток на крышке, перейдите непосредственно к шагу 4.2.
Вымойте pbS на шейкере при комнатной температуре в течение 10 минут. Повторите это еще дважды.
Удалить PBS, и лечить с разогретым 1 M HCl в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте 1 m HCl, добавив 1 мл соляной кислоты (36-38%) в 10 мл воды в химическом капоте. Разогреть 1 M HCl в инкубаторе при температуре 37 градусов по Цельсию.
Вымойте образцы с PBS в течение 5 мин. Повторите это в два раза больше.
Блок образцы с PBS, содержащие 3% нормальной сыворотки козы и 0,1% Тритон X-100 на 1 ч на шейкер при комнатной температуре.
Инкубировать секции с конкретными первичными антителами на ночь при 4 градусах по шейкеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующие первичные антитела: поликлональные антитела кролика анти-5-гидроксиметилцитозин (1:5,000), мышь моноклонального антитела анти-NeuN (1:500).
Выняйте образцы и далее инкубировать при комнатной температуре на 1 ч.
Вымойте образцы с PBS в течение 10 мин. Повторите это в два раза больше.
Инкубировать вторичными антителами, соответствующими первичным антителам при комнатной температуре в течение 1 ч на шейкере. Накройте тарелку алюминием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующие вторичные антитела: Alexa Fluor 488 коза анти-кролик IgG (1:500), Alexa Fluor 568 коза анти-мышь IgG (1:500). Противостойные ядра с 4'-6-диамидино-2-фенилинол (DAPI).
Вымойте образцы с PBS в течение 10 минут на шейкере. Повторите это еще дважды.
Смонтировать участки мозга на слайды, добавить надлежащее количество антифадейн монтажа среды (около 100-150 л), и накрыть премиум крышкой стекла. Печать с лаком для ногтей.
Возьмите изображения с помощью регулярного или конфокального флуоресцентного микроскопа.

5. Геномная изоляция ДНК

Эвтаназия взрослых C57 BL/6J мыши (мужчины или женщины) путем вывиха шейки матки и удалить мозг.
Рассекать гиппокамп, коры головного мозга и мозжечка ткани на ледяное охлаждение блюдо. Измельчить ткани с помощью тробиотли в 1 мл буфера лиза ДНК и перенести в чистую микроцентрифугную трубку. Добавьте 250 мкг протеиназа K на 600 л люсисбуфера. Для клеточных гранул, непосредственно добавить буфер лисиса, протеиназа K, и тщательно перемешать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка днк-лисис буфера: 5 мМ EDTA, 0,2% SDS, 200 мМ NaCl в 100 мм Tris-HCl, рН 8,5. Вымойте и автоклавировать мясорубку ткани перед экспериментом.
На второй день, добавить около 50 мкг RNase A в образец, по крайней мере 12 ч при 37 градусов по Цельсию.
Добавьте равный объем фенола: хлороформ: изоамил овый спирт (25:24:1) и полностью перемешайте.
Центрифуга на 20817 х г в течение 15 минут, и удалить супернатант в новую микроцентрифугую трубку.
Добавьте 600 л хлороформа в супернатант, чтобы выровнять ДНК, и тщательно перемешать.
Центрифуга на 20817 х г в течение 15 минут, и удалить супернатант в другую новую трубку.
Добавьте 500 зл изопропанола в супернатант и тщательно перемешайте.
Центрифуга на 20817 х г в течение 15 минут, и удалить супернатант полностью.
Вымойте осадки с 1 мл 70% этанола, центрифуга на 20817 х г в течение 1 мин, и удалить супернатант полностью. Повторите один раз.
Высушите гранулы ДНК полностью.
Растворите гранулы ДНК с буфером Tris-HCl (pH 8.5) до надлежащей концентрации.

6. ДНК Точка пятно

Подготовьте решения: 2 M NaOH, буфер Tris-HCl (pH 8.5), 6x соленовый цитрат натрия (SSC).
Сделать образец смеси в виде таблицы 1.
Денатурная днк образцов при 100 градусах по Цельсию в течение 10 минут, и остыть на льду.
Вырезать надлежащий размер нейлоновой мембраны (например, Hybond-N) и промыть 6x SSC.
Положите мембрану на точечный аппарат и подключитесь к вакуумным насосом. Намперся на мембране 6 л смеси на одну точку.
Гибридизируйте в течение 30 мин при 80 градусах Цельсия и заблокируйте образец мембраны обезжиренным молоком в солине Tris-буферизированном (TBS) в течение 1 ч.
Инкубировать с первичными антителами при 4 градусах Цельсия на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: следующие первичные антитела: поликлональный кролик анти-5-гидроксиметилцитозин (1:5,000).
На второй день инкубировать образец мембран при комнатной температуре 1 ч. Промойте TBS в течение 10 мин. Повторите эту стирку еще дважды.
Инкубировать мембрану с анти-кроличьи вторичные антитела (1:5,000) в течение 30 минут при комнатной температуре.
Вымойте TBS в течение 10 мин. Повторите эту стирку в два раза больше.
Визуализируйте сигналы хемилюминесценции и количественно очислите интенсивность сигнала.

Результаты

Чтобы выявить распределение 5-хмВ в гиппокампе взрослых мышей, мы выполнили иммунофлуоресценцию с антителами против нейрональных клеток (NeuN) и 5-hmC. В гиппокампе, 5-hmC совместно локализованы хорошо с нейрональной клеточной маркерной нейН(Рисунок 1A-H), предлагая об?...

Обсуждение

Эпигенетические модификации играют важную роль при развитии мозга, созревании и функции. Как стабильный маркер для модификации ДНК, динамический 5-hmC реагирует на поведенческую адаптацию, нейронную активность, и положительно коррелирует с экспрессией генов; Таким образом, он участвует...

Раскрытие информации

Конкурирующих финансовых интересов не существует.

Благодарности

XL была частично поддержана Национальной программой исследований и разбивки ключей Китая (2017YFE0196600) и Национальным фондом естественных наук Китая (Grant No s. 31771395, 31571518). З.С. была поддержана Национальной программой исследований и развития ключевых стран Китая (2017YFC1001703) и Ключевой программой исследований и разработок провинции Чжэцзян (2017C03009). W.X. была поддержана Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (LY18H020002) и Отделом науки провинции Чжэцзян (2017C37057).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI )	Sigma-Aldrich	D8417
Adobe Photoshop software	Adobe Inc.	/
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG	Thermo Fisher	A11008
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG	Thermo Fisher	A11001
anti-5-hydroxymethylcytosine	Active Motif	39769
anti-NeuN	Millipore	MAB377
B27 supplement	Gibco	12587-010
B27 supplement	Gibco	12580-010
B27 supplement	Gibco	17504-044
Cryostat microtome	Leica	CM1950
DMEM/F-12 medium	OmegaScientific	DM25
Epidermal growth factor	PeproTech	100-15
Fibroblast growth factor-basic	PeproTech	100-18B
Forskolin	Sigma-Aldrich	F6886
GlutaMax	Thermo	35050061
L-Glutamine	Gibco	25030-149
Neurobasal medium	Gibco	21103-049
Normal goat serum	Vector Laboratories	Z0325
Nylon membrane (Hybond™-N+ )	Amersham Biosciences	RPN303B
OCT	Leica	14020108926
Pen Strep	Gibco	15140-122
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 )	Sigma-Aldrich	516726
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899-10
Proteinase K	VVR	39450-01-6
Retinoic acid	Sigma-Aldrich	R2625
Triton X-100	Solarbio	T8210