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Method Article
ここでは、細胞および脳組織中の5-ヒドロキシメチルシトシンを検出するプロトコルを提示し、免疫蛍光染色およびDNAドットブロット法を利用する。
哺乳類ゲノムでは複数のDNA修飾が同定されている。そのうち、5-メチルサイトシンおよび5-ヒドロキシメチルシトシン媒介エピジェネティックメカニズムが集中的に研究されている。5-ヒドロキシメチルシトシンは、脳の胚および出生後の発達中に動的特徴を示し、遺伝子発現の調節機能を果たし、複数の神経障害に関与している。ここでは、マウスの培養細胞および脳組織における5-ヒドロキシメチルシトシンを検出する免疫蛍光染色およびDNAドットブロットを含む詳細な方法について説明する。
DNA修飾、ヒストン修飾およびRNA修飾を含むエピジェネティック修飾は、多様な生物学的プロセスおよび疾患1、2、3において重要な機能を果たすることが示されている。4,5,6,7.長い間、DNAメチル化(すなわち、5-メチルサイトシン(5-mC))は、非常に安定なエピジェネティックマーカーと見なされており、ゲノム内で更に改変することはできません。最近では、TET1、TET2、TET38、9を含むTET(11-11転座)ファミリータンパク質により、5-ヒドロキシメチルシトシン(5-hmC)に5-mCを酸化することができることが分かっています。さらなる研究は、5-hmCが安定したマーカーとして機能し、遺伝子発現4、10、11、12を調節することにより生物学的役割を果たすことができることを示しています。
本示の証拠は、5-hmCが哺乳動物の他のタイプの組織に対して神経組織/細胞において非常に濃縮され、神経発達13、14の間に動的特徴を示すことを示している。神経系では、5hmC媒介エピジェネティック修飾は、神経幹細胞、神経活動、学習および記憶を調節する上で重要な役割を果たし、レット症候群、自閉症、アルツハイマー病を含む複数の神経疾患に関与している。病気、ハンチントン病等 2,13,15,16,17,18,19,20.
細胞および組織の5-hmCを検出するためのいくつかのアプローチがあります14,21,22,23,24.ここでは、5hmCの存在を検出し、5-hmCのグローバルレベルを定量化する2つの方法について述べています:免疫蛍光染色とDNAドットブロット。これらの2つの方法は便利で敏感であり、以前の研究25、26、27、28、29、30で正常に使用されている。これら2つの方法の重要なステップは、DNAの脱彩化です。5-hmCの免疫蛍光染色のためには、1M HClを有する試料の前処理が必要である。5hmCドットブロットの場合、DNAの退化はNaOH溶液で行われます。これらの2つの方法と次世代シーケンシングは、5-hmCの機能を調るための非常に有用なツールです。
すべての動物の手順は浙江大学の動物倫理委員会によって承認されています。
1. 成人神経幹細胞とニューロンの培養
2. マウスの心筋灌流
3. 脳の切除
4. 免疫蛍光染色
5. ゲノムDNA分離
6. DNAドットブロット
成体マウスの海馬における5hmCの分布を明らかにするために、神経細胞(NeuN)および5-hmCに対する抗体を用いて免疫蛍光を行った。海馬では、5-hmCがニューロン細胞マーカーNeuN(図1A-H)とうまく共局在し、ニューロン中の5-hmCの濃縮を示唆した。
神経発達中の5hmCのダイナミクスを決定するために、ドットブロットは、増殖および分化した成人...
エピジェネティック修飾は、脳の発達、成熟、および機能の間に重要な役割を果たします。DNA修飾の安定したマーカーとして、動的5-hmCは行動適応、神経活性に応答し、遺伝子発現と正の相関関係がある。したがって、脳および神経障害4の正常な機能に関与している。細胞や組織におけるその機能を探索するには、5-hmCの存在を検出し、治療前と治療後のレベルを比較する?...
競合する金銭的利益は存在しません。
XLは、中国国家主要研究開発プログラム(2017YFE0196600)と中国国家自然科学財団(助成第31771395号、31571518)によって一部支援されました。Q.S.は、中国国家主要研究開発プログラム(2017YFC1001703)と浙江省の主要研究開発プログラム(2017C03009)の支援を受けました。W.X.は浙江省自然科学財団(LY18H020002)と浙江省科学技術部(2017C37057)の支援を受けた。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ) | Sigma-Aldrich | D8417 | |
Adobe Photoshop software | Adobe Inc. | / | |
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A11008 | |
Alexa Fluor 568 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A11001 | |
anti-5-hydroxymethylcytosine | Active Motif | 39769 | |
anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
B27 supplement | Gibco | 12587-010 | |
B27 supplement | Gibco | 12580-010 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Cryostat microtome | Leica | CM1950 | |
DMEM/F-12 medium | OmegaScientific | DM25 | |
Epidermal growth factor | PeproTech | 100-15 | |
Fibroblast growth factor-basic | PeproTech | 100-18B | |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
GlutaMax | Thermo | 35050061 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030-149 | |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
Normal goat serum | Vector Laboratories | Z0325 | |
Nylon membrane (Hybond™-N+ ) | Amersham Biosciences | RPN303B | |
OCT | Leica | 14020108926 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24:1 ) | Sigma-Aldrich | 516726 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P0899-10 | |
Proteinase K | VVR | 39450-01-6 | |
Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
Triton X-100 | Solarbio | T8210 |
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